一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生产纯化方法和应用

摘要

本发明公开了一种鲨鱼软骨血管生成抑制因子及其生产纯化方法和应用。本发明鲨鱼软骨血管生成抑制因子的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码鲨鱼软骨血管生成抑制因子氨基酸序列的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。本发明鲨鱼软骨血管生成抑制因子具有抑制血管内皮细胞生长及抑制血管生长的作用，可用于制备抑制血管生成或生长，特别是肿瘤血管生成或生长的药物。

权利要求

1.一种鲨鱼血管生成抑制因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子氨基酸序列的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体包含权利要求2所述的cDNA序列。

4.一种重组微生物，其特征在于所述重组微生物是由权利要求3所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞制备而得。

5.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子的生产纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)从鲨鱼软骨组织中提取总RNA；

(2)根据现有已知的鲨鱼血管生成抑制因子序列的保守区域设计引物，序列如SEQ ID NO：4～9所示；

(3)通过PCR扩增得到鲨鱼血管生成抑制因子的基因全长序列；

(4)将所得基因序列克隆至表达载体中，得到重组表达载体；

(5)将重组表达载体转化感受态大肠杆菌细胞BL21，挑取单克隆接种到培养基中，扩增培养并诱导表达，离心收取菌体，经破碎、离心后所得沉淀即为包涵体形式的鲨鱼血管生成抑制因子；

(6)将包涵体变性、离心、去除杂质，再加入到复性液中，经过搅拌、离心、过滤除杂、Ni FAST FLOW亲和层析柱纯化，得到复性的重组鲨鱼血管生成抑制因子。

6.权利要求1所述鲨鱼血管生成抑制因子在制备抑制血管生成或生长的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述鲨鱼血管生成抑制因子的应用，其特征在于所述抑制血管生成是抑制肿瘤血管生成或生长。

说明书

一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生产纯化方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种鲨鱼血管生成抑制因子及其生成纯化方法和应用。

背景技术

[0002] 鲨鱼是极少患恶性肿瘤的海洋动物之一，其发病率为百万分之一。美国科学家Luer将高剂量的强致癌剂黄曲霉素B1注射到鲨鱼体内，也不能诱发鲨鱼患癌症。给鲨鱼接种癌细胞也不能诱发癌症。这提示鲨鱼体内具有独特的抗肿瘤机制(贺丽虹1，黄建华2，沈颂东等，海洋科学/2005年/第29卷/第11期：63-66)。

[0003] 多年来，世界各国的研究人员多数是对鲨鱼软骨组织进行了研究，从中分离提取了多种具有肿瘤抑制作用，尤其是抑制肿瘤新生血管生长的多种物质，如Lee等(Lee A，Langer R.Shark cartilage contains inhibitors of tumorangiogenesis)首次从一条姥鲨的鳍和脊椎软骨中分离提取了一种强烈抑制实体瘤新生血管生成的活性蛋白质。

[0004] 这类从鲨鱼软骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白质称之为鲨鱼血管生成抑制因子(Shark Cartilage Angiogenesis Inhibiting Factor，SCAIF)。Sheu等(Sheu JR，FuCC，Tsai ML，et al.Effect of U-995，a patent shark cartilage-derived angiogenesis inhibitor，on anti-angiogenesis and antitumor activities[J].Anticancer Res，1998，18(6A)：4435)。从蓝鲨软骨中分离纯化了由两条多肽组成的新血管生成抑制因子U-995，可显著抑制人脐静脉内皮细胞的增殖与迁移，并会引起新血管的中断和破裂，阻止破坏由肿瘤坏死因子TNF-α诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，防止由胶原酶诱导的胶原溶解。

[0005] 目前，从各种鲨鱼软骨中分离提取的物质纯度不等，相对分子量大小不一，理化性质和生物学活性不尽相同的蛋白质和多糖类物质。更有人直接将鲨鱼软骨粉作为口服药物，如1997年，加拿大批准鲨鱼软骨口服液AE2941/Neovastat进入III期临床试验，它是至今进入III期临床试验为数不多的抗血管生成药物之一。

