活血化瘀、软解散结提取物的制备方法

摘要

本发明涉及一种中药复方制剂的提取物的制备方法。本发明所述的消结安提取物的制备方法中所述的提取物是由以下药用原料制成的：功劳木1100、三叉苦750、益母草750、鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，所述的制备方法包括以下步骤：(一)、取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘，制成净药材；(二)、称取功劳木、三叉苦、益母草，加入4～12倍量(V/W)的50～95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎；(三)、另称取鸡血藤、土茯苓、连翘，加入4～12倍量(V/W)的50～95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎；(四)、将步骤(二)和步骤(三)所得物混合均匀，即得。

权利要求

1.一种活血化瘀、软解散结提取物的制备方法，所述的提取物是由以下药用原料制成的：功劳木1100、三叉苦750、益母草750、鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，其特征在于所述的制备方法包括以下步骤：(一)、取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘药材，分别破碎、切制，制成净药材；

(二)、称取净药材功劳木1100、三叉苦750、益母草750，加入4～12倍量V/W的50～

95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

(三)、另称取净药材鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，加入4～12倍量V/W的50～

95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

(四)、将步骤(二)和步骤(三)所得物混合均匀，即得。

2.如权利要求1所述的消结安提取物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括以下步骤：(一)取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘药材，分别破碎、切制，制成净药材；

(二)称取净药材功劳木1100份、三叉苦750份、益母草750份，投入多功能提取罐中，加入8倍量V/W的75％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

(三)另称取净药材鸡血藤750份、土茯苓900份、连翘750份，投入多功能提取罐中，加入7倍量V/W的80％乙醇回流提取2次，每次2.5小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

(四)将步骤(二)和步骤(三)所得物混合均匀，即得。

说明书

活血化瘀、软解散结提取物的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药复方制剂的提取物的制备方法。

背景技术

[0002] 消结安(原名乳癖安消)是由功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘等六味药材组成的中药复方制剂，包括胶囊剂、口服液等剂型，消结安胶囊现行国家药品标准收载于《国家中成药标准汇编》地标升国标口腔肿瘤儿科分册(411-414页)，标准编号：WS-10433(ZD-0433)-2002，消结安口服液现行国家药品标准收载于《国家中成药标准汇编》地标升国标口腔肿瘤儿科分册(415-418页)，标准编号：WS-10646(ZD-0646)-2002。消结安具有活血化瘀，软坚散结的功能。临床用于气滞血瘀所致乳癖，乳腺小叶增生，卵巢囊肿，子宫肌瘤见上述证候者。

[0003] 上述消结安胶囊现行国家药品标准WS-10433(ZD-0433)-2002【制法】项下规定为“以上六味药材，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，静置，滤过；滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.19(60℃)的清膏，喷雾干燥，加入淀粉、滑石粉及硬脂酸镁，混匀，用75％乙醇制成颗粒，干燥，过筛，装入胶囊，即得。”，专利ZL200410034163.8、专利ZL200610106927.9、专利200510031611.3、专利200610099386.1和专利200610150616.2公开的制备方法均是：以上六味药材一起，加水煎煮，得煎液，滤过，滤液浓缩，制成口服液或其他液体制剂；或将浓缩液干燥，制成胶囊或其他固体制剂。此方法有效成分转移率较低，由此方法制备的药品有效成分含量较低，而有效成分含量高低，直接关系到药品的有效性。以消结安胶囊为例，上述现行国家药品标准规定消结安胶囊每粒含盐酸小檗碱不得少于0.03mg，而消结安胶囊每粒含盐酸小檗碱实际一般为0.05～0.10mg，每粒消结安胶囊相当于含功劳木药材1100mg，以中国药典2005年版规定的功劳木含盐酸小檗碱不得少于0.20％计算，上述方法盐酸小檗碱的转移率只在1.4％以上，一般在3.5～5.5％之间，与有效成分转移率应达到50％以上的一般技术要求相比，这一转移率相当低。中药复方制剂的有效成分的含 量和转移率主要与其提取物的制备方法有关。对于中药而言，提取物中有效成分含量的高低是中成药制剂有效性的主要决定因素，制剂质量主要是由提取物质量决定的。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种能够有效提高消结安提取物中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸水苏碱、连翘苷、落新妇苷等有效成分的含量的制备方法。

