抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法

摘要

一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，是以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比为1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，纯度达到90％以上，辅以银杏黄酮和萜内酯，制备的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝药物开发。

权利要求

1.一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，其特征在于由以下步骤组成：第一步、聚戊烯醇类化合物粗品的脱色

以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，按固液比g/mL为1∶1～1∶30溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比为1∶1～1∶20，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为10∶100～150∶100，在50～120℃下搅拌脱色10～80min，过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；

第二步、柱纯化

将脱色聚戊烯醇与硅胶按质量比1∶15～1∶50吸附，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶1～100∶30混合溶剂，硅胶柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为0.3～

3MPa，检测波长199～220nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；

第三步、制备抗乙肝病毒制剂

基于100g原料中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g银杏黄酮、2～6g银杏萜内酯、

15～20g植物油、3～5g日本木蜡、5～10g卵磷脂、0.5～3g VE、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇活性组合物。

2.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，其特征在于第一步中银杏叶脂溶物来源于银杏叶，经非极性溶剂浸提，皂化，萃取工艺处理，得到聚戊烯醇含量低于40％的软膏。

3.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，其特征在于第三步中银杏叶黄酮和萜内酯来源于银杏叶提取物，其中银杏黄酮＞24％，萜内酯＞6％，银杏酚酸＜1ppm。

4.根据权利要求1所述的一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物，其特征在于用所述的聚戊烯醇活性组合物制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂。

说明书

抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，尤其涉及银杏聚戊烯醇、黄酮和萜内酯组合物对HepG 2215细胞分泌HBV DNA的抑制作用，可用于治疗和辅助治疗乙型肝炎的药物。

背景技术

[0002] 据世界卫生组织的统计，目前，全球约有3.5亿人为慢性肝炎患者或为无症状病毒感染者。这些慢性肝炎的病人有转为肝硬化、肝癌的高危险性，每年有100多万人死于和肝炎、肝硬化及肝癌有关的疾病。

[0003] 我国是病毒性肝炎的高发区，乙型肝炎病毒携带者有1.2亿人，丙型肝炎病毒携带者0.38亿人，加上其他类型的肝炎，罹患肝炎的总人数近2亿人，估计每年因病毒性肝炎导致直接经济损失300亿～500亿人民币。尤其是脂肪肝人群日益增多，而脂肪肝变性是慢性丙肝病毒感染者罹患肝细胞癌的危险因子。

[0004] 目前，用于治疗肝脏疾病的药物有三类：1)抗病毒药主要有干扰素和核苷类似物，如拉米夫定、法昔洛韦等；2)免疫调节药主要有转移因子、白细胞介素-2、胸腺肽、皮质激素等；3)改善肝功能药或抗肝细胞损伤药主要有易善力(肝得健)和各种中药复方制剂。

[0005] 国内外已有研究表明，聚戊烯醇参与细胞膜N-糖蛋白生物合成，对保持细胞膜稳定性和流动性具有重要作用。聚戊烯醇系天然产物，无毒副作用，具有免疫调节功能，促进肝细胞保护和再生，适于开发保肝药物。聚戊烯醇还可和干扰素共用，或代替干扰素治疗肝炎病毒。因为干扰素价格贵，因此利用聚戊烯醇开发保肝药物具有很好的市场竞争力。

[0006] 国内外对于植物聚戊烯醇的分离、纯化已有文献报道，主要纯化路线是通过几次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物的纯度提高到90％以上。此外，还有一些其他纯化方法，如采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，得到70％～75％的聚戊烯醇，得率1.0％左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷冻脱杂后再进行硅胶柱层析纯化，制备纯度92.7％聚戊烯醇。但产品中仍含有大量的类胡萝卜素等黄色素，Tetsuo Takigawa等曾采用活性炭一种脱色剂对聚戊烯醇粗提物脱色，但活性炭用量大，脱色效果差，聚戊烯醇损失大。因此，传统的聚戊烯醇纯化路线存在明显缺点：繁琐、成本高、收率低，不适合工业化生产。

