用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置及其应用转让专利
申请号 : CN201010228760.X
文献号 : CN101904294B
文献日 : 2012-03-21
发明人 : 许卫锋 , 施卫明
申请人 : 中国科学院南京土壤研究所
摘要 :
用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，包括培养箱盖板和箱体，所述培养箱盖板上设有培养孔阵列，培养孔内设有种苗管；所述箱体的侧壁上设有遮光板，遮光板与箱体活动连接。与传统方法相比，新方法有以下优点：1)新方法能在自然的条件下筛选转基因拟南芥株T2代种子，不必像传统方法那样需在无菌的条件下筛选，既省时又省力；2)新方法为原位筛选方法，不必像传统方法那样需将抗性苗从无菌的生长环境转移到蛭石或其它生长环境，不会造成苗的丢失；3)新方法筛选的抗性苗生长势好于传统方法，为较早获得转基因纯合系(T3代种子)赢得了时间。
权利要求 :
1.用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，其特征在于包括培养箱盖板(1)和箱体(2)，所述培养箱盖板(1)上设有培养孔(3)阵列，培养孔内设有种苗管(4)；所述箱体(2)的侧壁上设有遮光板(8)，遮光板与箱体活动连接；还包括增氧泵和pH调节装置，增氧泵与pH调节装置分别与箱体连接。
2.根据权利要求1所述的用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，其特征在于所述培养箱盖板表面的相邻两条边上根据孔的位置设有坐标刻度。
3.根据权利要求1所述的用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，其特征在于所述箱体(2)的侧壁由透光材料(5)和不透光材料(6)上下拼接而成，箱体四周透光材料侧壁的上下沿设有滑槽(7)，遮光板(8)在滑槽(7)内滑动，透光材料侧壁上设有刻度(9)用以测量根系生长长度；不透光材料侧壁上设有增氧泵接口(10)和pH调节装置接口(11)。
4.根据权利要求1所述的用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，其特征在于所述种苗管为漏斗结构，高10mm，上底面直径9mm，下底面直径5mm。
5.根据权利要求1所述的用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，其特征在于所述箱体尺寸为30×20×20cm。
6.上述任一权利要求所述装置在转基因拟南芥种苗原位筛培中的应用，其特征在于：
将加热融解的含有0.6wt％琼脂的MS培养基灌入种苗管，待冷却后用薄膜盖上放于4℃环-1
境中，用于筛选的种苗管中含有50μg mL 卡那霉素；在播种之前，盛放营养液的箱体内装满MS培养液，并将种苗管放于培养箱盖板上的培养孔中；然后，将转基因拟南芥种子播于种苗管表面；出苗后，具有绿叶和长根的拟南芥为抗性苗，黄叶和短根的为非抗性苗；筛除非抗性苗，而含抗性苗的种苗管继续放置于装满MS培养液培养箱上培养，在此期间通过拉开遮光板，监测拟南芥根系长度，以判断转基因拟南芥的生长情况，并开通增氧泵和pH调节装置实时调控培养箱中营养液的氧气含量和pH值，使pH稳定在5.8，直到转基因拟南芥的开花结种。
说明书 :
用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置及其应用
一、技术领域
