杂交瘤细胞株D6D

摘要

本发明涉及杂交瘤细胞株D6D的研制，属于生物技术领域。用BSA与OTA偶联后的OTA-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养。用KLH与OTA偶联后的完全抗原OTA-KLH作为ELISA的包被抗原，用间接ELISA方法，对杂交瘤细胞培养上清中的抗体含量进行检测，筛选获得稳定分泌抗OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株D6D，测得D6D腹水ELISA效价为1∶3200，经鉴定该单克隆抗体可与OTA特异性结合，纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图呈现两条蛋白条带分别约是50KD、25KD，与抗体蛋白变性成两条轻链重链的分子量大小吻合，再次表明获得抗OTA特异性抗体的事实，该单克隆抗体的亚型为IgG2b，轻链为κ链。本发明提供的特异性单克隆抗体可用于OTA的研究和OTA免疫学检测方法的建立。

权利要求

1.一种OTA单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株D6D产生的，杂交瘤细胞株D6D于2010年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：

C201052。

说明书

杂交瘤细胞株D6D

技术领域

[0001] 本发明涉及分泌赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株D6D，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术。

背景技术

[0002] 赭曲霉毒素(Ochratoxins)是一类主要由曲霉属真菌(例如，赭曲霉Aspergillus Ochraceus，硫色曲霉Aspergillus Fresenii等)和青霉属真菌产生的真菌毒素。OTA是赭曲霉素的主要组分，也是导致赭曲霉素中毒的主要原因，其促癌性和致癌性已在大鼠中得到证实。流行病学调查发现，OTA对谷物制品的污染可能与人类巴尔干地区肾病有一定相关性。国际癌症研究中心(IARC)已把OTA划分为2B类致癌物。

[0003] OTA的结构为苯甲酸异香豆素。它是一种稳定的无色结晶化合物，呈弱酸性，溶于极性溶剂和碳酸氢钠溶液，微溶于水，其甲醇溶液在冰箱中保存一年不会分解。OTA分子式C20H18ClNO6，分子量为404，是一种半抗原物质。

[0004]

[0005] OTA的化学结构式

[0006] OTA广泛存在于小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物和咖啡豆、葡萄等农产品及制品中，对人类健康和畜牧业发展构成潜在威胁。食品添加剂和污染物法典委员会(The Codex Committee on Food Additives and Contaminants，CCFAC)等国际组织认为，OTA是一种关系重大公共卫生安全的真菌毒素。第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)-1会议制定OTA的限量标准，认为小麦、大麦和黑麦等谷物及其制品中OTA限量为5μg kg 。

[0007] 鉴于OTA的危害，通过制备其单克隆抗体，可为赭曲霉毒素抗原性研究和OTA免疫学检测方法的建立提供必要组分和技术手段，对探索OTA各结构区域的生物学功能和建立OTA的特异、灵敏的检测方法具有重要意义。

发明内容

[0008] 技术问题

[0009] 本发明的目的是提供分泌OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的单克隆抗体是将牛血清白蛋白(BSA)作为载体蛋白与OTA偶联制备完全抗原，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得能特异识别OTA的单克隆抗体D6D。

[0010] 技术方案

[0011] 一种OTA单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株D6D产生的，杂交瘤细胞株D6D于2010年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C201052。制备方法包括：

[0012] 1)免疫抗原OTA-BSA的制备

[0013] 配制OTA的二甲基亚砜(DMSO)溶液，加入N-羟基琥珀酰胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)进行OTA的活化。将上述溶液缓慢滴加于牛血清白蛋白(BSA)溶液进行OTA与BSA的偶联，反应产物用磷酸盐缓冲液(PBS)透析，得到OTA与载体蛋白的偶联物。

[0014] 2)小鼠免疫

[0015] 本实验采用小剂量长周期的免疫方案。使用偶联蛋白OTA-BSA作为免疫抗原，对7周龄的雌性BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学中心)进行免疫。按200μg/只的免疫剂量对BALB/c小鼠进行8次免疫，最后一次免疫三天后摘取小鼠脾脏，做细胞融合。