[0007] 国内外有关专利报道了聚戊烯醇对肝疾病的保护作用，银杏提取物主要活性成分为黄酮和萜内酯，广泛用于治疗和预防心脑血管疾病，本专利以聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，对聚戊烯醇粗品脱色。脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，即获得90％以上聚戊烯醇，辅以银杏黄酮和萜内酯，制备银杏叶聚戊烯醇活性组合物，具有抗乙肝病毒的作用，可用于抗乙肝药物开发。该方法与以往纯化方法相比，具有收率高、方便、经济、适合工业化生产等优点。

发明内容

[0008] 为实现上述目的，发明了一种抗乙肝病毒的银杏叶聚戊烯醇活性组合物及其制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

[0009] 第一步、聚戊烯醇类化合物粗品的脱色

[0010] 以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1∶(1～20)作为脱色剂，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；

[0011] 第二步、柱纯化

[0012] 将脱色聚戊烯醇与硅胶按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂，硅胶柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为0.3～3MPa，检测波长199～220nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；

[0013] 第三步、制备抗乙肝病毒制剂

[0014] 基于100g原料中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g银杏黄酮、2～6g银杏萜内酯、15～20g植物油、3～5g日本木蜡、5～10g卵磷脂、0.5～3gVE、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去离子水。在室温下超声波乳化10～30min，
4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇活性组合物制剂。

[0015] 本专利以银杏叶为原料，通过非极性溶剂提取银杏叶聚戊烯醇乙酸酯，再通过皂化水解，将聚戊烯醇乙酸酯转化为聚戊烯醇，同时将浸膏中酸性物以及其他酯类转变为水溶性的盐，聚戊烯醇仍溶解在非极性溶剂中，从而达到分离。皂化均化方式、皂化温度、时间和皂化剂对皂化反应有明显影响，优化结果表明均化方式为磁力搅拌，转速50～300r/min，温度55～65℃，时间45～50min，皂化剂为5％～40％NaOH-EtOH，石油醚软膏与皂化剂的比例为1∶(5～10)(g/mL)。

[0016] 皂化后的银杏叶聚戊烯醇软膏为脂溶性不皂化物，按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇。

[0017] 本专利筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸棒土、混合脱色剂等脱色剂，优化脱色工艺。首次公开一种分光光度法，在451nm比色测定聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率＝[(A0-A1)/A0]×100％，式中：A0-聚戊烯醇脱色前的吸光度；A1-聚戊烯醇脱色后的吸光度。设定原料中色素含量为y0，脱色一次，结果表明活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂的脱色效果最好。较未脱色聚戊烯醇相比，脱色色度降低200倍以上。如表1和图1。

[0018] 表1不同脱色剂对GPP的脱色效果

[0019]

[0020] 本专利采用L9(34)正交试验确定最佳脱色条件，将聚戊烯醇软膏按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，优选1∶(6～10)；混合脱色剂活性炭与凹凸棒土质量比为1∶(3～8)，优选1∶(5～6)；聚戊烯醇软膏与脱色剂用量质量比为(1～5)∶(1～5)，优选(1～5)∶(1～2)；脱色温度50～120℃，优选50～80℃；脱色时间20～50min。
过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇，脱色率大于96％，较未脱色聚戊烯醇相比，脱色后色度降低200倍以上。本发明不仅脱色效果好，而且采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂。如，10g纯度38％的聚戊烯醇粗品溶于100mL石油醚，脱色剂用量10～15g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70～80℃，脱色时间20～
30min。经过脱色，纯度提高到50％，聚戊烯醇基本无损失。

[0021] 为了制备90％以上无色的聚戊烯醇，本专利采用中压正相柱纯化，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，填料选择200～500目的硅胶，流速2～200mL/min，将聚戊烯醇粗制品与硅胶按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～
30)混合溶剂，优选石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～10)；中压柱填料采用干法装柱，N2加压，柱压为0.3～3MPa，紫外检测波长199～230nm，优选210nm，流速2～200mL/min，优选
5～20mL/min，根据UV吸收峰值富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上无色的聚戊烯醇。