[0001] 本发明属于转基因拟南芥的培育技术领域，特别涉及一种用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置及其应用。二、背景技术
[0002] 拟南芥为植物科学研究的模式植物，将外源基因过量表达在拟南芥体内，已成为人们研究基因功能的基本手段之一。蘸花法是获得转基因拟南芥的简便方法之一，它不需要通过组织培养的手段非常方便地获得转基因拟南芥T1代种子(Weigel D，Glazebrook J.2002.Arabidopsis：A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.)。然而该方法筛选转基因拟南芥T2代种子非常繁琐，主要有如下缺点：1)T2代种子必须在无菌条件下的卡那霉素生长板上进行筛选。这一步对无菌操作要求较高，万一不小心污染了卡那霉素生长板，整个生长板拟南芥幼苗都不能使用。2)T2代种子在卡那霉素生长板生长7天后，一般都要将抗性苗移栽到蛭石为生长介质生长杯中，有一部分苗会在移栽这一步丢失。同时，这一步也会使幼苗需要较长的适应时间。因此，有必要建立筛选和培养转基因拟南芥T2代种子的新方法。三、发明内容
[0003] 发明目的：针对上述技术缺陷，本发明提供一种用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置及其应用，提高了转基因拟南芥种苗的培育效率，利用该装置的筛选体系移动方便、便于操作、容易建立，且设备构建的成本低，尤其对筛培转基因拟南芥T2代种子的更为方便。
[0004] 技术方案：用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，包括培养箱盖板和箱体，所述培养箱盖板上设有培养孔阵列，培养孔内设有种苗管；所述箱体的侧壁上设有遮光板，遮光板与箱体活动连接。
[0005] 上述装置还包括增氧泵和pH调节装置，增氧泵与pH调节装置分别与箱体连接。
[0006] 上述培养箱盖板表面的相邻两条边上根据孔的位置设有坐标刻度。
[0007] 上述箱体的侧壁由透光材料和不透光材料上下拼接而成，箱体四周透光材料侧壁的上下沿设有滑槽，遮光板在滑槽内滑动，透光材料侧壁上设有刻度用以测量根系生长长度；不透光材料侧壁上设有增氧泵接口和pH调节装置接口。
[0008] 上述种苗管为漏斗结构，高10mm，上底面直径9mm，下底面直径5mm。
[0009] 上述盛放营养液的容器尺寸为30×20×20cm。
[0010] 上述装置在转基因拟南芥种苗原位筛培中应用，方法为：将加热融解的含有0.6wt％琼脂的MS培养基灌入种苗管，待冷却后用薄膜盖上放于4℃环境中，用于筛选的种-1
苗管含有50μg mL 卡那霉素；在播种之前，盛放营养液的箱体内装满MS培养液，并将种苗管放于培养箱盖板上的培养孔中；然后，将转基因拟南芥种子播于种苗管表面；出苗后，具有绿叶和长根的拟南芥为抗性苗，黄叶和短根的为非抗性苗；筛除非抗性苗，而含抗性苗的种苗管继续放置于装满MS培养液培养箱上培养，在此期间通过拉开遮光板，监测拟南芥根系长度，以判断转基因拟南芥的生长情况，并开通增氧泵和pH调节计实时调控培养箱中营养液的氧气含量和pH值，使pH稳定在5.8，直到转基因拟南芥的开花结种。
苗管含有50μg mL 卡那霉素；在播种之前，盛放营养液的箱体内装满MS培养液，并将种苗管放于培养箱盖板上的培养孔中；然后，将转基因拟南芥种子播于种苗管表面；出苗后，具有绿叶和长根的拟南芥为抗性苗，黄叶和短根的为非抗性苗；筛除非抗性苗，而含抗性苗的种苗管继续放置于装满MS培养液培养箱上培养，在此期间通过拉开遮光板，监测拟南芥根系长度，以判断转基因拟南芥的生长情况，并开通增氧泵和pH调节计实时调控培养箱中营养液的氧气含量和pH值，使pH稳定在5.8，直到转基因拟南芥的开花结种。