[0005] 本发明所述的消结安提取物的制备方法中所述的提取物是由以下药用原料制成的：功劳木1100、三叉苦750、益母草750、鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，所述的制备方法包括以下步骤：

[0006] (一)、取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘药材，分别破碎、切制，制成净药材；

[0007] (二)、称取净药材功劳木1100、三叉苦750、益母草750，加入4～12倍量(V/W)的50～95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

[0008] (三)、另称取净药材鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，加入4～12倍量(V/W)的50～95％乙醇回流提取2～4次，每次1～4小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

[0009] (四)、将步骤(二)和步骤(三)所得物混合均匀，即得。

[0010] 步骤(二)、(三)所述的各药材为重量份。

[0011] 本发明所述的制备方法得到的是消结安的提取物，用本提取物加入药学上可接受的适宜的载体或药用辅料，采用现有技术可制成各种剂型的药物制剂，包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、散剂、滴丸剂、糖浆剂、合剂、酊剂、搽剂、凝胶剂、贴膏剂、膜剂等口服或外用剂型，或其相应的缓控释剂型。

[0012] 药材功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳Mahonia bealei(Fort.)Carr.或细叶十大功劳Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde的干燥茎，主要有效成分是生物碱，包括盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱等。三叉苦为芸香科植物三叉苦Euodia lepta(Spreng)Merr的干燥茎枝叶，主要成分有生物碱、二甲基色烯类化合物等。益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分，主要有效成分是生物碱，包括盐酸水苏碱、盐酸益母草碱等。鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，主要成分有异黄酮和花青素等黄酮类化合物和三萜类化合物，如芒柄花素、樱黄素、没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、胡萝卜苷、原儿茶酸、大豆黄素、刺芒柄花素、樱黄素、大黄素，以及正十六酸、二十二烷酸、琥珀酸、丁香酸、香草酸等。土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，主要成分有黄酮类化合物落新妇苷、槲皮素等，以及有机酸类的阿魏酸、3，5-二甲基苯甲酸、5-O-咖啡酰莽草酸、木蜡酸、琥珀酸、紫丁香酸等，还含有鞣质等成分。连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thumb.)Vahl的干燥果实，主要有效成分有连翘苷等木脂素苷类、连翘酯苷A等苯乙醇苷类、齐墩果酸和熊果酸等五环三萜化合物、黄酮类化合物、连翘酸-1-O-β-D-葡糖苷、咖啡酸等酚酸类成分。

[0013] 已公开的消结安提取物的制备方法均是将六味药材全部一起，用水作为提取溶剂，煎煮提取，结果除不同药材中的生物碱类成分和有机酸类成分发生反应之外，盐酸小檗碱等生物碱类成分还可能与黄酮类成分、鞣质或酚类等成分发生反应生成沉淀而不能进入提取物中。进一步的是，不同的药材在一起提取，可能导致提取液pH值和酸碱介质的不同，从而苷类等成分的聚合、降解情况不同，如酸性介质和抗氧剂的存在将大大提高水溶液中连翘酯苷A的稳定性[王曙宾，郑亚杰。连翘提取物和连翘酯苷A原料中的稳定性研究。中草药，2010，41(6)：909-911]；也可能导致增溶作用的变化，从而影响某些成分的提取；
还可能导致氧化还原环境的变化，从而导致氧化还原反应发生程度的变化，更进一步的情况是，这些条件的变化又可导致提取液总体环境的变化，反过来还会影响酸碱中和反应、生物碱与黄酮类成分、鞣质或酚类等成分之间的沉淀反应。所有这些都将影响到提取收率，有效成分转移率，从而影响消结安的疗效。因此，中药复方制剂的提取物的制备方法，是全部药材一起提取，还是根据各药材具体情况，经深入细致的研究，科学合理的将全部药材分作
2部分甚至更多的部分分别进行提取后混合再行配制制剂，对于最终产品的有效性、安全性有着重要意义，对降低服用量(生药量)、节约资源、降低成本、减轻消费者负担具有重要意义。

[0014] 研究发现，消结安的全部药材一起，用一定浓度的乙醇作为提取溶剂，回流提取，制备提取物，可以提高各有效成分转移率和消结安提取物中有效成分的含量，但由于上述因素依然存在，各有效成分的转移率仍然较低。

