水稻RR17启动子及其应用

摘要

本发明公开了一种水稻RR17启动子及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，OsRR17基因启动子OsRR17p可以在水稻茎生根起始特异性表达可以用来研究及改善植物根系的发育和对不同土壤环境的适应，最终达到提高产量的目的。

权利要求

1.DNA片段，为序列表的序列1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.扩增权利要求1中所述DNA片段的引物对，所述引物对中的一条引物的序列为序列

2，另一条引物的序列为序列3。

4.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在水稻茎生根起始部位表达中的应用。

说明书

水稻RR17启动子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种水稻RR17启动子及其应用，尤其涉及一种具有特异表达启动子功能的DNA片段及其应用。

背景技术

[0002] 植物的根有两个主要的基本功能：从土壤中吸收水份、营养和固定作用。通过对拟南芥模式植物的研究，人们对调控拟南芥等双子叶植物根的遗传因子有了深入的了解。但水稻等单子叶植物的根系与拟南芥有着本质的区别。双子叶植物的生命中起主要作用的是由胚胎发育来的主根。而对于水稻，胚胎发育来的主根只在早期起到重要的作用，种子发芽后的几个星期，茎生根将代替胚胎发育来的主根起主要作用。从起始的机制来讲，茎生根是胚胎后发育来的，因此不能通过同源比对的方式从拟南芥中找到茎生根起始需要的基因。

[0003] 细胞分裂素是植物的五大经典激素之一，它调控了植物生长发育的各个方面。主要通过对模式植物拟南芥的研究，对细胞分裂素信号转导途径已有了部分了解。细胞分裂素的信号转导是由一种类似于细菌和酵母中的双元组份系统(two-component system)介导的，这个系统包括组氨酸激酶(Histidine Kinases，HKs)，磷酸转运蛋白(Histidine-Phosphotransfer proteins，HPs)和反应调节因子(Response Regulators，RRs)。在模式植物拟南芥中，ARR(Arabidopsis Response Regulators)是双元组分系统的最下游因子，也是其主要功能行使元件。现在已知的拟南芥ARR基因共有24个。根据它们序列的相似程度，功能结构域以及对细胞分裂素的反应，可以将ARR大致分为三类：即A型(10个，包括ARR3-ARR9，ARR15-ARR17)、B型(12个，包括ARR1，ARR2，ARR10-ARR14，ARR18-ARR21和ARR23)以及非典型的ARR22和ARR24。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种具有特异表达启动子功能的DNA片段及其应用。

[0005] 本发明提供的DNA片段(OsRR17基因启动子OsRR17p)，来源于水稻(Oryza sativaL.japonica.cv Nipponbare)，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

[0006] 1)序列表的序列1所示的DNA分子；

[0007] 2)在严格条件下与1)所述DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

[0008] 3)与1)中所述DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。序列1由2455个核苷酸组成。

[0009] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0010] 含有以上任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

[0011] 所述重组载体具体为将OSRR17p插入在pC1300-GUS-NOS的PstI和SalI识别位点间获得的重组载体，所述pC1300-GUS-NOS为将pBI121经SmaI和EcoRI酶切后得到的小片段插入pCAMBIA1300双元载体的SmaI和EcoRI识别位点得到的载体。

[0012] 扩增以上任一所述DNA片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0013] 所述引物对中的一条引物的序列为序列2，另一条引物的序列为序列3。

[0014] 上述DNA片段在使目的基因在植物茎基部节中的表达中的应用也是本发明保护的范围。

[0015] 上述应用中，所述植物茎基部节为茎生根的起始部位。

[0016] 上述应用中，所述植物为单子叶植物。

[0017] 上述应用中，所述单子叶植物为水稻。

[0018] 上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也是本发明保护的范围。

[0019] 所述植物为单子叶植物；所述单子叶植物优选为水稻。

[0020] 本发明的实验证明，OsRR17基因启动子OsRR17p可以在水稻茎生根起始特异性表达，可以用来研究及改善植物根系的发育和对不同土壤环境的适应，最终达到提高产量的目的。对于一些易倒伏的水稻品种，也可以用茎生根特异性表达的启动子来调控抗倒伏基因的表达，增加水稻的抗倒伏能力，然而对水稻的叶片和种子品质没有影响。启动子的发现和其表达模式及功能的阐明，在植物发育调控和生物技术育种中均具有重要意义，为今后在植物茎基部节中特异性表达外源基因提供了新型有效的启动子或顺式元件。