[0011] 有益效果：与传统装置和方法相比，新的装置可以实现原位筛选，装置与增氧泵和pH调节装置联用，组成了完整的培养系统，可以根据所培养的植物生长要求实时调节培养条件，培养箱盖板上设有的坐标系可以方便实验者记录实验细节，准确定位每个培养箱盖板上的种苗，箱体由两种透光性能的材料组成，需要与箱体连接的设备均可以通过下层的不透光材料进行连接，避免了接口处漏光对植物生长造成的不良影响，透光材料部分可以方便实验者观察植物根系的生长，从而判断植物的长势，透光材料部分还附加有遮光板，遮光板有自己独立滑槽，当实验人员观察完毕后，可以还原根系生长所需的黑暗环境，尽可能少的减少光对植物的影响；新方法有以下优点：1)新方法能在自然的条件下筛选转基因拟南芥株T2代种子，不必像传统方法那样需在无菌的条件下筛选，既省时又省力；2)新方法为原位筛选方法，不必像传统方法那样需将抗性苗从无菌的生长环境转移到蛭石或其它生长环境，不会造成苗的丢失；3)新方法筛选的抗性苗生长势好于传统方法，为较早获得转基因纯合系(T3代种子)赢得了时间。四、附图说明
[0012] 图1原位筛培装置；图中培养箱盖板1、箱体2、培养孔3、种苗管4、透光材料5、不透光材料6、滑槽7、遮光板8、刻度9、增氧泵接口10、pH调节装置接口11；
[0013] 图2用原位筛培装置筛选的30天苗龄拟南芥抗性苗体内At-L23a基因的表达；At-L23a基因的表达结果表明Real-time RT-PCR的试验体系可靠、准确；【用原位筛培装置获得的30天苗龄拟南芥抗性苗体内At-L23a基因的表达。REU(相对表达单位)，为At-L23a基因的拷贝数与看家基因At-ACT2拷贝数的比值再乘以100所得的数值。】
[0014] 图3用原位筛培装置筛选的30天苗龄拟南芥抗性苗体内TFT7基因的表达；TFT7基因(番茄的14-3-3基因)的表达结果表明，9株拟南芥抗性苗都含有转化的外源基因，都为阳性；【用原位筛培装置获得的30天苗龄拟南芥抗性苗体内TFT7基因的表达。REU(相对表达单位)，为TFT7基因的拷贝数与看家基因At-ACT2拷贝数的比值再乘以100所得的数值。】五、具体实施方式
[0015] 下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利要求范围内。
[0016] 实施例1：
[0017] 种苗管和用于原位筛培的培养箱装置，种苗管为倒圆台形，种苗管覆于盛放营养液的培养箱装置之上，其上设有若干圆形培养孔，种苗管可插入并固定在培养孔中；培养箱底部有增氧泵和pH调节接口，可以接入增氧泵和pH调节计，以不断向培养箱中营养液充氧和实时调控营养液的pH值，这样可以使拟南芥根系生长环境氧气充足以及生长所需pH值稳定；培养箱的四面由通明材质制成，每面上标有刻度并由遮光板挡住，当需要监测拟南芥根系生长时，拉开遮光板就可以直接观察拟南芥的根系生长情况并根据刻度读出根系的长度；用遮光板的目的是：拟南芥根系如果长期见光则生长不好，那么平时用遮光板挡住光，当需要观察根系生长时，拉开遮光板就可以监测根系生长情况后，然后再关上遮光板。
[0018] 实施例2：
[0019] 用于转基因拟南芥种苗原位筛培的装置，包括培养箱盖板1和箱体2，所述培养箱盖板1上设有培养孔3阵列，培养孔内设有种苗管4；所述箱体2的侧壁上设有遮光板8，遮光板与箱体活动连接。还包括增氧泵和pH调节装置，增氧泵与pH调节装置分别与箱体连接。所述培养箱盖板表面的相邻两条边上根据孔的位置设有坐标刻度。所述箱体2的侧壁由透光材料5和不透光材料6上下拼接而成，箱体四周透光材料侧壁的上下沿设有滑槽7，遮光板8在滑槽7内滑动，透光材料侧壁上设有刻度9用以测量根系生长长度；不透光材料侧壁上设有增氧泵接口10和pH调节装置接口11。所述种苗管为漏斗结构，高10mm，上底面直径9mm，下底面直径5mm。所述盛放营养液的容器尺寸为30×20×20cm。
