瓜黑星病菌的检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供了用于特异性检测样品中瓜黑星病菌和/或瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌的引物组合以及含有该引物组合物的PCR检测试剂盒。本发明还提供了检测样品中黑星病菌和/或瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌的方法。本发明方法不但能快速、简洁、准确地检测病害，而且能大大节约检测成本。

权利要求

1.一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的组合物，其特征在于它，所述组合物包括一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。

2.一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，其特征在于它，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。

3.一种检测样品中瓜黑星病菌的方法，其特征在于它，该方法包括以下步骤，a)用权利要求2所述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，所述扩增包括在94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共

32个循环，最后72℃延伸7分钟；

b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜黑星病菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于它，所述样品是瓜组织或其DNA提取物，所述瓜选自西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。

5.一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的组合物，其特征在于它，所述组合物包括三对特异性引物，其中，第一引物对的序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对的序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列，第三引物对的序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

6.一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，其特征在于它，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含三对特异性引物，其中，第一引物对的序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对的序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列，第三引物对的序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

7.一种同时检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的方法，其特征在于它，该方法包括以下步骤，a)用权利要求6所述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，所述扩增包括在94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30秒，46℃退火1分钟，72℃延伸

2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟；

b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜蔓枯病菌。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于它，所述样品是瓜组织或其DNA提取物，所述瓜选自西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。

说明书

瓜黑星病菌的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

[0001] 本申请涉及生物技术领域，尤其是生物检测领域。具体而言，本申请涉及瓜黑星病菌的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

[0002] 瓜疮痂枝孢霉菌(Cladosporium cucumerinum，又称为瓜黑星病菌)能引起黄瓜、西瓜、西葫芦、南瓜、甜瓜、冬瓜等瓜类病害，以黄瓜上的黑星病发病最为常见[1]。瓜黑星病是瓜上的一种毁灭性病害，由于其危害严重，难以防治，我国已将其列为全国植物检疫性有害生物。瓜类枯萎病菌Fusarium oxysporum、瓜类蔓枯病菌(Didymellabryoniae，国内报道多为Mycosphaerella meloni)也是瓜类重要的病原菌，这三种病原菌是瓜类中非常常见的三种病原菌。

[0003] 黄瓜黑星病在幼苗期、成株期都能感病，病原菌可侵染嫩叶、嫩茎和幼瓜，是瓜类中常见的病害，一旦病害发生，就会严重减产，甚至绝收。瓜类枯萎病、瓜类蔓枯病能同时发生，是造成瓜类损失的主要病害。瓜枯萎病，瓜农叫″死藤″，一般在植株开花结果期开始在田间陆续表现出症状，自幼苗至成株期均可发病，在开花结果期最重[5]。瓜蔓枯病病原，属子囊菌亚门真菌，发病主要在瓜类生长中后期，植株蔓、叶、果实均可发病，主要危害叶片和瓜蔓[6]。三种病害在初发期，很难从症状上进行鉴定，因此，给及时、有效防治带来困难。

[0004] 由于这三种病害传播途径、发病症状和发病条件相似，都可以通过土壤带菌进行侵染，土壤、病残体、流水、风雨均可使病害传播。在土地连作、田间湿度大、通风不良情况下，病害比较容易发生。这三种病害无论是在保护地还是在露地栽培中发病都比较常见。

[0005] 因此，本领域中迫切需要能开发出新的检测方法和试剂盒，以便在发病初期或在田间土壤中同时鉴定多种瓜类主要病害，从而预测病害的发生情况、及时采取有效的防治方法控制病原菌传播，减少瓜农损失。

发明内容

[0006] 为实现上述目的，本发明者通过测定瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)rDNA的ITS序列，比对近缘种及瓜类不同致病病原菌的ITS序列同源性，设计出了特异性引物HX-1/HX-2。

[0007] 因此，本发明第一方面提供了一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的组合物，所述组合包括一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别是SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的序列。