[0015] 本发明根据消结安处方各药材的化学成分及其性质，巧妙的把全部六味药材分为两组，一组为功劳木、三叉苦和益母草，有效成分/主要成分均为生物碱，不含或仅含微量有机酸类成分、酚类成分、鞣质等，另一组为鸡血藤、土茯苓和连翘，有效成分/主要成分为黄酮类化合物、三萜类化合物、木脂素苷或苯乙醇苷类化合物，均含有有机酸类成分，但不含或仅含微量生物碱类成分，两组药材分别用一定浓度的乙醇溶液进行回流提取，每一组药材在提取过程中均不会或很少发生酸碱中和等反应，各类沉淀反应、降解反应、氧化反应等不发生或少发生，增溶作用较强，从而提高了提取收率，大大提高了有效成分转移率，大大提高了消结安提取物中有效成分的含量，从而提高了消结安的药效，取得了很好的结果。

[0016] 以下为本发明与现有技术以及相关技术的对比试验：

[0017] 1、材料、试药与仪器

[0018] 原料药：功劳木(批号09122204)、三叉苦(批号09111002)、益母草(批号10012103)、鸡血藤(批号09082501)、土茯苓(批号10010502)、连翘(批号10010601)。

[0019] 盐酸小檗碱对照品(110713-200911)、盐酸巴马汀对照品(110732-200907)、盐酸水苏碱对照品(110712-200306)，连翘苷对照品(110821-20071 1)，均购自中国药品生物制品检定所，落新妇苷对照品(南京泽朗医药科技有限公司，批号PS090706，HPLC纯度99.94％)。HPLC用甲醇和乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

[0020] Agilent 1100高效液相色谱仪，G1311A四元泵带真空脱气机，G1314A紫外检测器，G1316A柱温箱，Agilent Chemstation工作站；SK3300HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。多功能提取罐(湖南瑞健节能设备制造有限公司)。

[0021] 2、国家标准消结安提取物和国家标准消结安胶囊的制备

[0022] 照国家药品标准WS-10433(ZD-0433)-2002【制法】项下规定制备。

[0023] 取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘六味药材，分别破碎、切制，制成净药材，称取净药材功劳木1100、三叉苦750、益母草750、鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，投入多功能提取罐中，加入8倍量(V/W)的水加热回流提取2次，第一次2小时，第2次1.5小时，提取液静置24小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.19(60℃)的清膏，喷雾干燥，过筛，混匀，即得国家标准消结安提取物。

[0024] 取国家标准消结安提取物，加入淀粉4.5、滑石粉15和硬脂酸镁0.5，混匀，用75％乙醇制成颗粒，干燥，过筛，混匀，装入胶囊，即得国家标准消结安胶囊。

[0025] 3、对比消结安提取物1和对比消结安胶囊1的制备

[0026] 取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘六味药材，分别破碎、切制，制成净药材，称取净药材功劳木1100、三叉苦750、益母草750、鸡血藤750、土茯苓900、连翘750，投入多功能提取罐中，加入8倍量(V/W)的80％乙醇加热回流提取2次，第一次2小时，第2次1.5小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，过筛，混匀，即得对比消结安提取物1。

[0027] 取对比消结安提取物1，加入淀粉5、滑石粉15，混匀，用90％乙醇制成颗粒，干燥，过筛，混匀，装入胶囊，即得对比消结安胶囊1。

[0028] 4、对比消结安提取物2和对比消结安胶囊2的制备

[0029] (1)、取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘药材，分别破碎、切制，制成净药材；

[0030] (2)、称取净药材功劳木1100、三叉苦750、益母草750、连翘750，投入多功能提取罐中，加入8倍量(V/W)的80％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，混匀，即得功劳木等四味提取物，备用；

[0031] (3)、另称取净药材鸡血藤750、土茯苓900，投入多功能提取罐中，加入8倍量(V/W)的80％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，真空干燥，粉碎，混匀，即得鸡血藤等二味提取物，备用；