[0022] 采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱层析，将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，最终收率7.4％。采用本发明的中压柱纯化，聚戊烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，收率30％。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。

[0023] 本专利公开HPLC外标法测定聚戊烯醇的纯度。通过HPLC分析，绘制标准曲线，测定聚戊烯醇的纯度。色谱柱为Kromasil C18 ODS-1(5μm，150×4.6mm)，柱温为室温，紫外检测波长210nm，流动相为异丙醇∶甲醇＝38∶37，流速为1.0mL/min。

[0024] 本发明以无色的聚戊烯醇为原料，基于100g原料中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g银杏黄酮、2～6g银杏萜内酯、15～20g植物油、3～5g日本木蜡、5～10g卵磷脂、0.5～3gVE、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去离子水。在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成的聚戊烯醇活性组合物可制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂。

[0025] 本专利中银杏叶黄酮和萜内酯来源于银杏叶提取物，其中银杏黄酮＞24％，萜内酯＞6％，银杏酚酸＜1ppm。而国际上标准银杏叶提取物中银杏黄酮＞24％，萜内酯＞6％，银杏酚酸＜5ppm，因此本发明中银杏酸的含量更少，对人体更有利。通过本专利制备的聚戊烯醇活性组合物可制备胶囊，口服液，滴丸，乳液和注射剂，用于治疗乙肝病毒药物的应用，对细胞毒性较弱，实验中未见到细胞形态异常及细胞破碎等毒性变化。在浓度最高到100μM时，对细胞生长没有抑制作用，与阳性药3TC效果相当，对HepG 2215细胞分泌乙肝s抗原、e抗原具有明显的抑制作用，对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用。

[0026] 本发明获得以下技术效果：

[0027] (1)首次将银杏叶聚戊烯醇、黄酮和萜内酯活性物按功效作用组成复合制剂，应用于抗乙肝HBV DNA病毒，与阳性药3TC效果相当，对HepG 2215细胞分泌乙肝s抗原、e抗原具有明显的抑制作用，对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用，其效果比单一组方提高50％，相对于化药，具有明显的减毒增效的作用。

[0028] (2)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂脱色，较未脱色聚戊烯醇相比，脱色后色度降低200倍以上，脱色率大于96％，制备的无色聚戊烯醇可用于医药注射剂，并且凹凸棒土价格低廉，脱色装置设备易于实现，脱色条件容易控制，适合工业化生产。

[0029] (3)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂，经过脱色，聚戊烯醇纯度提高到50％，聚戊烯醇基本无损失。而以往任何聚戊烯醇的纯化工艺都会伴随聚戊烯醇的损失。

[0030] (4)采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱层析，将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，最终收率7.4％。采用本发明的中压柱纯化，聚戊烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，收率30％。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。

附图说明

[0031] 图1冷冻脱色后聚戊烯醇的HPLC图

[0032] 图2C95polyprenol标准曲线图

[0033] 图3GP-1对HepG 2215分泌的HBV DNA的抑制作用

具体实施方式

[0034] 以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

[0035] 实施例1聚戊烯醇的HPLC方法

[0036] 本实施通过HPLC分析，色谱柱为Kromasil C18 ODS-1(5μm，150×4.6mm)，柱温为室温，紫外检测波长210nm，流动相为异丙醇∶甲醇＝38∶37，流速为1.0mL/min。以C95polyprenol为标准对照品，纯度98％(瑞典Larodan Fine Chemiclals公司提供)。

[0037] (1)标准对照品溶液的配制

[0038] 用分析天平准确称取聚戊烯醇标准对照品(C95 polyprenol)4.0mg，用正己烷溶解，定容到10mL，配制的标准液浓度为0.40mg/mL。

[0039] (2)标准对照品曲线的绘制

[0040] 用微量注射器分别吸取聚戊烯醇标准对照品溶液(0.4mg/mL)1μL、2μL、3μL、4μL和5μL，按上述色谱条件进样，各重复三次，测定相应的峰面积，绘制标准曲线，线性方程Y＝1.5751x+1.1546。根据HPLC标准曲线，同样条件下测定样品中聚戊烯醇的纯度。
如图2。