[0020] 上述装置在转基因拟南芥种苗原位筛培中应用，方法为：将加热融解的含有0.6wt％琼脂的MS培养基灌入种苗管，待冷却后用薄膜盖上放于4℃环境中，用于筛选的种-1
苗管含有50μg mL 卡那霉素；在播种之前，盛放营养液的箱体内装满MS培养液，并将种苗管放于培养箱盖板上的培养孔中；然后，将转基因拟南芥种子播于种苗管表面；出苗后，具有绿叶和长根的拟南芥为抗性苗，黄叶和短根的为非抗性苗；筛除非抗性苗，而含抗性苗的种苗管继续放置于装满MS培养液培养箱上培养，在此期间可随时拉开遮光板，监测拟南芥根系长度，以判断转基因拟南芥的生长情况，并开通增氧泵和pH调节计实时调控培养箱中营养液的氧气含量和pH值，使pH稳定在5.8，直到转基因拟南芥的开花结种。
苗管含有50μg mL 卡那霉素；在播种之前，盛放营养液的箱体内装满MS培养液，并将种苗管放于培养箱盖板上的培养孔中；然后，将转基因拟南芥种子播于种苗管表面；出苗后，具有绿叶和长根的拟南芥为抗性苗，黄叶和短根的为非抗性苗；筛除非抗性苗，而含抗性苗的种苗管继续放置于装满MS培养液培养箱上培养，在此期间可随时拉开遮光板，监测拟南芥根系长度，以判断转基因拟南芥的生长情况，并开通增氧泵和pH调节计实时调控培养箱中营养液的氧气含量和pH值，使pH稳定在5.8，直到转基因拟南芥的开花结种。
[0021] 实施例3：
[0022] Real-time RT-PCR(实时荧光定量PCR)
[0023] 我们用自己建立的Real-time RT-PCR体系进行试验分析(Xu and Shi，Annals of Botany，2006，98：965-974).所用的引物见表1。At-ACT2是拟南芥体内高度保守的看家基因，我们将的它的表达水平定为100REU(相对表达单位)。为了验证我们提取的总RNA是否降解，我设计At-ACT2基因的两对引物。另外，我们又选择了At-L23a(拟南芥体内另一个高度保守的看家基因)作为对照。
[0024] 表1 Real-time RT-PCR所用的引物
[0025]
[0026] 植物生长分析
[0027] 鲜重于取样后立即称量，干重、叶绿素含量、蛋白质浓度测定的方法见我们自己发表的文章(Xu and Shi，Plant and Soil，2007，301：17-28)。
[0028] 统计分析
[0029] 用SPSS13.0 Duncan’s Multiple Range Test进行统计分析(P＜O.05)。
[0030] 结果与讨论
[0031] 新方法可以同传统方法一样准确地筛选转基因拟南芥T2代种子
[0032] 利用卡那霉素筛选转基因拟南芥已经被广泛采用。为了检验新方法体系卡那霉素的筛选准确性，我们分析了野生型拟南芥和转基因拟南芥株系K5的T2代种子分别在卡那霉素板(传统方法)和含卡那霉素种苗管的原位筛培装置(新方法)上的萌发情况。两种情况会导致卡那霉素筛选失败：1)卡那霉素筛选压力太高，容易将抗性苗杀死；2)卡那霉素筛选压力较低，容易出现假阳性(非抗性苗没被杀死)。我们的结果表明，新方法体系卡那霉素筛选没有出现上述任何一种情况(表2和图3)。