[0032] (4)、将步骤(2)所得物功劳木等四味提取物和步骤(3)所得物鸡血藤等二味提取物混合均匀，即得对比消结安提取物2；

[0033] (5)、取对比消结安提取物2，加入淀粉5、滑石粉15，混匀，用90％乙醇制成颗粒，干燥，过筛，混匀，装入胶囊，即得对比消结安胶囊2。

[0034] 5、本消结安提取物和本消结安胶囊的制备

[0035] 取实施例1所得物作为本消结安提取物。取实施例10所得物为本消结安胶囊。

[0036] 6、不同样品有效成分含量对比测定

[0037] (1)盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量测定方法照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录VID)测定。

[0038] 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至3.0)(30∶70)为流动相，检测波长为346nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算不应低于3000。

[0039] 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品和盐酸巴马汀对照品各适量，加甲醇制成每1ml各含100μg的混合溶液，摇匀，即得。

[0040] 供试品溶液的制备取供试品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)混合溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷至室温，再称定重量，用盐酸-甲醇(1∶100)混合溶液补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液5ml，通过中性氧化铝柱(120目，6g，内径10～20mm，用甲醇预洗)，用甲醇100ml洗脱，收集流出液和洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0041] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0042] (2)盐酸水苏碱含量测定方法照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VI B薄层色谱扫 描法)测定。

[0043] 取供试品约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇溶液100ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，冷至室温，再称定重量，用70％乙醇溶液补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液75ml，通过预处理好的732H-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高12cm)，用水洗至流出液近无色，弃去水液，用氨溶液(4→13)250ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，取上清液，作为供试品溶液。另精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录VIB)试验，精密吸取供试品溶液
6μl，对照品溶液3μl与6μl，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-无水乙醇-盐酸(10∶6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热15分钟，放冷，喷以1％三氯化铁乙醇溶液-稀碘化铋钾试液(1∶10)混合溶液至斑点显色清晰，晾干，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱扫描法进行扫描，波长：λs＝510nm，测得供试品吸光度积分值与对照品吸光度积分值，计算，即得。

[0044] (3)连翘苷含量测定方法照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录VI D)测定。

[0045] 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为229nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。

[0046] 对照品溶液的制备取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀，即得。

[0047] 供试品溶液的制备取供试品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，通过中性氧化铝柱(120目，5g，内径10～20mm，用70％乙醇预洗)，用70％乙醇100ml洗脱，收集流出液和洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0048] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0049] (4)落新妇苷含量测定方法照高效液相色谱法(《中国药典》一部附录VI D)测定。

[0050] 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.3％冰醋酸溶液(35∶65)为流动相，检测波长为291nm。理论板数按落新妇苷峰计算应不低于3000。

[0051] 对照品溶液的制备取落新妇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

[0052] 供试品溶液的制备取供试品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0053] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0054] (5)不同样品中有效成分含量对比测定

[0055] 采用上述测定方法，分别测定了同一批药材采用不同制备方法制备的样品，结果见表1，样品间比较见表2。

[0056] 表1 本消结安提取物与国家标准消结安提取物和对比消结安提取物中有效成分测定结果

[0057]

[0058] 表2本消结安提取物与国家标准消结安提取物和对比消结安提取物各有效成分含量和转移率比较

[0059]

[0060] 上述测定和比较结果表明，国家标准制备方法制备的国家标准消结安提取物各有效成分的转移率都很低，转移率仅为3.2～53.6％，特别是落新妇苷、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀，仅仅为3.2～7.1％。与国家标准消结安提取物比较，采用80％乙醇作为提取溶剂制备的对比消结安提取物1的有效成分的含量和转移率有了提高，提高幅度在2.88～4.92倍之间(除盐酸水苏碱仅分别提高1.13、1.23倍外)。与对比消结安提取物1比较，采用80％乙醇作为提取溶剂，将药材分为2组，功劳木、三叉苦、益母草和连翘为一组，鸡血藤和土茯苓为另一组，制备的对比消结安提取物2，落新妇苷的含量和转移率有了较大幅度的提高，提高幅度分别为2.81、3.44倍，盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的含量和转移率也有了一些提高，提高幅度在1.11～1.66倍之间，而盐酸水苏碱和连翘苷的含量和转移率略有降低。