[0006] 目前鲨鱼血管抑制因子(SAIF)的相关专利主要集中在提取的鲨鱼血管生成抑制因子和鲨鱼软骨粗制剂的制备和应用。由于鲨鱼的天然资源日渐枯竭，而鲨鱼人工养殖技术难题至今未能突破，造成了SAIF无法大规模应用于临床的困境，因此通过基因工程的手段克隆获得血管生成抑制因子无疑成为大规模生产SAIF的唯一途径，这对于我国海洋药物产业的可持续发展与海洋生物资源保护也将产生积极的影响。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于根据现有鲨鱼血管抑制因子的研究中存在的来源少、无法大规模应用于临床的问题，通过基因工程的手段得到一种鲨鱼血管生成抑制因子的氨基酸序列。

[0008] 本发明另一目的在于提供鲨鱼血管生成抑制因子的cDNA序列。

[0009] 本发明另一目的在于提供一种包含鲨鱼血管生成抑制因子的cDNA序列的重组表达载体。

[0010] 本发明另一目的在于提供一种表达鲨鱼血管生成抑制因子的重组微生物。

[0011] 本发明另一目的在于提供上述鲨鱼血管生成抑制因子的生产纯化方法。

[0012] 本发明还有一个目的在于提供上述鲨鱼血管生成抑制因子的应用。

[0013] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

[0014] 本发明通过PCR克隆技术从条纹斑竹鲨软骨中获得鲨鱼血管生成抑制因子(SCAIF)的全长cDNA序列，该序列长692bp，序列如SEQ ID NO：2所示，其中包括552bp的开放阅读框(从第15个碱基～第563个碱基，包括一个终止密码子)，编码183个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0015] 本发明将上述鲨鱼血管生成抑制因子的基因序列与表达载体相连接，构建包含鲨鱼血管生产抑制因子cDNA的重组表达载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞，最终获得能够表达鲨鱼血管生成抑制因子的重组蛋白。

[0016] 本发明鲨鱼血管生成抑制因子的生产方法具体包括如下步骤：

[0017] (1)从鲨鱼软骨组织中提取总RNA；

[0018] (2)根据现有已知的鲨鱼血管生成抑制因子序列的保守区域设计引物，序列如SEQ ID NO：4～9所示；

[0019] (3)通过PCR扩增得到鲨鱼血管生成抑制因子的基因全长序列；

[0020] (4)将所得基因序列克隆至表达载体中，得到重组表达载体；

[0021] (5)将重组表达载体转化感受态大肠杆菌细胞，挑取单克隆接种到培养基中并诱导表达进行筛选。选取高表达的菌株BL21/pET3C-SAIF在22L发酵罐中进行发酵，发酵8h后离心收取菌体。经超声波破碎后，高速离心，收取沉淀即为含有鲨鱼血管生成抑制因子重组蛋白的包涵体。

[0022] 上述鲨鱼血管生成抑制因子以包涵体形式存在，通过体外细胞学试验检测，该重组蛋白具有抑制血管内皮细胞生长的作用，同时通过鸡胚尿囊膜实验证明该蛋白可以抑制血管的生长，说明该重组蛋白具有抑制血管生长的作用。

[0023] 本发明还将鲨鱼血管生成抑制因子重组蛋白进行了纯化，即：将包涵体变性、离心、去除杂质，再加入到复性液中，经过搅拌、离心、除杂，Ni FAST FLOW亲和层析柱纯化，得到纯度＞90％的重组鲨鱼血管生成抑制因子。