[0016] 3)细胞融合

[0017] 取Sp2/0骨髓瘤细胞(江苏省农科院惠赠)与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按比例均匀混合，在50％聚乙二醇4000(PEG 4000)作用下进行细胞融合，用含20％FCS(购于上海慧人生物科技工程研究所)和HAT(购于Invitrogen公司)的1640培养基(购自Gibico公司)在5％CO2培养箱中培养，培养14d后，逐步用20％FCS和HT(购于Invitrogen公司)的1640培养基和20％FCS的1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗OTA单克隆抗体检测。

[0018] 4)杂交瘤筛选

[0019] 用OTA-血蓝蛋白(KLH)的碳酸盐缓冲液做包被原，以1％明胶做封闭液，1∶10000的辣根过氧化物酶标的羊抗鼠IgG作为二抗(购自博士德生物技术公司)，-1
TMB-H2O2为底物，2mol L 硫酸溶液为终止液，PBST做洗液，1∶800稀释的阳性参考血清和1∶800稀释的阴性参考血清做对照的间接酶联免疫吸附法(ELISA)，对杂交瘤细胞上清中的抗OTA抗体分泌情况进行检测，筛选分泌抗OTA抗体的阳性杂交瘤细胞。经酶标仪测定OD450nm值：以空白对照调零，当阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值≥2.1，检测孔判为阳性，当阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值＜1.5的检测孔判为阴性，比值介于中间判为可疑。

[0020] 5)有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆

[0021] 首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用1640完全培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，达到每孔1个细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养。培养8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至该细胞所有孔的上清液检测均为阳性且各孔检测OD值较接近，将多次亚克隆培养后的阳性细胞扩大培养和冻存。

[0022] 6)抗OTA单克隆抗体的制备

[0023] 将PBS稀释的5×106～1×107个阳性杂交瘤细胞注入成年BALB/c小鼠腹腔，5～10d后采集腹部明显鼓起小鼠的腹水，离心，收集上清。

[0024] 7)抗OTA单克隆抗体纯度的鉴定-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[0025] 抗OTA的单克隆抗体腹水溶液与5×上样缓冲液混合，水浴煮沸变性，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝R250染色，根据电泳的抗体蛋白条带质量大小，验证抗体的存在。

[0026] (六)抗体亚型的鉴定

[0027] 用 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Rache Iso strip，cat.NO.14932027)对抗OTA单克隆抗体进行亚型测试。

[0028] 有益效果 本发明的特点和优点如下：

[0029] 1、本发明提供的抗原制备方法简便可行。

[0030] 2、本发明提供的OTA单克隆抗体特异性强，制备方法简单。

[0031] 3、本发明提供的特异性单克隆抗体可用于OTA的研究和OTA免疫学检测方法的建立。

[0032] 4、获得稳定分泌OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株D6D，测得D6D腹水ELISA效价为1∶3200。经鉴定该单克隆抗体为IgG2b类抗体，抗体轻链为κ亚型。

附图说明

[0033] 图1偶联抗原紫外连续波谱扫描检测

[0034] 图2纯化后单抗的电泳图

[0035] 生物保藏

[0036] 杂交瘤细胞株D6D，于2010年5月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC C201052。

具体实施方式

[0037] (一)免疫抗原OTA-BSA的制备与检测

[0038] OTA的活化：取1mg OTA溶解于0.25mL DMSO溶液中，分别量取NHS和EDC加入上述溶液中(OTA∶NSH∶EDC摩尔比为1∶2∶4)，室温下避光剧烈摇动2h，之后4℃反应过-1夜。OTA的偶联：将上述溶液缓慢滴加于BSA溶液(2mg蛋白溶于1mL 0.1mol L 碳酸氢钠-1
溶液中)，加入磁力转子，置于磁力振荡器上，室温下避光振荡2h；反应产物于0.05mol L PBS缓冲液中4℃下避光透析72h，每5h更换透析液一次，得到OTA与载体蛋白的偶联物。

[0039] 偶联好的完全抗原通过紫外连续扫描法进行验证。配置OTA标准溶液，BSA标准溶液和偶联完全抗原稀释液。BSA标准溶液在280nm出现最大吸收峰，OTA标准溶液在379nm出现最大吸收峰。在200～400nm波长内，间隔5nm进行连续波长扫描。结果如图1。