[0061] 与对比消结安提取物2比较，本消结安提取物除落新妇苷的含量和转移率二者基本一致外，其他各有效成分的含量和转移率又有了较大提高，提高幅度在1.19～1.38倍之间；与国家标准消结安提取物比较，本消结安提取物各有效成分的含量和转移率都有非常大提高，提高幅度在1.07～16.01倍之间，其中，以落新妇苷的含量和转移率提高幅度最大，分别达11.13、16.01倍，盐酸小檗碱次之，分别为7.61、10.92倍，盐酸水苏碱最低，也分别为1.07、1.49倍；从绝对值分析，本消结安提取物各有效成分的转移率都超过了50％，落新妇苷、盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的转移率在50.9～59.8％之间，盐酸水苏碱为80.0％，而连翘苷的转移率达到了99.7％。结果表明，与现有技术以及相关技术比较，本制备方法具有明显的突破。

[0062] 上述研究结果表明，本制备方法一方面通过提高总收率从而提高各有效成分转移率；另一方面，把药材按本制备方法分成2组分别提取，最大限度的降低了各成分在提取、浓缩、干燥过程中的沉淀、聚合、降解、氧化、还原等化学反应，从而提高各有效成分转移率；还有一方面就是，不同的药材组合、不同的提取溶剂，产生不同的提取环境，导致成分间增溶作用的不同，本消结安提取物连翘苷的转移率达到了99.7％，即是本制备方法具有最强增溶作用的有力证明。

[0063] 7、本消结安提取物与国家标准消结安提取物药效学对比研究

[0064] (1)药品、动物和仪器

[0065] ①受试药物

[0066] 国家标准消结安提取物，2.16g/人/日；本消结安提取物，同样按2.16g/人/日试验。实验时，本消结安提取物以人拟用量的20、10、5倍剂量设为药效实验的高、中、低剂量，国家标准消结安提取物按人用量的10倍剂量设为药效实验的对照组，用电子分析天平分别称取适量样品，于乳钵中加1％CMC-Na研磨后配制成相应浓度的混悬液(国家标准消结安提取物0.036g/ml，本消结安提取物0.076、0.036、0.018g/ml)供大鼠灌胃用，容量均为10ml/kg.bw。

[0067] ②对照药品与试剂

[0068] 三苯氧胺(枸橼酸他莫昔芬片)，国药准字H31021545，10mg/片，上海复旦复华药业有限公司生产，批号090801，用1％CMC-Na研磨后配制成0.2mg/ml的混悬液供阳性对照用；羧甲基纤维素纳盐(CMC-Na)，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20070826，用纯水加热、煮沸、冷却后配成1％浓度供受试样品配制及溶媒对照用。

[0069] 苯甲酸雌二醇注射液，5mg/ml/支，国药准字H12020530，天津金耀氨基酸有限公司，批号090706；黄体酮注射液，10mg/ml/支，国药准字H33020829，浙江仙琚制药股份有限公司，批号090903。雌二醇(E2，GD90711)、孕酮(P，20090801)放射免疫分析药盒，天津九鼎医学生物工程有限公司出品。

[0070] ③动物

[0071] 雌性SPF级SD大鼠，6～8周龄，体重180～220g，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证：SCXK(滇)2005-0008；饲养于IVC动物实验室，用塑料盒群养，每箱≤10只，每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料。

[0072] ④仪器

[0073] AL104型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；JJ2000型电子天平，常熟双杰测试仪器厂；F5810-R型台式高速冷冻离心机，eppendorf公司；FT-630G10探头r免疫计数器，北京261厂；ASP200脱水机、EG1160包埋机、RM2255切片机、DM6000显维镜，德国Leica公司；游标卡尺，东莞市斯帝尔精密仪器有限公司。

[0074] ⑤统计方法

[0075] 实验结果以均值±标准差 表示，用DAS ver1.0统计软件处理，方差齐用t检验，方差不齐用t’检验；等级资料用秩和检验。

[0076] (2)模型制备

[0077] 取雌性未生育大鼠80只，适应性饲养一周后，随机抽取15只为正常对照组，剩余65只动物每日1次于腿部肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5mg/kg.bw，连续25d。从第26[1]
日起，改用黄体酮注射液按5mg/kg/日剂量连续注射10d ；正常对照组大鼠每天肌注相应体积的生理盐水。造模35天，从模型动物和正常组中随机抽取5只脱颈椎处死，取其乳腺组织，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察乳腺组织，确认模型复制成功。