[0041] (3)样品的处理

[0042] 精密称取银杏叶聚戊烯醇样品10mg，用正己烷溶解，定容到10mL，为HPLC供试样品。取配制好的供试样品，按上述色谱条件进样，进样量为5μL，测定聚戊烯醇的含量。

[0043] (4)精密度试验

[0044] 取银杏叶聚戊烯醇(批号为090420T)样品，按上述拟定的方法测定聚戊烯醇的含量，其结果如下：

[0045]序号 1 2 3 4 5 平均值(％) RDS(％)
聚戊烯醇含量(％) 66.5 65.8 64.4 64.7 65.1 65.3 1.3％[0046] (5)加样回收率试验

[0047] 分别精确称取已知含量的银杏叶聚戊烯醇样品(批号：090420T，聚戊烯醇含量65.3％)5.0mg，置于锥形瓶中，各精密加入聚戊烯醇标准对照品溶液(每1mL溶液含0.10mg聚戊烯醇标准品)1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，按样品含量测定方法处理分析，计算加样回收率，其结果如下：

[0048]

[0049] (6)稳定性试验

[0050] 精确称取已知含量的银杏叶聚戊烯醇样品(批号：090420T，聚戊烯醇含量65.3％)5.0mg，用正己烷溶解，定容到10mL，为HPLC供试样品。分别于0、2、4、6、8、10、12h进样，测定样品的峰面积，计算，RSD＝1.06％(n＝7)。

[0051]

[0052] 实施例290％银杏叶聚戊烯醇制备方法

[0053] 以聚戊烯醇含量低于40％的银杏叶脂溶物为原料，按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，质量比1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇。将脱色聚戊烯醇与硅胶按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂，硅胶柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压0.3～3MPa，检测波长199～220nm，流速2～
200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇。

[0054] 实施例3聚戊烯醇的中压硅胶柱纯化方法

[0055] 取25％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物20g，加入250mL正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶3∶89的混合溶剂中，-30℃冷冻3h，-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏16g。取10g纯度为31.8％的聚戊烯醇软膏，溶于100mL石油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70℃，搅拌脱色20min。经过脱色，纯度提高到49.6％。取硅胶400目，干法装柱(柱长30cm，柱直径2.5cm)，在-0.05至-0.08MPa抽空气20～30min，从柱的底部加入石油醚，直到石油醚全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0.3～3MPa，检测波长210nm，流速10mL/min循环5-10Bv柱平衡后，将脱色后纯度为49.6％的聚戊烯醇6g溶于50mL石油醚中，柱压0.3～3MPa，检测波长199nm，流速6mL/min，依次使用石油醚、1％乙酸乙酯/石油醚、2％乙酸乙酯/石油醚、3％乙酸乙酯/石油醚洗脱，3％乙酸乙酯/石油醚的洗脱液富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备93％聚戊烯醇。

[0056] 实施例4银杏叶聚戊烯醇脱色方法

[0057] 筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸棒土、混合脱色剂等脱色剂，在451nm比色测定聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率＝[(A0-A1)/A0]×100％，式中：A0-聚戊烯醇脱色前的吸光度；A1-聚戊烯醇脱色后的吸光度。

[0058] 10g聚戊烯醇粗品置于250mL三口烧瓶中，加入100mL石油醚溶解，按选择的因素和水平进行脱色。脱色后的产品过滤、浓缩，测定吸光度，计算聚戊烯醇的脱色率。设定原料中色素含量为y0，脱色一次，结果表明活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂的脱色效果最好，选择活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂。

[0059] 选取混合脱色剂的比例、脱色剂用量、脱色温度、脱色时间4个因素，以收率和脱4
色率两个指标考查脱色工艺，设计了4因素3水平L9(3)正交试验，得出银杏叶聚戊烯醇的最佳脱色条件。如表2和表3。

[0060] 表2正交试验因素水平表

[0061]

