一种包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞

摘要

本发明公开了一种包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞，通过构建HLZ乳腺特异性表达载体，在HLZ基因的5′端插入如CSN5序列，3′端插入所示的CSN3序列作为调控元件，CSN5序列和CSN3序列对其下游的目的基因具有调控作用，使其在牛乳腺组织中实现特异的高效表达。本发明使用电穿孔的方法将表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染到牛胎儿成纤维细胞，再经G418，GVC双药物筛选后获得阳性细胞，以阳性细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，并进行PCR鉴定其基因整合的正确性，再将转基因克隆胚移入受体牛子宫中，期望获得乳腺组织分泌溶菌酶的转基因奶牛。

权利要求

1.一种HLZ乳腺特异性表达载体，包含目的基因HLZ，其特征在于，该载体为pCSN2-HLZ-Neo-TK表达载体；

分别在HLZ基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的CSN5序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的CSN3序列，作为调控元件；

在HLZ基因与CSN3序列之间还包含抗生素正筛选基因neo和标记基因IRES-EGFP，在CSN5序列的上游和CSN3序列的下游还包含抗生素负筛选基因TK；

其构建为：

将如SEQ.ID.NO.3所示的CSN 3序列片段用Bst1107I/SpeI双酶切后，连接到同样被Bst1107I/SpeI双酶切的pA2T载体，获得pA2TD载体；

将如SEQ.ID.NO.2所示的CSN5序列片段用Bst1107I/SpeI双酶切，将如SEQ.ID.NO.1所示的HLZ基因片段用NheI/SalI双酶切后，再用Bst1107I，SpeI，NheI，SalI酶切骨架载体pIRES2-AcGFP-Nuc，连接三段酶切产物构建新载体，获得pCSN2-HLZ载体；

将载体pCSN2-HLZ、pA2TD分别用Bpu1102I/NotI双酶切后，回收和纯化酶切产物，再将酶切产物连接后获得pCSN2-HLZ-Neo-TK表达载体。

2.一种基于权利要求1所述的HLZ乳腺特异性表达载体构建的包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，宿主细胞为1～3代的牛胎儿成纤维细胞，通过电穿孔法转染外源性表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK，将目的基因HLZ整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

3.如权利要求2所述的包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞，其特征在于，所述包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞为荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞-pCSN2-HLZ，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201003。

4.权利要求3所述的包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。

说明书

一种包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞

技术领域

[0001] 本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种包含HLZ(溶菌酶)乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞。

背景技术

[0002] 乳 腺 炎(mastitis) 主 要 是 由 葡 萄 球 菌 (staphaylococcus)，链 球 菌(streptococcus)和杆菌(coli)所引起的可传播的细菌性炎症。由于病原菌广泛的存在于畜舍中且潜伏期长，不易根除，使得细菌性乳腺炎给畜牧业的生产带来了巨大的经济损失。目前，针对奶牛乳腺炎的主要预防和治疗措施是使用头孢类或内酰胺类抗生素，但抗生素的长期使用会引起病原菌的耐药性，以及牛奶中药物残留的问题，故需要寻求一种新的治疗乳腺炎的方法。

[0003] 自身能够特异性的在乳房携带或者分泌抗乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。转基因动物的生产可以追溯到20世纪70年代中叶，用原核显微注射生产转基因动物持续了20多年(BOWEN RA，REED ML，SCHNIEKE A，et al.Transgenic cattle resulting from biopsied embryos：expression of c-ski in atransgenic calf[J].Biol Reprod，1994，50：664-8.)，但外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不确定性限制了这种技术的广泛应用。在小鼠上，胚胎干细胞可以代替原核注射(BRANDON EP，IDZERDA RL，MCKNIGHT GS.Targeting the mouse genome：a compendium of knockouts(Part II)[J].Curr Biol，1995，5：
758-65.)，但胚胎干细胞系还没有在家畜上建立(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A，CHEN LR，et al.Isolation of pluripotent stem cells fromcultured porcine primordial germ cells[J].Biol Reprod，1997，57：1089)。

[0004] 而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，BHUIYAN M.M.U.，HYUN Y J，et al.An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha1-antitrypsin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，其突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(WHEELER MB，WALTERS EM.Transgenic technology and applications inswine[J].Theriogenology，2001，56：1345-69.)。

[0005] 溶菌酶(lysozyme)是一种天然的抗菌肽，能有效的水解革兰氏阳性菌细胞壁，抑制细菌生长，广泛的存在于唾液，眼泪和乳液中。溶菌酶在人体中的含量非常高，达到了400μg/ml，能够有效的抑制细菌生长，但在在反刍动物中，溶菌酶的含量非常低，且对细菌无显著作用。如果能够利用基因工程技术将溶菌酶整合到反刍动物的基因当中，使得外源性的溶菌酶被表达之后，将能够很好的解决反刍动物的乳腺炎的问题。