[0024] 由于上述鲨鱼血管生成抑制因子具有抑制血管内皮细胞生长及抑制血管生长的作用，因此可以用于制备抑制血管生成的药物，尤其是用于制备抑制肿瘤血管生成或生长的药物。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0026] 本发明提供一种新的的鲨鱼血管生成抑制因子的全长cDNA序列及其编码的氨基酸序列，不但丰富了鲨鱼血管生成抑制因子的基因库而且本发明通过生物克隆以及蛋白表达技术发现该cDNA序列的表达蛋白具有抑制血管内皮细胞生长以及抑制血管生长的作用，可用于制备抑制血管生成的药物，尤其是用于制备抑制肿瘤血管生成或生长的药物。此外，本发明通过基因工程的方法克隆获得新的鲨鱼血管生成抑制因子的方法，可用于大规模生产鲨鱼血管生成抑制因子，对我国海洋药物产业的可持续发展与海洋生物资源保护具有积极的影响。

附图说明

[0027] 图1为鲨鱼血管生成抑制因子全长cDNA全序列的PCR电泳图；其中，1为PCR扩增产物，M为DNA Marker；通过PCR获得了鲨鱼血管生成抑制因子SAIFcDNA，为692bp。

[0028] 图2为重组载体pET3C-SAIF的PCR鉴定电泳图；其中，M为DNA Marker；1为PCR产物(552bp)，该图显示经过PCR可以得到约为550bp的产物，与目的产物552bp相符。

[0029] 图3为重组载体pET3C-SAIF的酶切鉴定电泳图；其中，M1为λDNA/Hind III(TaKaRa)Marker，1为重组载体pET3C-SAIF，2为重组载体pET3C-SAIF/BamH I，3为重组载体pET3C-SAIF/Nde I，4为重组载体pET3C-SAIF/BamH I+Nde I，M2为100bp DNA Ladder；酶切结果显示，双酶切后有一条大小约为550bp的条带，与目的基因相符，说明目的基因已插入到重组载体中；

[0030] 图4为菌体BL21/pET3C-SAIF的诱导表达SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白Marker，0为未诱导对照，1～3为阳性克隆诱导表达；与未诱导相比较，3个克隆经诱导后，在22kDa处都有一条明显的蛋白条带，证明重组蛋白经诱导后获得表达；

[0031] 图5SAIF的Ni NTA亲和层析纯化图，重组SAIF经Ni柱亲和层析，收集洗脱峰进行电泳；

[0032] 图6为重组蛋白SAIF的纯化电泳图；其中，M为蛋白Marker，1为发酵菌体，2为包涵体清洗，3为Ni柱纯化后洗脱峰；电泳显示，经过Ni柱亲和层析，在洗脱峰中可以获得纯度达到90％以上的重组SAIF。

[0033] 图7为不同浓度重组蛋白SAIF对血管内皮细胞增殖抑制作用曲线图；实验显示，重组SAIF对血管内皮细胞增殖具有抑制作用，并呈浓度依赖关系；

[0034] 图8鲨鱼血管抑制因子SAIF抑制鸡胚尿囊膜血管生长；其中，1～3为实验组，4～6为对照组，与对照组相比较，实验组的血管密度明显降低，说明重组SAIF对鸡胚尿囊膜血管生长具有抑制作用。

具体实施方式

[0035] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

[0036] 实施例1 鲨鱼血管生成抑制因子全长cDNA序列及其编码氨基酸序列的获得[0037] 本实施例通过基因克隆技术，从条纹斑竹鲨软骨组织中制备得到鲨鱼血管生成抑制因子(SAIF)的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列，具体步骤如下所示：

[0038] 1.RNA提取和cDNA第一链的合成

[0039] 从条纹斑竹鲨软骨组织中提取总RNA提取与纯化按照Promega公司的SVTotal RNA Isolation System试剂盒的说明书操作进行。

[0040] cDNA第一链的合成使用TaKaRa RNA LA PCR TM Kit(AMV)试剂盒，以上述条纹斑竹鲨软骨组织RNA为模板，oligo(dT)18为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进行。-20℃保存备用。

[0041] 2.引物设计

[0042] 根据现有已知的SAIF序列，通过分析判断SAIF序列的保守区域，设计系列引物，引物序列如SEQ ID NO：4～9所示。

[0043] 3.PCR扩增

[0044] PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃ 60s，40℃60s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。