[0062] 通过对各因素的综合评价，由极差大小可见，A、B、C、D 4个因素影响收率的主次顺序为A＞B＞D＞C，即脱色剂用量＞脱色剂比例＞温度＞时间；影响脱色率的主次顺序为A＞D＞C＞B，即脱色剂用量＞温度＞时间＞脱色剂比例。考查总体脱色效果时，要求收率和脱色率尽量都要高，由表4可以看出最佳脱色工艺为A2B1C2D3和A3B1C3D2。两者脱色剂用量分别为12g和14g，而通过HPLC测定，得出这两种脱色条件下得到的聚戊烯醇纯度相差不大，从经济角度考虑，最终选择A2B1C2D3为最佳脱色工艺，即脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70℃，脱色时间20min。

[0063] 实施例5聚戊烯醇的活性组合物制剂的制备方法

[0064] 基于100g原料，其中含有4～8g 90％聚戊烯醇、10～15g银杏黄酮、2～6g银杏萜内酯、15～20g植物油、3～5g日本木蜡、5～10g卵磷脂、0.5～3g VE、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、3～10g丙二醇、18～56.5g去离子水。在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，可制成1000mL聚戊烯醇活性组合物口服液，乳液，滴丸和注射液。

[0065] 实施例6聚戊烯醇的活性组合物胶囊

[0066] 取聚戊烯醇活性组合物30g、橄榄油55g、日本木蜡3g、蜂蜡4g、微晶纤维素8g。依次加入到500mL反应器中，60～70℃，真空700～760mmHg，搅拌20～30min，混匀。将明胶、甘油、纯水按1∶0.5∶1.2的比例加入溶胶罐中搅拌，蒸汽夹层加热，温度50～80℃，使其溶化，保温1～2h，真空脱气，过滤，胶液待用。调整压丸室的环境条件，使其达到恒温恒湿，温度为25℃、相对湿度为35％。将物料压制成圆形软胶囊800～1000粒。

[0067] 实施例7聚戊烯醇的活性组合物注射剂

[0068] 取聚戊烯醇活性组合物15g、聚氧乙烯硬蓖麻油60g、脱水山梨醇2g、丙二醇5g、去离子水18g。在室温下超声波乳化10～30min，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，分别装入10mL安瓿，在100℃蒸汽下灭菌40min，制成聚戊烯醇活性组合物注射剂。

[0069] 实施例8聚戊烯醇抗乙型肝炎病毒的药理试验

[0070] 一、实验目的：

[0071] 用HepG 2215细胞作为模型，研究银杏叶聚戊烯醇(GP-1)的细胞毒性以及抗乙型肝炎病毒的药效，包括对细胞毒性、乙肝病毒表面和核心抗原的分泌及对DNA的复制水平的影响。

[0072] 二、受试药物：

[0073] GP-1，实验室制备。基于100g原料，其中含有5g90％聚戊烯醇、15g银杏黄酮、6g银杏萜内酯、20g橄榄油、8g卵磷脂、2gVE、3g吐温-80、5g脱水山梨醇、7g丙二醇、4g日本木蜡、25g去离子水。在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，可制成1000mL聚戊烯醇活性组合物乳液。每个样品做5个稀释浓度试验，阳性对照药物拉米夫定(3TC)，购自葛兰素史克。

[0074] 三、实验方法：

[0075] 采 用 四 氮 唑 还 原 法 (3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide assay MTT)检测药物对HepG 2215生长的抑制作用；ELISA法测定上清液中HBsAg、HBeAg含量；荧光定量PCR法测定上清中病毒DNA含量

[0076] 四、主要步骤：

[0077] 1)取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓4
度至2×10cell/mL，加入96孔培养板中(每孔100μL)。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。

[0078] 2)取出培养板，吸去上清后加入含有不同浓度药物的DMEM培养基(含5％胎牛血清)；放入细胞培养箱，继续37℃、5％CO2培养48小时。药物浓度分别为：100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL。

[0079] 3)在96孔培养板各孔中加入10μL的MTT，重新放入培养箱继续培养4小时。仔细吸去上清，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡使甲溶解，用酶标仪检测570nm处的OD值。