发明内容

[0006] 本发明解决的问题在于提供一种HLZ乳腺特异性表达载体，以及基于该载体的包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0008] 一种HLZ乳腺特异性表达载体，包含目的基因HLZ，分别在HLZ基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的CSN5序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的CSN3序列，作为调控元件。

[0009] 所述HLZ乳腺特异性表达载体在HLZ基因与CSN3序列之间还包含抗生素正筛选基因和标记基因，在CSN5序列的上游和CSN3序列的下游还包含相同的抗生素负筛选基因。

[0010] 所述的抗生素正筛选基因为neo基因，所述的标记基因为IRES-EGFP基因，所述的抗生素负筛选基因为TK基因。

[0011] 所述的HLZ乳腺特异性表达载体为pCSN2-HLZ-Neo-TK表达载体。

[0012] 一种包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过转染外源性表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK，将目的基因HLZ整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

[0013] 所述的宿主细胞为1～3代的牛胎儿成纤维细胞。

[0014] 所述的牛胎儿成纤维细胞通过电穿孔法转染外源性表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK。

[0015] 所述包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞为荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞-pCSN2-HLZ，该细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCC201003。

[0016] 所述的包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0018] 1、本发明构建了一种HLZ乳腺特异性表达载体，通过在HLZ基因两端克隆羊β-酪蛋白基因的5′和3′调控区，羊β-酪蛋白基因的5′和3′调控区能够指导目的基因在牛的乳腺组织中特异的高效表达；

[0019] 而且乳腺特异性表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK能够利用β-酪蛋白基因的同源性，过基因打靶的方式实现目的基因与宿主细胞基因组的整合。

[0020] 2、本发明将表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK通过电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞制备重组细胞，通过有效的双抗性(G418、GCV)的筛选，得到转录沉默型基因打靶型体细胞，包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因HLZ整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组。

[0021] 3、以包含目的基因HLZ的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚，将这些胚胎移入受体牛的子宫有望生产出转hBD3基因的奶牛。

[0022] 保藏说明

[0023] 本发明对所述的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞-pCSN2-HLZ，进行了下述保藏：

[0024] 保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏时间：2010年3月28日；保藏号为：CCTCC C201003，分类命名为重组荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞-pCSN2-HLZ。

附图说明

[0025] 图1是表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的质粒图谱；

[0026] 图2是NotI和Bpu1102I双酶切鉴定连接正确的表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的电泳结果图；

[0027] 图3是诱导表达表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染的牛乳腺上皮细胞的溶菌酶westen检测结果图；

[0028] 图4是对整合了表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的牛胎儿成纤维细胞基因组的Neo基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

[0029] 图5是对整合了表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的牛胎儿成纤维细胞基因组的同源臂及HLZ基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图；

[0030] 图6是以包含HLZ基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体细胞的重组胚的囊胚发育图；

[0031] 图7是对包含HLZ基因的重组胚的基因组的HLZ基因扩增之后的琼脂糖凝胶电泳的检测结果图。

具体实施方式

[0032] 本发明通过基因打靶的方法构建表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK，该表达载体中，目的基因HLZ基因的5′端插入CSN5序列、3′端插入CSN3序列作为启动子，CSN5序列和CSN3序列分别为羊-酪蛋白基因CSN2启动子的5′端、3′端的调控区。由于β-酪蛋白是奶牛乳汁中主要的蛋白质，牛β-酪蛋白基因具有很强的表达活性且该基因保守性很强，牛、羊的β-酪蛋白基因序列的同源性为99％，所以可以通过同源重组将外源基因整合到牛泌乳细胞的基因组，然后在催乳素和氢化可的松的刺激下诱导HLZ基因特异性的表达。因此，CSN5序列和CSN3序列对其下游的目的基因具有调控作用，使其在牛乳腺组织中实现特异的高效表达。

[0033] 本发明使用电穿孔的方法将表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染到牛胎儿成纤维细胞，再经G418，GVC双药物筛选后获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因HLZ定点整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中；以阳性细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚，并进行PCR鉴定其基因整合的正确性，再将转基因克隆胚移入受体牛子宫中，期望获得乳腺组织分泌溶菌酶的转基因奶牛。

[0034] 下面结合附图和具体实施操作对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明解释的而不是限定。

[0035] 1、基因打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK构建：

[0036] a、目的基因HLZ的克隆：

[0037] 根据GeneBank中序列号NM_000239公开的人溶菌酶基因，设计并人工合成引物对P1：

[0038] 上游引物：ttgctagcac gcgtgtcaac atgaaggctc tcattgttc 39；

[0039] 下游引物：ttgtcgactt acactccaca accttgaaca tactgacgg 39；

[0040] 20μl的PCR反应体系中包含：以人溶菌酶基因CDNA(终浓度为1ng/μl)为模板，引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.2U DNA Taq polymerase；