[0078] (3)分组给药

[0079] 将60只模型动物用游标卡尺测量第2对乳头直径，按体重和乳头直径随机分为6组：模型对照组；阳性对照三苯氧胺2mg/kg.bw组；国家标准消结安提取物0.36g/kg对照组；本消结安提取物0.72、0.36、0.18g/kg组；每组10只。各组动物每日分别按剂量灌胃给药一次，正常对照组和模型对照组灌服相同体积的1％CMC-Na，连续30天，容积均为10ml/kg.bw。每周称取体重一次，以调整给药剂量。

[0080] (4)指标检测

[0081] 于末次给药后24h(禁食不禁水12h)，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg.bw麻醉动物，腹主动脉取血3ml分离血清，用放射免疫法检测血清中雌二醇(E2)及孕酮(P)的含量；剖取双侧子宫和卵巢称重，计算脏器系数；用游标卡尺精确测量各鼠第二对乳头直径、高度，并完整分离该乳腺组织，于10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察乳[2]腺病理组织。将大鼠乳腺组织分为4类 ：无增生、轻度增生、中度增生、重度增生。

[0082] (5)实验结果：对各组大鼠乳头高度及直径的影响

[0083] 由表3可见，模型组大鼠乳头高度及直径明显高于正常对照组，各给药组均能明显降低模型大鼠的乳头高度(P＜0.05/0.01)；除国家标准消结安提取物对照组外，其余给药组还能明显缩小模型大鼠的乳头直径；其中，0.18g/kg本消结安提取物对乳头高度和直径的抑制作用比0.36g/kg国家标准消结安提取物强。

[0084] 表3本消结安提取物与国家标准消结安提取物对乳腺增生大鼠乳头高度及直径的影响

[0085]

[0086] 与正常组相比，△△P＜0.01；与模型组相比，*/**P＜0.05/0.01

[0087] (6)实验结果：对各组大鼠血清E2和P水平的影响

[0088] 由表4可见，与正常对照组相比，模型组大鼠血清雌激素(E2)水平明显升高、孕激素(P)水平显著下降；各给药组均能显著降低模型大鼠的E2水平，升高孕激素P水平(P＜0.05/0.01)，并呈一定的量效关系；其中，0.18g/kg本消结安提取物对雌激素(E2)的降低作用比0.36g/kg国家标准消结安提取物强，但对孕激素(P)的回调作用比国家标准消结安提取物弱。

[0089] 表4本消结安提取物与国家标准消结安提取物对乳腺增生大鼠血清E2和P水平的影响

[0090]△△ */**

[0091] 与正常组相比， P＜0.01；与模型组相比， P＜0.05/0.01

[0092] (7)实验结果：对各组大鼠乳腺病理组织的影响

[0093] 由表5可见，镜下观察可见各给药组乳腺小叶数及每个小叶内腺泡数多于正常乳腺，但远远少于模型组，腺泡及导管扩张、分泌情况也大为减轻。表5结果经Ridit检验，用药各组同模型组相比较均有显著性差异P＜0.01)，即有明显的治疗作用。

[0094] 表5本消结安提取物与国家标准消结安提取物对各组大鼠乳腺病理组织的影响[0095]

[0096]

[0097] (8)实验结果：对乳腺增生大鼠子宫、卵巢系数的影响

[0098] 由表6可见，与正常对照组相比，模型组大鼠子宫系数升高、卵巢系数下降；各给药组对上述变化有一定的改善趋势而无统计学差异。

[0099] 表6本消结安提取物与国家标准消结安提取物对乳腺增生大鼠子宫、卵巢系数的影响

[0100]