[0021] 本实验的研究结果表明细胞分裂素抑制了茎生根的起始，由于A型ARR基因家族的功能特异性可能决定了细胞分裂素调控植物生长发育信号途径的专一性，因此通过检测水稻细胞分裂素反应调节因子OsRR的时空表达模式，发现OsRR17是水稻茎基部节特异表达的基因，因此从水稻中克隆出OsRR17基因的启动子，并通过GUS报告基因检测了该启动子的时空表达模式，发现该启动子在水稻茎生根起始的部位(即茎基部节)特异性表达，因此该启动子将为植物代谢的精细调控和生物工程提供强有力的工具，具有重要的理论及现实意义。

附图说明

[0022] 图1为细胞分裂素抑制茎生根的起始

[0023] 图2为OsRR17的RT-PCR结果

[0024] 图3为pC1300-OSRR17p::GUS-NOS质粒图谱

[0025] 图4为OsRR17p::GUS转基因植物的GUS活性

具体实施方式

[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0028] 在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系DH5α；农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EAH105；克隆载体pGEM-T Easy和连接酶(Promega)；限制性内切酶(NEW ENGLAND BioLabs)；质粒pBI121(Clontech)，双元载体pCAMBIA 1300(Cambia，在T-DNA左右边界区内带有可供植物选择用潮霉素抗性基因)；水稻品种日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv Nipponbare)。

[0029] 实施例1、转OsRR17p水稻的构建

[0030] 1、细胞分裂素抑制水稻茎生根的起始

[0031] 水稻品种日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv Nipponbare；Fang J.，Chai C.，Qian Q.，Li C.，Tang J.，Sun L.，Huang Z.，Guo X.，Sun C.，Liu M.，Zhang Y.，Lu Q.，Wang Y.，Lu，C，Han B.，Chen F.，Cheng Z.，Chu C.(2008)Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and photo-oxidation in rice，Plant Journal，54：177-189.公众可从中国科院遗传与发育生物学研究所获得。)用20％漂白水灭菌20分钟后，用无菌水冲洗3遍。然后在含有1％蔗糖的1/2MS培养基(Sigma-Aldrich公司，Cat#：M5524)上发芽，植物生长条件为：28℃，连-2 -1续光照，光照强度为80-120阳ol·m .sec 。4天后观察茎生根的生长(图1A)。通过解剖发现茎生根起始于茎基部的节(Basal node)(图1B)。当外源施加1μM的6-BA(一种常用的人工合成细胞分裂素)，可见的茎生根明显减少(图1C)，在含有5μM 6-BA的1/2MS培养基上，完全观察不到茎生根(图1D)。为了检测细胞分裂素是否抑制了茎生根的起始，对茎基部做了半薄切片。在没有细胞分裂素处理的水稻中，能够清晰可见茎生根的起始(图
1F和G中的红色箭头)，然而5μM细胞分裂素处理后，完全没有茎生根的起始(图1H、I和J)。图1为细胞分裂素抑制茎生根的起始，其中解剖图片中的标尺为0.5mm，半薄切片中的标尺为100μm。

[0032] 半薄切片：水稻的茎基部固定在含有4％戊二醛的PBS过夜，用Leica historesin包埋后，使用Leica RM6625切片机得到4μm的半薄切片，然后通过甲苯胺兰(0.1％w/v)染色，在光学显微镜(Olympus BX51)下观察。

[0033] 2、筛选在茎基部节中特异表达的细胞分裂素反应调节因子OsRR

[0034] 引物序列：

[0035] Name ID Primer sequence

[0036] OsRR17-F LOC_Os04g28120 AGTTCCTCGAAGCTGCAAGAGTGA[0037] OsRR17-R LOC_Os04g28120 AGGCACTACATGACCATCACCACT[0038] RNA提取

[0039] TRIzol法：参照厂商(Invitrogen)提供的使用说明进行。首先预冷研钵、研杵、1.5ml离心管和TRIzol试剂。分别取水稻品种日本晴叶子、主根、侧根和茎基部节组织各
100mg，用液氮快速粉碎，转移至预冷的离心管。加入1ml TRIzol试剂，振荡混匀。室温放置
5分钟，4℃12000g离心10分钟。取上清移入新离心管，加入200μl氯仿，轻摇混匀。室温放置3分钟，4℃12000g离心10分钟。取上层水相移入新管，加入250μl异丙醇和250μl高盐沉淀剂(0.8M柠檬酸钠，1.2M氯化钠)，室温放置3分钟，4℃12000g离心10分钟，去除上清。沉淀用1ml 75％乙醇洗涤，4℃7500g离心5分钟，去除上清。沉淀于室温干燥5-10分钟，加入适量(50μl左右)DEPC水溶解(为了有利于RNA溶解，可置于50℃水浴10-30分钟)获得RNA。

[0040] cDNA反转录：

[0041] cDNA第一链的合成：

[0042] (1)取上述提取的RNA 1-2μg，加DEPC水至10μl；

[0043] (2)加入1μl(0.5g)Oligo(dT)15和1μl 10mM dNTP，混匀；

[0044] (3)65 ℃，5分 钟，然 后 放 在 冰 上，快 速 加 入：5×buffer 4μl，RNAse inhibitor1μl，0.1M DTT 2μl，5U/μl反转录酶H 0.5μl；