[0041] PCR反应程序：60℃退火30s；72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；扩增人溶菌酶基因的编码框序列。

[0042] 将100μl的PCR产物纯化成20μl的溶液，取3μl进行TA克隆构建pT-HLZ载体，并将该载体转化感受态DH5α，进行蓝白斑筛选和单克隆扩大培养，提取质粒后并进行测序，载体中HLZ基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示，与GeneBank公布的HLZ CDNA基因序列(NM_000239)比较，同源性为99％，至此，克隆到人溶菌酶的基因并将其构建到载体pT-HLZ当中。

[0043] b、5′同源臂(CSN5序列)的克隆：

[0044] 根据GeneBank中序列号AF409096公开的羊β-酪蛋白基因，设计并人工合成引物对P2：

[0045] 上游引物：ttgctagctc agcaggggtt ggtggtggac aggaaagc 38；

[0046] 下游引物：ttacgcgttg caatggccag agccaccaga caggc 35；

[0047] 20μl的PCR反应体系中包含：以羊血细胞基因组(终浓度为100ng/μl)为模板，引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.4mmol/L、2U DNA Taqpolymerase；

[0048] PCR反应程序：58℃退火1min；72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min；扩增羊β-酪蛋白基因的CSN2启动子区及部分编码信号肽的DNA序列；

[0049] 将扩增的CSN5序列克隆到表达载体中，并转化感受态DH5α，进行蓝白斑筛选和单克隆扩大培养，提取质粒后并进行测序，CSN5序列的测序结果如SEQ.ID.NO.2所示。

[0050] c、3′同源臂(CSN3序列)的克隆：

[0051] 根据GeneBank中序列号AF409096公开的羊β-酪蛋白基因，设计并人工合成引物对P3：

[0052] 上游引物：gtatacactc tgatgctggg agggattgg 29；

[0053] 下游引物：actagttttt gtgggaggct gttagggatg 30；

[0054] 20μl的PCR反应体系中包含：以羊血细胞基因组(终浓度为100ng/μl)为模板，引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.4mmol/L、2U DNA Taqpolymerase；

[0055] PCR反应程序：62℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min；扩增羊β-酪蛋白基因的CSN2启动子区3′调控区序列；

[0056] 将扩增的CSN3序列克隆到表达载体中，并转化感受态DH5α，进行蓝白斑筛选和单克隆扩大培养，提取质粒后并进行测序，CSN3序列的测序结果如SEQ.ID.NO.3所示。

[0057] d、乳腺特异性载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的结构及构建过程

[0058] 包含目的基因HLZ、调控元件CSN5序列和CSN3序列，以及抗性筛选基因(neo和TK基因)和标记基因IRES-EGFP的乳腺特异性载体pCSN2-HLZ-Neo-TK，其元件排列如图1所示：

[0059] 其中，CSN5序列下游为目的基因HLZ，HLZ基因的下游为标记基因IRES-EGFP，由于IRES序列的双向启动的作用，使得HLZ基因和绿色荧光蛋白基因EGFP在表达的时候共同表达，这样通过对绿色荧光蛋白的观察和检测就可以知道目的基因是否得到表达；而抗性筛选基因neo和TK分别为抗生素G418抗性基因和抗生素GCV抗性基因，分别作为通过抗生素正筛选和抗生素负筛选的基础元件，这样就能够通过抗生素抗性的双重作用来筛选表达载体被正确整合的阳性克隆。

[0060] 本发明具体通过基因打靶的技术来构建表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK，将克隆到的目的基因和调控元件分别与不同的打靶载体连接，然后在通过多克隆位点构建到一起，具体是以pA2TD载体和pCSN2-HLZ载体为骨架载体进行构建。

[0061] pA2TD载体是本发明基于pA2T载体(陈兴启，孙达权等，通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定，生物工程学报，2008)构建的一种通用型打靶载体，以其作为骨架载体来提供neo基因、TK基因和CSN 3序列；

[0062] pA2TD载体的构建为：将如SEQ.ID.NO.3所示的PCR扩增的CSN 3序列片段用Bst1107 I/Spe I双酶切后，连接到同样被Bst1107 I/Spe I双酶切的pA2T载体，获得的正确连接的载体命名为pA2TD。

[0063] pCSN2-HLZ载体是本发明基于pIRES2-AcGFP-Nuc载体(Clonetech，USA)构建的，以其作为骨架载体来提供CSN 5序列和HLZ基因；

[0064] pCSN2-HLZ载体的构建为：将SEQ.ID.NO.2所示的PCR扩增的CSN 5序列片段用Bst1107 I/Spe I双酶切，将如SEQ.ID.NO.1所示的PCR扩增的HLZ基因片段用Nhe I/Sal I双酶切后，再用Bst1107I，Spe I，Nhe I，Sal I酶切骨架载体pIRES2-AcGFP-Nuc(clontech，USA)，连接三段酶切产物并构建新载体，获得的正确连接的载体命名为pCSN2-HLZ。