[0080] 4)细胞处理

[0081] 取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。调节细胞浓度至4
2×10cell/mL，加入24孔细胞培养板中(1mL/well)。放入细胞培养箱，37℃、5％CO2培养过夜。取出24孔细胞培养板，吸出上清后依次加入不同浓度的药物。药物浓度分别为：
100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL以及3TC 20μg/mL(阳性对照)。
放入细胞培养箱，37℃、5％CO2培养。分别于第3、6、9天更换新鲜培养基，并将各孔上清液收集至1.5mL的离心管中冻存备用。

[0082] 5)上清HBsAg，HBeAg的检测

[0083] 采用科华ELISA试剂盒进行检测，操作按照试剂盒的使用说明进行。最后用酶标仪读取波长450nm处的OD值。

[0084] 6)病毒基因组DNA的分离(CASsuper Virus Genomic DNA Isolation Kit)取药物作用第9天的细胞培养上清200μL于1.5mL离心管中，然后加入200μL Binding Buffer，立即混匀，室温孵育10min。加入100μL异丙醇，混匀。将混合液转移到一个已经套入收集管的吸附柱内，于12000rpm离心1min。弃去收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中。加入500μL WB1，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管中。加入500μL WB2，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管中。12000rpm离心2min。将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，室温放置数分钟以确保乙醇完全挥发干净。在吸附柱的膜中央小心加入100μL Elution Buffer(65℃水浴预热可有效提高得率)，室温或37℃水浴静置2min。12000rpm离心1min，得到洗脱液，-20℃保存。

[0085] 7)荧光定量PCR反应(ICycler)

[0086] 依次序在0.2mL PCR管中加入以下成分：

[0087]

[0088] 混匀后短暂离心，放入PCR仪的样品孔上，进行反应；反应设置如下：

[0089] 95℃90s，95℃5s，55℃15s，72℃20s，5个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃60s，55℃60s，55℃10s，80个循环；4℃保存。

[0090] 8)数据处理

[0091] 数据表示为means±SD；采用t-test检验，当P＜0.05时认为具有显著意义。

[0092] 五、实验结果：

[0093] 1.药物毒性实验

[0094] 不同稀释倍数的药物加于单层HepG 2215细胞上，每日观察细胞生长形态，检测有无病变；并以MTT法测定细胞的活力(表4)。

[0095] 表4.GP-1对HepG 2215的生长抑制作用

[0096]

[0097] 药物作用48小时，MTT法测定细胞活力。x±s，n＝4.

[0098] 结果表明，GP-1(0.01～100μM)作用下，用药组和未用药组均未见到明显的细胞形态异常及细胞破碎等毒性变化。

[0099] 2.病毒抗原抑制试验

[0100] HepG 2215在24孔培养板上生长至单层，加入不同稀释倍数的GP-1，同时设细胞对照组和药物对照组，培养3、6、9天分别取上清液测定HBsAg和HBeAg，并与细胞对照组比较，计算抑制率、IC50以及TI。对HBsAg的抑制情况如表5，对HBeAg的抑制情况如表6。

[0101] 表5.GP-1对HepG2215分泌HBsAg的抑制作用

[0102]**

[0103] 实验重复两次，x±s，n＝3，P＜0.01，compared with control.

[0104] 表6.GP-1作用不同的时间对HepG2215分泌的HBeAg的抑制作用

[0105]

[0106] 实验重复两次，x±s，n＝3，*P＜0.05，**P＜0.01，compared with control.[0107] 结果表明：高浓度GP-1与阳性药3TC效果相当，对HepG 2215细胞分泌乙肝s抗原、e抗原具有明显的抑制作用。

[0108] 3.病毒核酸抑制实验

[0109] 从细胞培养上清中提取HBV DNA，用荧光定量PCR进行定量。使用的引物序列为：5’-AACTGA AAG CCA AAC AGT G-3’和5’-CCT CTT CAT GCT GCT-3’。如表7和图3。

[0110] 表7.HBV DNA定量

[0111]

[0112] 结果表明：GP-1在各个浓度上对细胞分泌HBV DNA有较好的抑制作用。