[0045] (4)反转录反应(cDNA第一链合成)在PCR仪上进行，使用如下程序：

[0046] 先42℃，50分钟；再45℃，10分钟；再50℃，10分钟；再70℃，15分钟；

[0047] (5)反应结束之后快速取出，冰上加入10mg/ml 1μl RNase，然后在37℃放置30-60分钟，获得cDNA。

[0048] PCR扩增：

[0049] PCR反应体系(20μl)：模板DNA 1μl；10×buffer 2μl；2.5mM dNTP 2μl；10μM primers 2μl；超纯水12.8μl；5U/μl Taq DNA聚合酶0.2μl。

[0050] PCR扩增程序为：先94℃预变性2min；再94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延长1min，循环数从22到34不等；然后再72℃延长10min；4℃保存。

[0051] 所用PCR仪型号为Whatman Biometra T Gradient 96和MJ PTC-200。

[0052] 结果见图2，可以看出OSRR17p特异的在茎基部节中表达。

[0053] 3、转OSRR17p水稻的获得

[0054] 提取水稻日本晴幼苗的基因组DNA作为模板，用引物OsRR17p-F(ctgcagGTGAATCTCCATCCGTAGTTG，小写字母为PstI酶切位点，序列2)和OsRR17p-R(gtcgacGTGTCCTACCCTTTGAGCCA，小写字母为SalI酶切位点，序列3)PCR扩增，得到的PCR产物连接到中间载体pGEM-T Easy上，获得pT-OsRR17p，经测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸，大小为2455bp，该PCR产物的基因命名为OsRR17p。同时，用SmaI和EcoRI对pBI121(Clontech)双酶切得到的小片段插入pCAMBIA1300(Cambia)双元载体的SmaI和EcoRI识别位点间得到pC1300-GUS-NOS。然后用PstI和SalI双酶切上述获得的pT-OSRR17p得到的小片段插入pC1300-GUS-NOS的PstI和SalI识别位点间，得到pC1300-OSRR17p::GUS-NOS，其质粒结构模式如图3所示，其中35S-pro指35S CaMV启动子；Nos-ter为NOS终止子；Hygromycin为潮霉素筛选抗性基因；GUS为E.coliβ-葡萄糖苷酸酶报告基因。

[0055] 将质粒pC1300-OSRR17p::GUS-NOS导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EAH105(上海鼎国生物)中，再进行PCR鉴定，引物OsRR17p-F和OsRR17p-R，得到大小为2455bp的片段为含有质粒pC1300-OSRR17p::GUS-NOS的农杆菌，命名为EAH105/pC1300-OSRR17p::GUS-NOS；再将EAH105/pC1300-OSRR17p::GUS-NOS与野生型日本晴的愈伤组织在共培养培养基上28℃共培养2天后，愈伤组织转移到含有50mg/l的潮霉素抗性筛选培养基中，28℃暗培养14天后，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织转至含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h光照条件下培养，30-40天后分化出小苗。将小苗移到生根培养基上培养两周左右移土继续生长，此转化共获得5株T0代转OSRR17p::GUS水稻。

[0056] 以上涉及的培养基配方如下：

[0057] (1)NB基本培养基

[0058]名称 含量
KNO3 2830mg/L
(NH4)2SO4 463mg/L
KH2PO4 400mg/L
MgSO4.7H2O 185mg/L
CaCl2.2H2O 166mg/L
FeSO4.7H2O 27.8mg/L
Na2EDTA 37.5mg/L
MnSO4.4H2O 10mg/L
H3BO3 3mg/L
ZnSO4.7H2O 2mg/L
Na2MoO4.2H2O 0.25mg/L
CuSO4.5H2O 0.025mg/L
CoCl2.6H2O 0.025mg/L
KI 0.75mg/L
盐酸硫胺素 10mg/L
盐酸吡哆醇 1mg/L
烟酸 1mg/L
肌醇 100mg/L
水解酪蛋白 300mg/L
谷氨酰胺 500mg/L
脯氨酸 500mg/L
蔗糖 30,000mg/L
植物凝胶 2.6mg/L
pH 5.8

[0059] (2)水稻愈伤诱导及继代培养基

[0060]NB
2，4-D 0.002g/L
谷氨酰胺 0.5g/L
脯氨酸 0.5g/L
酪蛋白 0.3g/L
蔗糖 30g/L
植物凝胶 2.6g/L
pH 5.8