[0065] 取质粒pCSN2-HLZ、pA2TD各4μg，用Bpu1102 I/Not I双酶切24h，酶切产物胶回收和纯化后，各取1μl双酶切后的载体pA2TD与7μl的双酶切的载体pCSN2-HLZ进行连接。连接后的质粒命名为pCSN2-HLZ-Neo-TK。打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK用Bpu1102 I/Not I双酶切鉴定，结果如图2所示，泳道1为marker 1kb，泳道2，3为Bpu1102 I/Not I双酶切后质粒的片段，其中长片段大约为10kb，短片段大约为5kb。

[0066] e、乳腺特异性载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的同源重组及表达效果验证[0067] 本发明构建的表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK是通过基因打靶的方式实现整合：即通过β-酪蛋白基因的同源性，实现人溶菌酶基因的定点整合到牛β-酪蛋白基因中，因此该载体也可称为打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK。

[0068] 本发明通过将pCSN2-HLZ-Neo-TK转染牛乳腺上皮细胞并诱导表达外源性人溶菌酶，来说明该载体的表达效果，具体为：

[0069] 从液氮中取一管荷斯坦奶牛的乳腺上皮细胞于38℃解冻，加0.8ml的D/F-12(Dulbecco′s Modified Eagle Media和F-12培养基以1∶1比例混合)细胞培养液离心，弃上清，加D/F-12细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径60mm的培养皿中，置于CO2培养箱中38℃条件下培养。

[0070] 待牛乳腺上皮细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS润洗细胞，加入胰酶-EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，重悬，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养；其中3～5代的牛乳腺上皮细胞，培养至细胞达到90％汇合用于转染。

[0071] 接种前一天，将第3代牛乳腺上皮细胞以1×105接种于12孔板中，培养过夜使细胞达到70-80％汇合。对于每孔细胞，分别将4μg的SacII单酶切纯化过的线性化打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK和9μl的脂质体加入到含有100μl无血清opti-MEM培养液的两个200μl离心管中，5min内将两个离心管中的液体混合，室温孵育20min后，缓慢将其加入到不含血清的opti-MEM细胞培养液中；5-6h后，转换为含血清的正常D/F-12细胞培养液继续培养，24h后加入终浓度为500μg/m G418和终浓度为100μmol/ml GCV进行药物筛选工作。药物筛选10天后，更换正常含血清的正常D/F-12细胞培养液，直至细胞汇合。而后更换无血清但含有催乳素和氢化可的松的D/F-12细胞培养液，诱导细胞表达外源人溶菌酶基因。

[0072] 外源人溶菌酶基因被表达后的蛋白检测是通过western印记来实行的。取被基因6
打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染的牛乳腺上皮细胞1×10 个，使用南京凯基全蛋白提取试剂盒KGP250提取细胞蛋白。对全蛋白在100℃进行热变性5min，加入上样缓冲液，使用凯基SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒KGP113配置15％SDS-PAGE凝胶，然后再使用凯基Western Blotting检测试剂盒KGP1201对样品进行检测。检测照片如图3所示，泳道1为阳性对照的人溶菌酶，泳道2为转基因乳腺上皮细胞提取的蛋白，泳道3为正常的非转基因的乳腺上皮细胞提取的蛋白；泳道2与泳道1相比，均显示了人溶菌酶特异性的条带，泳道3而作为阴性对照的非转染细胞并没有相应的条带，这说明表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK在牛乳腺上皮细胞得到特异性的表达。

[0073] 2、基因打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞株[0074] a、牛胎儿成纤维细胞的培养

[0075] 从液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃上清，加DMEM细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径60mm的培养皿中，置于CO2培养箱中38℃条件下培养。

[0076] 待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca2+、Mg2+的PBS润洗细胞，加入胰酶-EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，重悬，按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO2培养箱中培养。3～5代的牛胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到90％汇合用于转染。

[0077] 由于表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的骨架上有G418抗性基因neo，整合到基因组上的neo基因的牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会被该药物杀死，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。

[0078] G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞培养液(DMEM细胞培养液)中分别加入浓度梯度的G418筛选8天，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥500μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为500μg/ml。

[0079] b、打靶载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染牛胎儿成纤维细胞

[0080] 转基因的方法有很多种，包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法、病毒载体法、受体介导法等。本发明具体采用电穿孔法来介入表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染牛胎儿成纤维细胞事件，电穿孔法通过对细胞膜电击作用，使外源性线性化的表达载体穿过细胞膜进行同源重组，具体为：