[0040] (二)杂交瘤细胞株的建立

[0041] 1)小鼠免疫

[0042] 本实验采用小剂量长周期的免疫方案。使用偶联蛋白OTA-BSA作为免疫抗原，对7周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。按200μg/只的免疫剂量，与弗氏完全佐剂1∶1(V/V)混合，乳化30min，达到油包水状，在水中不溶解或4℃过夜不分层视为有效乳化。将乳化的完全抗原，颈背部多点皮下注射免疫BALB/c小鼠(200μg/只)；2周后，以相同抗原和等体积的弗氏不完全佐剂乳化，200μg/只进行加强免疫；7次免疫后，不加佐剂以200μg/只进行腹腔注射加强免疫。从第三次开始，每次免疫一周后尾静脉或眼球采血，37℃静置1h，-1
4℃过夜析出血清，3000r min 离心10min，分离血清测试血清滴度。最后一次免疫三天后摘取小鼠脾脏，做细胞融合。

[0043] 2)细胞融合

[0044] 取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的1mL 50％PEG 4000，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的1640不完全培养基，室温静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS和HAT的1640培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO2培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT的1640培养基换出1/2培养基；14d后，改用20％FCS和HT 1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。

[0045] 3)抗OTA杂交瘤细胞的筛选

[0046] 用包被液为0.05mol L-1 pH 9.6碳酸盐缓冲液，将偶联好的包被抗原(OTA-KLH)，做倍比稀释包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以1％明胶封闭每孔，300μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1∶800稀释的阳性参考血清和1∶800稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次-1拍干；加入底物TMB-H2O2，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入100μL 2mol L 硫酸溶液终止反应。经酶标仪测定OD450nm值：以空白对照调零，当阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值≥2.1，检测孔判为阳性，当阳性参考血清的OD450nm值与阴性参考血清的OD450nm值的比值＜1.5的检测孔判为阴性，比值介于中间判为可疑。

[0047] 4)有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆

[0048] 对于筛选所得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用1640完全培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，0.15mL/孔，在37℃、
5％CO2培养箱中培养。4～5d后，显微镜下可观察克隆细胞的形成，记录只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至所有细胞孔上清液检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性细胞扩大培养和冻存，获得稳定分泌OTA单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为D6D。

[0049] (三)生产抗OTA单克隆抗体的腹水

[0050] 将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞用-1 6 70.01mol L PBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10 ～1×10，0.2mL，5～10d后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，10000rpm，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。

[0051] (四)抗OTA单克隆抗体的腹水效价测定

[0052] 用PBS缓冲液1∶100稀释单克隆抗体腹水，然后进行倍比稀释，加入KLH-OTA包被的酶标板，100μL/孔，37℃，孵育60min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶10000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，孵育60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H2O2，100μL/孔，室温避光显色15min；每孔加入-1100μL2mol L 硫酸终止反应；用酶标仪测定OD450nm值。以阴性OD450nm值小于0.2，检测孔与阴性OD450nm值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示，D6D细胞株腹水间接ELISA效价为1∶3200。

[0053] (五)抗OTA单克隆抗体纯度的鉴定-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[0054] 配制10mL 12％分离胶溶液。迅速在两玻璃板之间灌注分离胶，上面用水密封。约30min后，待分离胶完全聚合，倒出覆盖胶上层的水，用滤纸吸干。配制5％浓缩胶，灌注在分离胶上，之后立即插入梳子，小心气泡。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子，用电泳缓冲液清洗孔洞。样品与5×上样缓冲液按比例混合，水中加热煮沸10min，离心，每孔上样约20μL。
加满电泳缓冲液，80V电泳，当样品在浓缩胶内压成一条直线后，调节电压至120V，直到溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。卸下玻璃板，用刮勺敲开玻璃板，在一边做记号后，刮下凝胶。考马斯亮蓝R250染液染色2h。脱色过夜至条带清晰可见，拍照，如图2。

[0055] (六)抗体亚型的鉴定

[0056] 用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit进行测试。首先用PBS将腹水进-1行稀释，至抗体浓度为0.1～1μg mL ，取150μL加入测试管。15～25℃，30s，然后摇动涡旋管子，使管内蓝色胶质充分悬浮，黑头朝下插入试纸条，5～10min后，参照阳性对照，出现蓝色条带处即为该抗体亚型类别。该单克隆抗体的亚型为IgG2b，轻链为κ链。