[0101] 与正常组相比，△P＜0.05；与模型组相比，P＞0.05

[0102] (9)小结

[0103] 乳腺增生病为一种妇女常见疾病，其病因目前尚不清楚，现代医学认为乳腺增生主要是与性激素失调、月经周期有密切关系，是由于孕激素与雌激素的比例失去平衡，孕激素分泌不足，雌激素相对或绝对过高，而缺乏孕激素的节制和保护作用，导致雌激素长期刺激乳腺，使其过度增殖，引起乳腺导管上皮和纤维组织不同程度的增生。本实验结果表明，本消结安提取物和国家标准消结安提取物均能明显抑制雌激素所致大鼠的乳房肿大，明显降低乳腺增生大鼠血清E2含量，升高P含量；明显降低镜下乳腺增生程度；对模型大鼠的子宫系数增加、卵巢系数降低有一定调整趋势。提示，本消结安提取物和国家标准消结安提取物对实验性大鼠乳腺增生均具有较好的治疗效果，其作用可能与调节性激素平衡、纠正内分泌失调有关；0.18g/kg本消结安提取物的总体疗效强于国家标准消结安提取物0.36g/kg，提示本消结安提取物因有效成分的富集而使药效提高，这同时表明，本制备方法一方面提取物总收率显著提高，另一方面本消结安提取物中有效成分含量高，药效比国家标准消结安提取物提高约一倍，这必将大大降低临床中原药材日服用量。

[0104] 8、本消结安提取物与国家标准消结安提取物毒性对比研究

[0105] 本消结安提取物(5.0、2.5g/kg分别为高低剂量组)与国家标准消结安提取物(5.0g/kg)分别连续灌胃给药31天小鼠亚急性毒性对比试验结果表明，与空白对照组比较，各组动物活动自如、皮毛光泽，各组对小鼠一般行为、摄食量、体重增长等无明显影响；对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、乳腺、子宫和卵巢等脏器系数未见明显影响；国家标准消结安提取物组肝功AST、ALT和肾功Cre有显著性升高，本消结安提取物高剂量组肾功Cre有显著性升高，综合评价为本消结安提取物与国家标准消结安提取物小鼠连续给药31天未见明显毒性反应，本消结安提取物安全性略好于国家标准消结安提取物。

[0106] 本发明的优点和效果如下：

[0107] 1、本发明根据消结安处方中各药材的化学成分及其性质，将全部药材分成特定的2部分分别用一定浓度的乙醇水溶液进行提取，所得消结安提取物制成的本消结安提取物，与国家标准制备方法——全部药材合并一起用水提取所得提取物制成的国家标准消结安提取物、全部药材合并一起用80％乙醇提取所得提取物制成的对比消结安提取物1和另一分组方法制成的对比消结安提取物2比较，各有效成分的含量和转移率都得到大幅度的提高。

[0108] 2、动物药效学对比研究结果表明，本消结安提取物和国家标准消结安提取物均能明显抑制雌激素所致大鼠的乳房肿大，明显降低乳腺增生大鼠血清E2含量，升高P含量；明显降低镜下乳腺增生程度；对模型大鼠的子宫系数增加、卵巢系数降低有一定调整趋势。
0.18g/kg本消结安提取物的总体药效强于国家标准消结安提取物0.36g/kg，证明本消结安提取物因有效成分的富集而使药效提高。

[0109] 3、亚急性毒性对比研究结果表明，本消结安提取物与国家标准消结安提取物小鼠连续灌胃给药31天未见明显毒性反应，本消结安提取物安全性略好于国家标准消结安提取物。

具体实施方式

[0110] 以下通过实施例对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。

[0111] 实施例1：(一)取功劳木、三叉苦、益母草、鸡血藤、土茯苓、连翘药材，分别破碎、切制，制成净药材；

[0112] (二)称取净药材功劳木1100份、三叉苦750份、益母草750份，投入多功能提取罐中，加入8倍量(V/W)的75％乙醇回流提取2次，每次1.5小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

[0113] (三)另称取净药材鸡血藤750份、土茯苓900份、连翘750份，投入多功能提取罐中，加入7倍量(V/W)的80％乙醇回流提取2次，每次2.5小时，滤过，得提取液，提取液减压回收乙醇并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，混匀，备用；

[0114] (四)将步骤(二)和步骤(三)所得物混合均匀，即得本消结安提取物。

[0115] 实施例2：实施例1中所述提取溶剂75％、80％乙醇均更换为95％乙醇，其它同实施例1。

[0116] 实施例3：实施例1中所述提取溶剂75％、80％乙醇均更换为50％乙醇，其它同实施例1。

[0117] 实施例3：实施例1中所述提取溶剂75％、80％乙醇均更换为70％乙醇，其它同实