[0081] 转染前一天，将第3代牛胎儿成纤维细胞以5×105接种于60mm皿中，培养过夜使细胞达到80％汇合。转染当天，PBS清洗贴壁细胞而后再用胰蛋白酶EDTA消化细胞，DMEM培养液重悬，离心，去上清，再用1ml opti-MEM培养液(invitrogen，USA)重悬。将10μg SacII单酶切纯化过的线性化表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK加入到上述1ml opti-MEM培养细胞悬浮液中，温和混匀；然后用移液器将其分别移入到两个4mm电极杯中(各0.5ml，每个电极杯中各占一半)，设定参数400μV/1ms，五次电击进行电穿孔转染，电击完成后再转移到离心管中静置十分钟，用移液器将电穿孔转染的重组细胞转移至含有3ml DMEM培养液的60mm皿培养，在CO2培养箱中38℃条件下培养。

[0082] c、转染表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的重组细胞的筛选

[0083] 由于表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK包含G418抗性基因neo，整合到基因组上的neo基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会被该药物杀死；

[0084] 同时表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK还包含GCV抗性基因TK，在发生随机整合的正常细胞中，tk基因会被整合到基因组中并且表达胸苷激酶，该激酶分解GCV产生有毒物质从而促使随机整合细胞凋亡，而发生正常同源重组事件的细胞不会有tk的基因，也就不会被杀死。故阳性细胞可在含有负筛选药物GCV的培养基中生存。

[0085] 本发明通过G418、GCV双药物筛选获得的阳性细胞，其中，G418为正筛选药物，GCV是负筛选药物，能够同时在G418、GCV双药物存在下的阳性细胞为正确同源重组的细胞；具体的筛选为：

[0086] 表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK转染牛胎儿成纤维细胞12h后在含血清的DMEM细胞培养液中添加终浓度为500μg/ml(最小致死浓度)的G418进行筛选；以未转染的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418(500μg/ml)；

[0087] 转染细胞G418筛选8d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞，将培养基的G418浓度减半并加入100μmol/mlGCV持续筛选直到细胞长满皿底，然后用胰酶-EDTA消化细胞，再添加不加抗生素的DMEM培养液扩大培养。

[0088] d、转染表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK阳性重组细胞的PCR鉴定

[0089] 本发明筛选的阳性细胞都是稳定转染pCSN2-HLZ-Neo-TK的细胞，目的基因HLZ整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；在通过G418、GCV双药物持续筛选的基础上，本发明进一步通过细胞基因组PCR鉴定：

[0090] 取扩大培养后的阳性重组细胞，提取细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定酪蛋白5’端同源臂，目的基因HLZ和正筛选基因neo，以未转染的正常牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，进行PCR鉴定；

[0091] PCR反应1：对正筛选基因neo进行检测，检测阳性细胞是否整合了neo基因，PCR扩增所用引物对P4为：

[0092] 上游引物：aacaccgagc gaccctgc 18；

[0093] 下游引物：atccgaacaa acgacccaac 20；

[0094] 20μl的PCR反应体系中包含：以细胞基因组(终浓度为100ng/μl)引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.4mmol/L、2U DNA Taq polymerase；

[0095] PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸6min，35个PCR循环，72℃再延伸12min；

[0096] PCR反应2：对同源臂和目的基因HLZ的整体链接片段进行检测，检测外源基因HLZ是否整合到酪蛋白基因中，PCR扩增所用引物对P5为：

[0097] 上游引物：ctcctcttgt ctgggctttc a 21；

[0098] 下游引物：cgatgtttcg cttggtggtc 20；

[0099] 20μl的PCR反应体系中包含：以细胞基因组(终浓度为100ng/μl)引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.4mmol/L、2U DNA Taq polymerase；

[0100] 回收上述两个PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果分别如图4，5所示。其中，图4当中泳道M为DNA Marker，泳道1为未转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道2～6为pCSN2-HLZ-Neo-TK阳性转染的牛胎儿成纤维细胞；与泳道1的阴性对照相比，泳道2～
6明显可以看到一条810bp左右的条带，说明目的基因neo整合到细胞基因组中，从而使细胞对G418抗性有抗药性。

[0101] 图5当中泳道M为DNA Marker，泳道1、2为CSN2-HLZ-Neo-TK阳性转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道3、4为未转染的牛胎儿成纤维细胞；与泳道3、4的阴性对照相比，泳道1、2明显可以看到一条5800bp左右的条带，说明外源基因HLZ连同同源臂整合到牛胎儿成纤维细胞的酪蛋白基因中。

[0102] 本发明对经过重组筛选和重组细胞的PCR验证正确的转染了表达载体pCSN2-HLZ-Neo-TK的阳性重组细胞，送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，分类命名为重组荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞-pCSN2-HLZ，保藏号为：CCTCC C201003。