[0061] (3)共培养培养基

[0062]NB(不包括谷氨酰胺和脯氨酸)
2，4-D 2mg/L
肌醇 2mg/L
乙酰丁香酮 15mg/L
pH 5.5-5.2

[0063] (4)抗性筛选培养基

[0064]NB
2，4-D 2mg/L
cefotaxine(头孢霉素) 500mg/L
hygromycin B(潮霉素) 50mg/L
pH 5.8

[0065] (5)水稻分化培养基

[0066]NB
BA 0.002g/L
NAA 0.0005g/L
蔗糖 30g/L
植物凝胶 3g/L
pH 5.8

[0067] (6)水稻生根培养基

[0068]1/2NB无机盐
1/2B5有机
蔗糖 12g/L
植物凝胶 2.6g/L
pH 5.8

[0069] 5、鉴定

[0070] 经过抗性筛选，鉴定了5株阳性T0代转OSRR17p::GUS水稻。然后对上述获得的5株阳性T0代转OSRR17p::GUS水稻进行PCR鉴定，引物为p1300F(5‘ATCGGTGCGGGCCTCTTC)和OsRR17p-R(5‘gtcgacGTGTCCTACCCTTTGAGCCA)，模板为5株阳性T0代转OSRR17p::GUS水稻的叶的基因组DNA，得到PCR产物大小为2575bp为阳性植株，又将PCR产物测序分析，具有序列表中序列1的核苷酸，因此进一步确认获得5株阳性T0代转OSRR17p::GUS水稻。

[0071] 从阳性T0代转OSRR17p::GUS水稻收获种子，播种后获得T1代转OSRR17p::GUS水稻，从T1代转OSRR17p::GUS水稻上收获种子，播种后获得T2代转OSRR17p::GUS水稻纯合系，从T2代转OSRR17p::GUS水稻上收获种子，播种后获得T3代转OSRR17p::GUS水稻纯合系。

[0072] 采用同样的方法将空载体pC1300-GUS-NOS导入野生型日本晴中，获得T0代转空载体水稻，用上述同样的方法获得T3代转pC1300-GUS-NOS水稻。

[0073] 实施例2、转OSRR17p::GUS水稻GUS染色分析

[0074] GUS染色：把10天大小的日本晴和编号为5的T3代转OSRR17p::GUS水稻纯合株系的整个幼苗浸泡在GUS染色液中37℃放置6-12小时，70％乙醇脱色后用体视镜(Olympus SZX12)进行拍照。以T3代转pC1300-GUS-NOS水稻水稻和野生型日本晴为对照。

[0075] GUS染色液：100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，10mM EDTA，1mM K4Fe6，1mM K3(FeCN)6，0.1％(v/v)Triton X-100，1mM X-gluc。

[0076] 结果如图4所示，通过对10天大小的T3代转OSRR17p::GUS水稻的GUS染色发现，只有茎基部节能被GUS染色(图4A和B)；进一步徒手解剖发现GUS染色主要在节的下部，即茎生根起始的部位(图4C)；当从节上分离一个茎生根时，分离下来茎生根起始部位是能被GUS染色的(图4D)。图4为转OsRR17p::GUS植物的GUS活性，其中箭头表示有GUS活性的部位。图中白色标尺为1mm。

[0077] 对野生型日本晴GUS染色发现，植株各个组织器官均不能被GUS染色。

[0078] 综合以上的结果，说明OsRR17的启动子能特异的在茎生根起始的部位中表达，并调控了根的发育。

[0079] 实施例3、OsRR17启动子顺式作用元件的分析

[0080] 为了更好的了解OsRR17的启动子功能，将OsRR17的启动子OsRR17p在PLACE (aDatabase of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)上做了顺式作用元件的分析。

[0081] 表2：OsRR17启动子顺式作用元件。

[0082]Factor Location Strand Signalsequence
Cytokinin targeting sequence 132 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 144 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 217 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1690 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1719 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1781 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 507 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 545 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 574 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1170 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 732 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1941 (+) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 4 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 338 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 368 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 386 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 672 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1038 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1152 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1313 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1459 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 1935 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 2024 (-) (G/A)GAT(T/C)
Cytokinin targeting sequence 2413 (-) (G/A)GAT(T/C)
TATABOX2 1106 (+) TATAAAT
TATABOX2 2215 (+) TATAAAT
TATABOX2 2352 (+) TATAAAT
TATABOX2 2150 (-) TATAAAT
TATABOX2 2222 (-) TATAAAT
TATABOX4 353 (+) TATATAA
TATABOX4 1071 (+) TATATAA
TATABOX4 1070 (-) TATATAA
TATABOX4 2047 (-) TATATAA
TATABOX4 2152 (-) TATATAA
TATABOX5 136 (+) TTATTT
TATABOX5 1184 (+) TTATTT
TATABOX5 1920 (+) TTATTT
TATABOX5 301 (-) TTATTT
TATABOX5 1275 (-) TTATTT