一株乳酸杆菌菌株及其应用

摘要

本发明涉及一株乳酸杆菌Lactobacillussp.W2，保藏编号为CCTCC M209318；本发明还涉及利用乳酸杆菌Lactobacillussp.W2对底物苯基丙酮酸进行生物转化，并利用乙酸乙酯对发酵液中的苯基乳酸进行萃取。本发明的乳酸杆菌Lactobacillussp.W2来源于传统的发酵食品，属于公认安全菌种，可以在食品中应用；该菌株在MRS培养基上生长良好，容易培养和保存，通过发酵所得的苯基乳酸含量可高达1.038 g/L，抑制食品中腐败菌的能力较强。

权利要求

1. 一株乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）W2，其保藏登记号为CCTCC No：M 209318。

2. 根据权利要求1所述的乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）W2在发酵生产苯基乳酸中的应用，其特征在于以乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）W2为菌种，以苯基丙酮酸为转化底物，发酵法生物转化制备苯基乳酸。

3. 根据权利要求2所述的乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）W2在发酵生产苯基乳酸中的应用，其特征在于具体方法为：将（Lactobacillus sp.）W2接种至MRS液体培养基进行发酵，培养温度37℃，培养17小时，然后将种子培养液按5%接种量接入发酵培养基中，

35～37℃培养20～24小时；其中所述的发酵培养基为：蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖2.0%，吐温-80 0.1%，磷酸氢二钾0.2%，醋酸钠0.5%，柠檬酸二铵0.2%，硫酸镁0.05%，硫酸锰0.025%，苯基丙酮酸0.5%，水1000 mL，pH7.5。

说明书

一株乳酸杆菌菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2菌株，及其在发酵生产苯基乳酸中的应用，属于工业微生物领域技术。

背景技术

[0002] β-苯基乳酸，又称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸（Phenyllactic acid，简称PLA），相对分子质量为166，熔点121～125℃，无气味，对酸、热稳定，在121℃加热也不被破坏，天然存在于蜂蜜中，对人或动物细胞无毒；其第二个碳原子为手性碳原子，因此有两种对映异构体R-(＋)-3-苯基乳酸（D-(＋)-3-苯基乳酸）和S-(-)-3-苯基乳酸（L-(-)-3-苯基乳酸）。β-苯基乳酸是一种新型的抑菌物质，有较广的抑菌谱，其抑菌特性已受到研究者的广泛关注。特别是它能抑制真菌的污染可延长食品的货架期，而且它又是一种可生物合成的天然化合物，有望作为新型天然防腐剂应用于食品工业或其他领域中。R-3-苯基乳酸和S-3-苯基乳酸均有抑菌效果，在较低浓度下就可有效抑制大部分食品腐败菌，其抑菌效果要显著优于一些常用食品防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾等合成防腐剂。