[0103] 3、以上述基因组整合了目的基因HLZ胎儿成纤维细胞(CCTCC C201003)作为核供体细胞，构建转基因克隆胚

[0104] a、卵母细胞的成熟培养

[0105] 卵巢采自西安市牛屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，2～3小时内运回实验室，抽取3～8mm直径的卵泡，收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为：TCM199(Gibaco)加10％胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为：38.5℃，5％CO2、
95％空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2％透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成熟的判定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。

[0106] b、转基因克隆胚的构建

[0107] 本方面采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体核转移到去除细胞核的成熟卵母中，其中，整合有外源基因的供体细胞是关键，本发明将供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。

[0108] 核移植具体为：显微操作液为含10％FBS，5μg/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10μg/mlHoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；

[0109] 采用电融合法进行体细胞核移植，过程如下：在显微镜下挑选直径为15μm左右的供体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触，注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法进行融合；

[0110] 融合前先将细胞-卵胞质重组体放入融合液(含0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA)中预平衡4～6min；用与显微操作仪连接的微电极的尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予2次电脉冲进行电融合(28V、10μs)。融合后的细胞-卵胞质重组体放入含10％FBS(fetal bovingserum，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)的M199(购自GIBCO公司)中，38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，0.5～1h后观察融合情况。

[0111] c、转基因克隆胚的激活及体外培养

[0112] 融合的重组胚(细胞-卵胞质重组体)在含10％FBS的M199中平衡2h后用含5μmol/L离子霉素(Ionomycin，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOFaa微滴中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每48h半量换液1次，第7～9天检查囊胚发育情况，如图6所示，克隆胚正常发育至囊胚，图中黑色部分为内细胞团，外围为滋养层细胞。

[0113] d、转基因克隆胚的外源基因HLZ检测

[0114] 提取转基因克隆胚的基因组，设计并人工合成引物对P1进行PCR扩增检测，引物对P1为：

[0115] 上游引物：agcac gcgtgtcaac atgaaggctc tcattgttc 34；

[0116] 下游引物：cgactt acactccaca accttgaaca tactgacgg 35；

[0117] 20μl的PCR反应体系中包含：以转基因克隆胚基因组(终浓度为100ng/μl)为模板，引物终浓度为0.4μmol/L、dNTPs 0.2U DNA Taq polymerase；检测结果如图7所示。图中，泳道M为DNA Marker，泳道1，2为普通为转染的克隆胚，泳道3，4为转基因克隆胚；
泳道K的空白对照相比，泳道5为阳性对照，图中明显可以看到一条470bp左右的条带，这说明转基因克隆胚的基因组当中整合了外源性基因HLZ，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供了坚实的基础。

[0118] 核苷酸序列表

[0119] <110>西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司

[0120] <120>一种包含HLZ乳腺特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞

[0121] <160>3

[0122] <210>1

[0123] <211>471

[0124] <212>DNA

[0125] <213>人溶菌酶基因(HLZ)

[0126] <400>1

[0127] atgaaggctc tcattgttct ggggtttgcc ctcctttctg ttacggtcca gggcaaggtc 60[0128] tttgaaaggt gtgagttggc cagaactctg aaaagattgg gaatggatgg ctacagggga 120[0129] atcagcctag caaactggat gtgtttggcc aaatgggaga gtggttacaa cacacgagct 180[0130] acaaactaca atgctggaga cggaagcact gattatggga tatttcagat caatagccgc 240[0131] tactggtgta atgatggcaa aaccccagga gcagttaatg cctgtcattt atcctgcagt 300[0132] gctttgctgc aagataacat cgctgatgct gtagcttgtg caaagagggt tgtccgtgat 360[0133] ccacaaggca ttagagcatg ggtggcatgg agaaatcgtt gtcaaaacag agatgtccgt420

[0134] cagtatgttc aaggttgtgg agtgtaatcg acggtaccgc gggcccggga t 471[0135] <210>2

[0136] <211>3044

[0137] <212>DNA

[0138] <213>羊β-酪蛋白基因的5′调控区(CSN5)