[0008] 本发明另一方面提供了一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。

[0009] 本发明另一方面提供了一种检测样品中瓜黑星病菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用本发明上述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌。在一个较佳的实施方案中，所述步骤a)的扩增包括在94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32个循环，最后72℃延伸7分钟。在另一较佳的实施方案中，所述瓜选自西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。

[0010] 本发明另一方面还提供了一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的组合物，所述组合物包括三对特异性引物，其中，第一引物对的序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对的序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列，第三引物对的序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

[0011] 本发明另一方面提供了一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含三对特异性引物，其中，第一引物对的序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对的序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列，第三引物对的序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

[0012] 另一方面，本发明提供了一种同时检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用上述用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜蔓枯病菌。在该方面的一个较佳实施方案中，所述步骤a)的扩增包括在94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30秒，46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。在该方面的另一较佳实施方案中，所述样品是瓜组织或其DNA提取物，所述瓜选自西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。

[0013] 本发明涉及采用PCR技术对瓜类黑星病菌进行的快速鉴定和检测，克服了传统的从发病植株和瓜体中分离鉴定病原菌的方法中存在的时间长、程序烦琐等缺点。可以准确地在病害的潜伏期和发病初期对病害进行诊断、监测和病原菌鉴定，以便及时采取有效的防治方法，控制病害的发生，减少经济损失，

附图说明

[0014] 图1显示了用引物对HX1/HX2进行提督PCR扩增的结果，图中：M：100bp DNA梯标记；泳道1-12：分别表示58.0℃、58.6℃、59.7℃、61.2℃、63.0℃、64.4℃、65.5℃、66℃的退火温度。

[0015] 图2显示了用引物对HX1/HX2特异性扩增的产物。图中，M：DL2000标记；泳道1和12：阴性对照；泳道2-3和泳道13-14：Cladosporium cucumerinum分离物；泳道4-11和15-22：其它不同真菌的分离物。

[0016] 图3显示了用引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2的特异性扩增产物。图中，M：DL2000标记；泳道1：阴性对照；泳道2-3：Fusarium oxysporum、Cladosporium cucumerinum和Didymella bryoniae的分离物；泳道4-11：其它不同真菌的分离物。

[0017] 图4显示了用引物HX-1/HX-2进行分子检测的灵敏度，图中M：DL2000标记；泳道1-9：用浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg的DNA在25μl PCR反应体系中扩增的产物。

[0018] 图5显示了用不同的DNA浓度分别和引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2进行三重PCR检测的灵敏度，其中M：DL2000标记；泳道1：阴性对照；泳道2-9：用浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg的DNA在25μl PCR反应体系中的扩增产物。

[0019] 图6显示了用不同浓度的DNA分别和引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2进行三重PCR检测的灵敏度，图中M：DL2000标记；泳道1：阴性对照；泳道2-9：浓度为30ng、3ng、300pg、30pg、3pg、300fg、30fg、3fg的DNA在25μl PCR反应体系中的扩增产物。

[0020] 图7显示了用引物对HX-1/HX-2在受感染的西瓜样品上的PCR检测结果，图中M：DL2000标记；泳道1：阴性对照；泳道2-5：受感染的果实；泳道6-7：无病原菌的果实；泳道
8-9：无病原菌的叶子。

[0021] 图8显示了用三重PCR从受感染的瓜组织特异性扩增的产物，图中M：DL2000标记；泳道1：阴性对照；泳道2-5：受感染的果实；泳道6-7：无病原菌的果实；泳道8-9：无病原菌的叶子。

具体实施方式

[0022] 本发明通过测定黄瓜黑星病菌rDNA的ITS序列，比对近缘种及瓜类其他主要致病病原菌的ITS序列同源性，设计出特异性引物，并和其他瓜上主要致病菌检测引物进行引物筛选、组合，对多重PCR体系进行优化，实现了对三种瓜上主要病害的三重PCR检测，能够一次性检测出三种病害，不但能快速、简洁、准确地检测病害，而且能大大节约检测成本。