[0003] 现有技术中生产3-苯基乳酸的方法主要有化学法和生物合成法。化学方法存在的问题是产物光学纯度不够高，技术复杂、污染环境严重、产品成本高以及产品质量难以控制等。由于β-苯基乳酸主要应用于食品和医药领域，在消费者崇尚天然、营养食品的今天，世界各国的研究者把研究的重点转移到了生物合成法方面；生物合成法即通过完整的微生物细胞的立体选择性生物催化来实现。因此筛选高立体选择性的优良微生物菌株是该方法的关键。早在1986年，Kamata等就用乳糖发酵短杆菌Brevibacterium Lactofermentum 发酵生产了R-3-苯基乳酸，产量为1.94 g/L，并且申请了专利；1998年，Dieuleveux等从白地霉Geotrichum Candidum的培养液中也分离到了R-3-苯基乳酸，该菌株在TSBYE培养基中发酵产生R-3-苯基乳酸的量为0.6 g/L～1 g/L；2000年，Lavermicocca等发现从发酵面团中分离到的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum 21B能分泌R-3-苯基乳酸，他们将植物乳杆菌接种在小麦粉水解液中，30℃培养发酵24 h，产生的R-3-苯基乳酸量为0.009 mol/L。2002年，Katrin 等从青贮草中也分离到了一株L.plantarumMiLAB 393，它产生的S型和R型3-苯基乳酸的比例为9:1；1996年，Hashimoto 等从土壤中筛选到了一株假单胞菌Pseudomonas sp. BC218，能将苯乙醛-氰醇转化为S-3-苯基乳酸。这一转化有较高的对映选择性，生成的S-3-苯基乳酸的e.e.值为75%，再经过优先结晶，e.e.值可达到99%。该菌株经诱变后，S-3-苯基乳酸的产量是出发菌株的12倍；Diversa公司用腈酶（EC 3.5.5.1）（Nitrilases）可以制备e.e.值为99%的S-3-苯基乳酸；近来，Thierry 等报导费氏杆菌Propionibacteriun freudenreichii 在奶酪发酵过程中产生了3-苯基乳酸，这些3-苯基乳酸是由苯基丙酮酸在羟基还原酶作用下得到的。
目前β-苯基乳酸已在Diversa公司进行了工业化生产。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一支具有高合成苯基乳酸能力的微生物菌株，使得该菌株来源安全、培养方法简单，且苯基乳酸的产率相对于现有技术菌株高；本发明的另一个技术目的在于提供该微生物菌株在发酵生产苯基乳酸中的应用。

[0005] 为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：

[0006] 一、本发明从内蒙古传统酸乳制品中分离筛选、纯化得到一株乳酸杆菌菌株，其分类命名为乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2，保藏登记号为CCTCC NO：M 209318。

[0007] 本发明的乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的生物学性质如下：

[0008] 形态学特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0.5～2.0 mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。革兰氏染色阳性，不运动，细胞细杆状，0.29～0.45 mm × 1.58～4.20 mm，不生孢。

[0009] 培养特征：最适生长温度30～37℃，兼性厌氧，有氧时生长差，最适生长初始pH为6.5。

[0010] 二、本发明所述的乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2在发酵生产苯基乳酸中的应用，以乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2为菌种，以苯基丙酮酸为转化底物，发酵法生物转化制备苯基乳酸。

[0011] 具体的应用方法：将乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2接种至MRS液体培养基进行活化，然后将种子培养液按5%接种量接入发酵培养基中，35～37℃培养20～24小时。

[0012] 进一步的苯基乳酸的纯化方法为：将乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用10 mL 0.05%三氟乙酸水溶液溶解，高效液相色谱法测定苯基乳酸的含量。

[0013] 本发明的有益效果在于：

[0014] 本发明的乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2来源于传统的发酵食品，属于公认安全菌种，可以在食品中应用；该菌株在MRS培养基上生长良好，容易培养和保存，通过发酵所得的苯基乳酸含量可高达1.038 g/L，抑制食品中腐败菌的能力较强。

附图说明

[0015] 图1为乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的菌体形态（1000×）。

[0016] 图2为乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的液态发酵所产苯基乳酸的HPLC图谱。

[0017] 本发明的微生物乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的保藏日期为2009年12月28日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏登记号为CCTCC NO：M209318。

具体实施方式

[0018] 本发明所采用的培养基：

[0019] 富集培养基：MRS液体培养基。

[0020] 分离培养基（%）：酵母膏0.75%，蛋白胨0.75%，葡萄糖1%，西红柿汁100 mL，吐温80 0.05%，琼脂2%，水900 mL，pH6.8～7.0。

[0021] 鉴别培养基（BCP培养基）（%）：蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.5%，吐温-800.05%，葡萄糖1%，琼脂2%，水1000mL，加入1.6%溴甲酚紫溶液1.4 mL，pH6.8～7.0。

[0022] 斜面保藏培养基（%）：酵母膏1%，碳酸钙2%，葡萄糖1%，琼脂2%，水1000 mL，pH7.0。

[0023] 液体种子培养基：MRS液体培养基。

[0024] 发酵培养基（%）：蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母膏0.5%，葡萄糖2.0%，吐温-800.1%，磷酸氢二钾0.2%，醋酸钠0.5%，柠檬酸二铵0.2%，硫酸镁0.05%，硫酸锰0.025%，苯基丙酮酸0.5%，水1000 mL，pH7.5。