[0139] <400>2

[0140] ataaacattg actataaaag atatgaggcc aaacttgagc tgtcccattt taataaatct 60[0141] gtataaataa tatttgttct acaaaagtat tatctaaata aatgttactt tctgtcttaa 120[0142] aatccctcaa caaatcccca ctatctagag aataagattg acattccctg gaatcacagc 180[0143] atgctttgtc tgccattatc tgaccccttt ctctttctct cttctcacct ccatctactc 240[0144] ctttttcctt gcaattcatg acccagattc actgtttgat ttggcttgca tgtgtgtgtg 300[0145] ctgagttgcg tctgactgtt atcaacccca tgaatgatag tccaccaggc tctactgtcc 360[0146] atgaaatttt ccagtcaaga atactggagt ggattgcatt tcctactcca tttgattaat 420[0147] ttagtgactt ttaaatttct ttttccatat tcgggagcct attcttcctt tttagtctat 480[0148] actctcttca ctcttcaggt ctaaggtatc atcgtgtgct tgttagcttg ttactttctc 540[0149] cattatagct taagcactaa caactgttca ggttggcatg aaattgtgtt ctttgtgtgg 600[0150] cctgtatatt tctgttgtgt attagaattt accccaagat ctcaaagacc cactgaatac 660[0151] taaagagacc tcattgtggt tacaataatt tggggactgg gccaaaactt ccgtgcatcc 720[0152] cagccaagat ctgtagctac tggacaattt catttccttt atcagattgt gagttattcc 780[0153] tgttgaaatg ctccccagaa tttctgggga cagaaaaata ggaagaattc atttcctaat 840[0154] catgcagatt tctaggaatt caaatccact attggtttta tttcaaacca caaaattagc 900[0155] atgccattaa atactatata taaacagcca ctaaatcaga tcattatcca ttcagcttct 960[0156] ccttcacttc ttctcctcta ctttggaaaa aaggtaagaa tctcagatat aatttcagtg 1020[0157] tatctgctac tcatctttat tttggactag gttaaaatgt agaaagaaca taattgctta 1080[0158] aaatagatct taaaaataag ggtgtttaag ataaggttta cactattttc agcagatatg 1140[0159] ttaaaaaata gaagtgacta taaagacttg ataaaaatta tagtgactgc aaatgtttta 1200[0160] ggaatataat aagatataat aacagtggtt gctattttct ttagcacaag actagtcaac 1260[0161] aggctgtatt aaaagatctt ttcttgaatt aaatattttc aatttgatta aacctacctc 1320[0162] agccataaag gcaagcacat ttcatttata ctatggggat ttgaataatt attactgaag 1380[0163] aagctctacc aacaaaaagt ttatagagct atcatattta gtcaagagat aaagagggtt 1440[0164] gttaggatat atatgctatt tgaaaggtat ttataaaaga agagtatatt tatcaaaatt 1500[0165] tctcagaaca tccaaatttc aagtttatca tttatcttac aatatttcaa aaatattaaa 1560[0166] atagatacat gaaatacaga agtaaattaa agagaaagta ttttacttgg taaaaaaatt 1620[0167] ctaggttgga cagagagtgc caggaaacaa aaacaatgaa aaatgtgacc tgactggaat 1680[0168] tatagctcaa agtatagtag taagtaatga aatggcttaa aaattggtat ataaaatgct 1740[0169] agttataaaa taaacaaaat gcaataatat cctccctaca tgtaatgaat tctaggtatt 1800[0170] atgctctttt ttgaagtctt gacaataaaa atttttttag aagtttatag gcatcttgaa 1860[0171] taaagtgaaa caaattaaga attagtatcc atgagaaaaa tatagaacaa ttttcctaat 1920[0172] ttagtttgaa aatctgggat tgaagatgtg tgtcaagaga tgttggtggc aagaacattt 1980[0173] ttttttcaag aacttataaa aatgcaacaa aacaaaccat ttaatacatt ttggtcaaaa 2040[0174] tcaataatgt attttatttt atgctccaag gagcataaaa ttggggactg ggcaagagaa 2100[0175] actgacaccc tggtaaatta ccaagagata agtacacagt tctatgtaga gaaaataagc 2160[0176] atagtgtatg atctctaaaa ttatgtgaga caaaggagag atgacattag gcatgtgggg 2220[0177] atgaagactg agtagagaag aaacaatcta atcagtccaa gaaaacatct cgatcagtgg 2280[0178] aacaaataga agaaatgcta aaatgaaaca gaagtcttac tggaaataaa agatatgcat 2340[0179] aagacaaaaa ttcatgaaaa tcacttagtt tagcagagaa aagataaaaa taaagtatga 2400[0180] ccttcttcat atacattgtt tgatcatatg cacctcaata aaactgagtc tccaacagaa 2460[0181] atgaaacatt aatattttgt tcactgctct aatcccagaa tctaagcgat atctggcaat 2520[0182] aaaaataata aatatatatt ttttaataaa tgaatcaacc acttaatttt tctgtaaata 2580[0183] tctgtaactt ctcttctgtc tttccaaaaa cactcataag tactgtgaat gagatgaaaa 2640[0184] agagtgaagt aggatatagg ctgttagcag aaaacatctg aatggctggc agtgaaacat 2700[0185] taacttgaaa tgtaagatta atgagtaata gtaaatttta accttggcca tatgataaaa 2760[0186] tgttcattaa tatttttcta gaatacaggg ctttttgttt ttgccatgag gtttgcagga 2820[0187] tcttggttcc ctgaccaggg atcaaacctg cactcccctg gaagcatgga gtcttggaca 2880[0188] tctgtattat acactatctt tggttccttt taaagggaag taattttact taaataagaa 2940[0189] aatagattga caagtaatac gctgtttcct catcttccca ttcacaggaa tcgagagcca 3000[0190] tgaaggtcct catccttgcc tgtctggtgg ctctggccat tgca 3044[0191] <210>3