[0023] 具体而言，本发明首先提供了一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的组合物，所述组合包括一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别如下所示：

[0024] HX-1：5′-TGTTGTCCGACTCTGTTGC-3′(SEQ ID NO：1)

[0025] HX-2：5′-CATTTCGCTGCGTTCTTC-3′ (SEQ ID NO：2)

[0026] 本发明的引物可用任何已知的方法产生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)103：3185]的三酯合成方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：7461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。另外，还可以根据偏好选择引物的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，还可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，改变RNA亲和力，增加核酶抗性等[例如参见Agrawal和 Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 6：12-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14：376-387]；
还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey(1997)TIBTECH15：224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH 11：384-386]。

[0027] 在一个优选的实施方案中，本发明的用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的组合物由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列组成。

[0028] 本发明第二方面提供了一种用于特异性检测样品中瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含一对特异性引物，所述特异性引物对的序列分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。

[0029] 本发明中所用的术语“PCR”或“聚合酶链反应”指一种过程或技术(如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中所述的那样)。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似。两个引物的5′端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。PCR技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。见Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263(1987)；Erlich编辑，PCR Technology(Stockton Press，NY，1989)。

[0030] 聚合酶链反应技术是本领域技术人员熟知的一种检测少量靶核酸的手段。类似试验在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155：335-350]；美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。为了检测出靶核酸的存在，特异性引物的选择是至关重要的。

[0031] 本领域技术人员能够根据熟知的技术合适的选择本发明试剂盒中的PCR反应体系。在本发明的一个较佳实施方案中，PCR的反应混合液包含，以总体积为25μl计，ExTaq酶12.5μl，10μM的引物各0.5μl，模板DNA若干。另外，本发明的PCR检测试剂盒中还可附带操作说明书。

[0032] 本发明另一方面还设计了一种检测样品中瓜黑星病菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用本发明上述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌。

[0033] 在所述方法中，样品可以是例如，但不局限于，瓜类植株的子叶、幼茎、真叶、茎、荚及种子，较佳的是上述植株组织的DNA提取物。所述DNA提取物可用市售的DNA提取试剂盒或其他常规的DNA提取方法获得。本发明实施例虽然以西瓜和黄瓜作为例子来进行说明，应当理解的，本发明方法适用的瓜并不局限于西瓜和黄瓜，其还可包括甜瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。在另一较佳的实施方案中，所述样品也可以来自土壤或其他怀疑含有瓜黑星病菌的任何样品。

[0034] PCR扩增反应可在任何常规市售的PCR扩增仪器(例如PTC-200PCR仪)上进行。在一个较佳的实施方案中，所述步骤a)的扩增包括在94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，
60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32个循环，最后72℃延伸7分钟。然而，本领域技术人员也可以根据具体的试验条件、扩增设备等对上述过程加以改变。这些都在本领域技术人员的常规试验能力范围之内。

[0035] 在用PCR扩增方法得到了扩增产物后，可采用常规方法，如凝胶电泳(如琼脂糖凝胶电泳)测定PCR扩增产物的大小。如果可以的话，还可以采用更为精确的测定方法，如对产物进行测序等。在本发明的一个具体实施方案中，采用的是方法是取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。如果结果显示上述两对引物成功扩增出了具有预计长度(190bp)的条带，则表明所述样品中有瓜黑星病菌。应当理解的是，瓜黑星病菌的DNA序列可能会发生各种变异(如缺失、增加或取代)，因此实际测得的扩增产物的长度可能会与上述长度有一定的差别。所以，本发明说明书通篇中所用的长度“XXX bp”的含义并不仅仅表示这些长度本身，而是包括了在所述长度附近(例如相差20个bp或更多，较佳为相差10个bp，更佳为相差5个bp的)的长度。