[0045] PCR扩增体系为

[0046] PCR Buffer 4

[0047] dNTP 2

[0048] rTaq 0.2

[0049] 质粒 2

[0050] F 2

[0051] R 2

[0052] ddH2O 7.8

[0053] 20μl

[0054] PCR扩增结果如图1所示，从图中可以看出，PCR扩增得到大约700bp的产物(箭头所指位置)。

[0055] 将PCR产物采用常规的切胶回收、纯化、T载体连接、转化感受态细胞、检测阳性克隆等本领域技术人员的常用技术，将所得阳性克隆送交测序。

[0056] 测序结果显示PCR扩增得到一条长692bp的序列，通过对该序列进行分析以及生物学亲缘鉴定，发现其氨基酸序列与现有的SCAIF序列具有很高的同源性，其中与狗鲨中克隆到的基因有85.2％的同源性，与人和斑马鱼的相关基因的同源性分别为68.9％和62.3％。该基因序列不同于任何一种已知的SAIF序列，由此证明本实施例得到一条新的鲨鱼血管生成抑制因子的全长序列，长度为692bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0057] 对上述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行分析，结果表明该序列编码183个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0058] 实施例2 重组载体的构建、鉴定、表达与纯化

[0059] 1.重组载体的构建和鉴定

[0060] 1.1根据cDNA中开放阅读框的基因序列设计上下游引物Fw和Rv：

[0061] P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；

[0062] P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

[0063] 在引物P1上有NdeI酶切位点，在引物P2上有BamHI酶切位点。

[0064] 1.2PCR扩增

[0065] PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，94℃ 60s，40℃60s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。

[0066] PCR扩增体系为

[0067] PCR Buffer 4

[0068] dNTP 2

[0069] rTaq酶 0.2

[0070] 质粒 2

[0071] Fw 2

[0072] Rv 2

[0073] ddH2O 7.8

[0074] 20μl

[0075] PCR扩增结果如图2所示，从图中可以看出，PCR扩增得到大约550bp的产物(箭头所指位置)。

[0076] 将实施例1得到的鲨鱼血管生成抑制因子基因序列克隆至原核表达载体pET3C中，构建得到重组载体，命名为pET3C-SAIF，将该重组载体转化感受态大肠杆菌细胞DH5a，并涂布LB(Amp+)平板，挑取阳性克隆并进行酶切鉴定，酶切鉴定电泳结果如图3所示。

[0077] 从图3可以看出，酶切得到一条552bp的条带，与预期目的片断大小相符，由此说明已经成功构建含有鲨鱼血管生成抑制因子基因序列的重组载体。

[0078] 上述重组载体的构建、转化大肠杆菌感受态细胞、涂布以及酶切鉴定等试验均采用本领域技术人员的常规操作。

[0079] 2.重组蛋白的表达

[0080] 将上述经过鉴定的重组载体pET3C-SAIF转化感受态大肠杆菌细胞BL21(DE3)，涂布LB(Amp+)平板，挑取单克隆接种到LB培养基中，当OD＝0.6时，加入IPTG诱导表达，诱导3h后收取菌体(将该菌体命名为BL21/pET3C-SCAIF)，进行SDS-PAGE电泳。

[0081] SDS-PAGE电泳结果如图4所示，从图中可以看出，在22kDa处有一条明显的条带(箭头所指位置)，该蛋白为183个氨基酸，蛋白理论分子量为22kDa，，因此该条带位置与预期目的蛋白大小相符，由此说明本实施例成功获得鲨鱼血管生成抑制因子全长cDNA序列表达的重组蛋白SAIF。

[0082] 挑取表达量高的克隆作为菌种在摇瓶中扩大培养，同样条件下诱导表达，诱导3h后离心收取菌体，经超声波破碎，离心后分别制备上清和沉淀的样品，进行SDS-PAGE电泳，发现目的蛋白均存在于沉淀中，说明重组SAIF的表达形式为包涵体形式。