[0025] 实施例1

[0026] 本实施例说明乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的筛选及纯化鉴定方法。

[0027] 1、菌株的选育：

[0028] 准确称取酸奶渣（购于内蒙古锡林浩特珠穆沁旗）25 g，无菌条件下，加入盛有225 mL MRS液体培养基的三角瓶中，35℃富集培养24 h。吸取1 mL酸奶渣培养液进行梯度稀释，吸取不同稀释度的富集培养液1 mL置于已凝固的无菌分离培养基上，用无菌的涂布棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，35℃保温培养2～3天，挑取培养基中长出的肉眼可见的菌落，分别在BCP平板培养基上进行划线分离培养，挑取菌落周围培养基呈黄色的菌落进一步纯化，直至得到单一菌落，转移至斜面保藏培养基上。

[0029] 2、发酵液制备：

[0030] 将所选育的菌株分别接种至MRS液体培养基，37℃，培养24小时，然后取适量发酵液进行下步抑菌实验。

[0031] 3、抑菌菌株的筛选：

[0032] 取长满金黄色葡萄球菌（As1.89，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心）的斜面试管一只，加入灭过菌的蒸馏水10 mL，制成菌悬液，取0.1 mL接种于营养琼脂平板培养基表面，用玻棒涂布均匀。在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再取步骤2制备的发酵液200 mL加入牛津杯，37℃下培养20～24小时，观察结果。挑选在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株。

[0033] 在无菌培养皿中倒入PDA固体培养基，将从面包上分离到的桔青霉菌（3.4039，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心）制成孢子悬液，取0.1 mL接种于PDA平板培养基上，用涂布棒均匀地涂布。在平板不同位置等距离放置高温灭菌的牛津杯，再取步骤2中发酵液200 mL加入牛津杯，28℃下培养48～72小时，观察结果。挑选在牛津杯的周围产生抑菌圈的菌株。

[0034] 挑选能够同时抑制上述金黄色葡萄球菌和青霉菌、且抑菌圈较大的发酵液所对应的菌株，命名为W2。

[0035] 实施例2

[0036] 本实施例说明乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的鉴定方法。

[0037] 1、菌株W2的鉴定：

[0038] 对W2的16SrDNA部分的序列的测定及比对分析，鉴定为乳酸杆菌Lactobacillus sp.，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名为乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2，其保藏登记号为CCTCC NO：M 209318。

[0039] 2、乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2的特征：

[0040] 形态学特征：

[0041] 将乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2菌株在MRS固体培养基上，35℃培养48小时，形成明显的菌落，直径在0.5～2.0 mm之间，圆形，培养基内呈针状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。在显微镜下观察，革兰氏染色阳性，不运动，细胞短杆状，0.29～0.45 mm×1.58～4.20 mm，不生孢。

[0042] 培养特征：

[0043] 最适生长温度30～37℃，兼性厌氧，有氧时生长差，最适生长初始pH为6.5。

[0044] 实施例3

[0045] 本实施例说明乳酸杆菌Lactobacillus sp.W2在发酵生产苯基乳酸中的应用。

[0046] 将Lactobacillus sp.W2接种至MRS液体培养基进行发酵，培养温度37℃，培养17小时，然后将种子培养液按5%接种量接入发酵培养基中，35～37℃培养20～24小时。所得发酵液进行离心，弃除沉淀，取上清液加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，减压蒸发浓缩，得到苯基乳酸的粗品，然后用10 mL 0.05%三氟乙酸水溶液溶解，采用高效液相色谱（HPLC）法测定苯基乳酸的含量，所得的苯基乳酸含量可高达1.038 g/L。

[0047] HPLC测定条件为：流动相为0.05%的三氟乙酸/甲醇（A）和0.05%的三氟乙酸/水（B）的混合液，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃，进样量25 μL，进样前用0.22 mm滤膜过滤。其检测图谱如附图2所示。