[0192] <211>2379

[0193] <212>DNA

[0194] <213>羊β-酪蛋白基因的3′调控区(CSN3)

[0195] <400>3

[0196] actctgatgc tgggagggat tggggtcagg aggagaaggg gacgaccgag gatgagatgg 60[0197] ctggatggca tcactgactc gatggatgtg agtctgagtg aactccggga gttggtgatg 120[0198] gacagggagg cctggtgtgc tgcaattcat ggggttgcga agagtcagac acgactgagt 180[0199] gactgaaatg aactgaactg aactgaagaa tgattgagaa gtgcattagt ggttattatt 240[0200] atatattttc aatgactatt attcttttag aaccagatga aaatatcaga gatcatttgt 300[0201] tttcctaagg agaaaatagg gtgattgagg gacaggtatg catgcaaagt tgtttcagcc 360[0202] ctttccaact ctgtatgacc ctatggactg taacctgcca ggctcctctg tctatggatt 420[0203] ttccaggcaa gaatactgga gtgggttgtc acctcctcct ccagggccta ggaattgaac 480[0204] ctgcatctct tatgtctcct gcattggcag gcaggttctt taccactagc accacctggg 540[0205] aagcccgatt agcatctgtt aaatgcctct ttgggtactg tgctctctca tcctcttttt 600[0206] cttgactgca tcatcttttt ttttatacaa cagccttatt cagaatagtg gaacagaaac 660[0207] tttcagccat aaaataatga tatcatcaaa tgagctgtcc atattaacct attaaatgtc 720[0208] ttcatttctg atttatgttg acaaatatga atttttcttt aaagctaaac ctgattttat 780[0209] ttttattttt ccaaaggaat ctattacaca catcaataag gtaaaacctt catatttaaa 840[0210] tgtacatttt taaaaatttt gtgtttgatt tttataaaca gcatttcttt atgtgtgatt 900[0211] tttttttttt taccagaaaa ttgagaagtt tcaaagtgag gaacaacagc aaacagaggt 960[0212] aatttgttca ctatgagtat attttgagaa gtattatgaa acataacaca taaaaagatt 1020[0213] tataataatt atgttcagtc taagaatggt aatataaatg tcagtgtaag aaatgaaaac 1080[0214] ttttacaaaa tgaaaatatt ttaaagatag aaacacattt ttaaacacat aatcaaattt 1140[0215] cagagtatag aataaatacc caagaataac tactggtata ttcattttac taatggtata 1200[0216] cctggtttta ataaatgcat attagtagga acaattccag actagggact gtgatcccct 1260[0217] tattctaatg atggatatgc tgatgaaaga cagtagggtg acagtgtggc actaatcctc 1320[0218] atttgatcat ttatcagctg tataaccttg gctccatgtt tctctgtaca tcattttctt 1380[0219] cacctgtaaa ttgagaatat tcataattac ccagagttga tgaactggca cacagtgact 1440[0220] attcaatggt tttatattat atttgatagt tttatactca catttatgaa tgtgtggagt 1500[0221] tctaaaaagt atttccatta cccagatgag agaagtgagg tacagaacaa ttgagtatac 1560[0222] aaatgtgtga ccataccaca tagttattaa ttagcagaac ttgcttaaaa ataaggattt 1620[0223] ggggacagca taaaattctt tcattatatt actcttgtgg taacatattt atctaattgt 1680[0224] gatatttaag ctttcctgtt ttagaattga agattgattg tttggcactt aggccaaata 1740[0225] ttttctaagt caaaatgaat ttacaacttg atgcctttaa agactcaaga ttaccacctt 1800[0226] ctaccaagag aagtagtgct agaagttggc cattgttaag gaactccttg aattaaaaaa 1860[0227] acacatatta agacttagtt tccattaaaa caaacaaaaa taaacctcag agtaactttt 1920[0228] taagtccttt taaaatagat ctttctttgt tatatgaaat cagtttggac tattatccaa 1980[0229] agtatgtagc taccactctg caggcaactc aggaagaggt ggaataagtg ttgaaatctc 2040[0230] caaaccctga tttcacttga ctctctgatt tcacttgtga aggaagttgg gttaatgaga 2100[0231] aatccttcag cgagcatttt actcattagt cttcatatga ccccaaacaa tttcttaact 2160[0232] aaaccaaatg gaagattttc tttctctctc ttcactgaat tatgttttaa aaagaggagg 2220[0233] ataattcatc atgaataaca attataactg gattatggac tcaaagattt tttttccttc 2280[0234] tttccaggat gaactccagg ataaaatcca cccctttgcc caggcacagt ctctagtcta 2340[0235] tcccttcact gggcccatcc ctaacagcct cccacaaaa 2379