[0033] 为了检验新方法体系卡那霉素筛选压力是否太高，我们比较了新方法和传统方法的萌发率和分离率。结果表明，在正常生长条件下，无论是新方法体系还是传统方法体系，野生型拟南芥和转基因拟南芥株系K5植株长的都很好。同时，转基因拟南芥株系K5种子的萌发率和野生型一样。在卡那霉素筛选条件下，无论是新方法体系还是传统方法体系，野生型拟南芥都被杀死。同时，对于拟南芥株系K5种子而言，两种方法产生相同的分离率(3∶1)。这些结果显示，新方法和传统方法一样卡那霉素筛选压力不高，没有将抗性苗杀死。
[0034] 表2新方法和传统方法的体系下，野生型拟南芥和转基因拟南芥株系K5的T2代种子的萌发率和分离率
[0035]
[0036]
[0037] 备注：(1)表中的数据是拟南芥种子萌发7天后的数据。(2)WTP，长在传统筛选装置上的野生型拟南芥；WTS，长在原位筛培装置上的野生型拟南芥；K5P，长在传统筛选装置R上的转基因拟南芥；K5S，长在原位筛培装置上的转基因拟南芥；(3)Kan，具有抗卡那霉素S
特性的拟南芥；Kan，不具有抗卡那霉素特性的拟南芥；Ratio tested(R∶S)，抗卡那霉素拟南芥的数目与不抗卡那霉素拟南芥的数目的比值。
特性的拟南芥；Kan，不具有抗卡那霉素特性的拟南芥；Ratio tested(R∶S)，抗卡那霉素拟南芥的数目与不抗卡那霉素拟南芥的数目的比值。
[0038] 我们分析了新方法体系卡那霉素筛选压力是否较低，试验手段使用Real-time RT-PCR技术。试验材料为随机选择新方法体系下筛选的9株的抗性苗(30天苗龄且在含卡那霉素种苗管上正常生长的拟南芥幼苗)。结果显示：1)At-L23a基因的表达结果表明我们Real-time RT-PCR的试验体系可靠、准确(图2)；2)TFT7基因(番茄的14-3-3基因)的表达结果表明(图3)，9株拟南芥抗性苗都含有转化的外源基因，都为阳性。所以，新方法体系卡那霉素筛选压力不低，没有假阳性苗出现。因此，以上结果显示新方法可以同传统方法一样准确地筛选转基因拟南芥T2代种子。
[0039] 新方法筛选的抗性苗生长势好于传统方法
[0040] 我们分析了新方法和传统方法筛选的拟南芥抗性苗(30天苗龄)的生长情况(表3)。尽管两种方法筛选的抗性苗在叶绿素和蛋白质含量差异不显著，但新方法筛选的抗性苗千鲜重均显著高于传统方法筛选的抗性苗(37％左右)。有两个原因解释这种现象：1)新方法筛选体系为一个原位筛选的体系，抗性苗的生长不像在传统方法那样需要一定时间的恢复；2)新方法筛选体系为水培体系比传统方法的蛭石体系，尽管所用的营养液一样，但生长一般较快。
[0041] 表3新方法和传统方法筛选的拟南芥抗性苗生长情况。
[0042]
[0043] 备注：K5P，在传统方法的卡那霉素筛选装置上生长7天后，又转到蛭石上生长23天，转基因植株的苗龄为30天；K5S，在原位筛培装置上连续生长30天的转基因拟南芥植株。
[0044] 新方法的评价
[0045] 首先，新方法筛选的抗性苗在自然条件下萌发，不必同传统方法那样在无菌的条件下萌发，省时省力。第二，新方法的筛选体系移动方便、便于操作、容易建立。带有抗性苗的种苗管非常容易地在盛放营养液的培养箱上移动。第三，我们建立了可以不断向营养液中通气和实时控制营养液pH的易于拟南芥生长的筛培装置，且该装置便于监测拟南芥的根系生长(图1)，用新方法筛培的拟南芥长势好于传统方法，为较早获得转基因纯合系(T3代种子)赢得了时间。尽管采用喷洒卡那霉素的方法也能原位筛选转基因拟南芥T2代种子(Xiang et al.，Plant Molecular Biology Reporter，1999，17：59-65)，我们建立的新方法有所不同。一方面，我们建立的新方法需要较少的卡那霉素用量。另一方面采用喷洒卡那霉素的方法，抗性苗叶上会有大量卡那霉素，因此会延迟抗性苗的生长。然而在我们建立的新方法体系下，只要抗性苗根穿过种苗管，抗性苗就基本摆脱了受卡那霉素胁迫的环境，所以生长较快。