[0083] 上述重组载体转化大肠杆菌感受态细胞、涂布、IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳等试验均采用本领域技术人员的常规操作。

[0084] 3.菌体BL21/pET3C-SAIF的发酵

[0085] 将上述获得的菌体BL21/pET3C-SAIF在22L发酵罐中进行发酵处理，所采用的操作均为本领域的常规方法，具体工艺条件如下：

[0086] 在22L发酵罐中加入10L培养基(培养基含有蛋白胨1.6％，酵母粉1.6％，糖蜜0.5％及磷酸缓冲液(Na2HPO40.2％，NaH2PO40.1％，pH7.0)，所述百分比均为质量百分比。
37℃培养，接种量10％(质量百分比)；溶氧控制在发酵前期低速，中期高速，后期低速；连续流加葡萄糖250g，同时通过流加NaOH或HCl，控制pH变化；IPTG在发酵进行到3小时时加入，诱导4小时后放罐最终获得菌体25g/L。

[0087] 4.重组蛋白SAIF的纯化：

[0088] 离心收集上述发酵罐发酵所得菌体细胞，按照1∶8(重量：体积)的比例将细胞重悬在破碎缓冲液中(50mM Tris+300mM NaCl，PH 7.5)，超声波破碎细胞后离心，弃上清。沉淀用缓冲液A[50mM Tris，2％Triton X-100(v/v)，PH8.0]进行包涵体清洗，弃上清，收集包涵体。

[0089] 将包涵体溶于变性液(6M盐酸胍，1mM EDTA，1mM DTT)进行包涵体变性，12000rp离心30min，去除部分不溶杂质，保留上清。再将上清用滤纸过滤，进一步去除不溶杂质。将上一步去除杂质的变性包涵体按1∶10(v/v)比例滴加加入到复性液(0.1M Tris，1mM EDTA，0.5M L-精氨酸，PH8.0)中，用磁力搅拌器于4℃搅拌18h，然后12000rpm离心30min，去除部分不溶杂质，保留上清。再将上清用滤纸过滤，进一步去除不溶杂质。将复性后的蛋白溶液用NiFAST FLOW亲和层析柱纯化，得到复性的重组蛋白SAIF。

[0090] 包涵体清洗以及柱上复性洗脱后取样进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示，从图中可以看出，通过亲和层析，一步获得了纯度＞90％的重组蛋白SAIF。

[0091] 实施例3 重组蛋白SAIF对血管内皮细胞的抑制作用以及对鸡胚尿囊膜血管生长抑制的检测

[0092] 1.重组蛋白SCAIF抑制血管内皮细胞增殖的检测：

[0093] 将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC以1×104cells/well的密度培养于96孔板，培养液为Hams F-12。

[0094] 将重组蛋白SAIF按照5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL的浓度分别加入培养液共培养三天，然后进行MTT染色，观察不同浓度重组蛋白SCAIF的染色结果。

[0095] 从图6中可以看出，重组蛋白SCAIF对血管内皮细胞增殖具有抑制作用，并呈浓度依赖性。

[0096] 2.对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制

[0097] 买回孵化第6天的鸡胚，放在实验室的恒温箱内适应1d，第二天，打开鸡胚尿囊膜一端，将滤膜剪成直径1mm的正方形，并将实施例2制备所得鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽0.3ug/ul加在滤膜上，空白对照为生理盐水，加样量为20ul，等滤膜吸收了样品后，将其放在尿囊膜上，并用透明胶布封严，7d以后，打开透明胶布，用固定液(甲醇∶丙酮＝1∶1，体积比)固定3min后，用剪刀剪下滤膜周围的尿囊膜，平铺于培养皿上，用相机拍摄。

[0098] 实验结果如图8所示，从图中可以看出，实验组加入了鲨鱼血管抑制因子小分子肽的样本中血管密度明显低于对照组，说明鲨鱼血管生成抑制因子小分子肽可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。