[0036] 另外，本发明者还考虑并设计了多重PCR体系，以便同时在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增多个目的基因，从而能够节省时间、降低成本、提高效率。多重PCR反应体系较难建立，要求确保反应中的引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。多重PCR扩增对试验操作要求很高，任何一种实验条件控制不当，都将很容易导致扩增条件的失败[7]。国内报道的多重PCR体系的建立，大多数都是针对同一DNA模板的不同区域扩增多个片段，但是针对不同模板的多重PCR体系的建立很少，特别是检测不同植物病原菌多重PCR体系的建立非常少见，ZhengguangZhang[4]把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的两对特异性引物置于同一反应管中进行PCR扩增，通过优化反应条件，在一次反应中即可将两种病原物成功地检测出来。但是三重PCR的体系建立比两重PCR的建立难很多，一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、反复试验，建立适宜的反应体系和反应条件[8]。解建云等[9]采用与单一PCR相同的反应条件，对近交系小鼠进行两重和三重PCR检测，结果两重PCR获得预期结果，而三重PCR出现干扰现象，因此认为在不改变PCR反应条件时，进行两重PCR比较容易获得预期结果，而对三重或以上的PCR扩增比较困难。

[0037] 为克服上述问题，本发明者经过研究发现，本发明设计的引物对HX-1/HX-2，不但能够从瓜类病原菌中检测出瓜黑星病，而且还能和引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组合，建立三重PCR体系，从而一次性可以检测出三种瓜类重要病害，大大节约检测成本。由于多重PCR相对普通PCR具有明显的效率高、成本低等优点。

[0038] 具体而言，本发明另一方面还提供了一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的组合物，所述组合物包括三对特异性引物，

[0039] 第一引物对(HX-1/HX-2)

[0040] HX-1：5′-TGTTGTCCGACTCTGTTGC-3′(SEQ ID NO：1)

[0041] HX-2：5′-CATTTCGCTGCGTTCTTC-3′ (SEQ ID NO：2)

[0042] 第二引物对(Fn-1/Fn-2)

[0043] Fn-1：5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′(SEQ ID NO：3)

[0044] Fn-2：5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′(SEQ ID NO：4)

[0045] 第三引物对(Mn-1/Mn-2)

[0046] Mn-1：5′-GGATCATTACCTAGAGTTG-3′(SEQ ID NO：5)

[0047] Mn-2：5′-ACGTCGTCGTTGTGAGTG-3′ (SEQ ID NO：6)

[0048] 本发明另一方面提供了一种用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含三对特异性引物，其中，第一引物对的序列是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列，第二引物对的序列是SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列，第三引物对的序列是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

[0049] 另一方面，本发明提供了一种同时检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用上述用于同时特异性检测样品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜蔓枯病菌。在该方面的一个较佳实施方案中，三重PCR的反应混合液包含，以总体积为25μl计算，ExTaq酶12.5μl，10μM的引物HX-1、HX-2、Fn-1、Fn-2、Mn-1、Mn-2分别为0.5μl、0.5μl、0.7μl、0.7μl、0.7μl、0.7μl，模板各1μl。所述步骤a)的扩增包括在94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30秒，46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

[0050] 上述实施方案中的具体数值点仅仅是起列举作用，而没有限定作用。本领域技术人员能够理解，在距所述具体数值5％的范围内的数值也应当能实现相同/相似的目的，产生相同/相似的效果，这些技术方案也均在本发明的等价范围内。

[0051] 在所述方法中，样品可以是例如，但不局限于，瓜类植株的子叶、幼茎、真叶、茎、荚及种子，较佳的是上述植株组织的DNA提取物。所述DNA提取物可用市售的DNA提取试剂盒或其他常规的DNA提取方法获得。本发明实施例虽然以西瓜和黄瓜作为例子来进行说明，应当理解的，本发明方法适用的瓜并不局限于西瓜和黄瓜，其还可包括甜瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。在另一较佳的实施方案中，所述样品也可以来自土壤或其他怀疑含有瓜黑星病菌的任何样品。

[0052] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

[0053] 实施例

[0054] 1材料方法：

[0055] 1.1供试菌株：

[0056] 本实施例的采用的用于特异性引物筛选的供试菌株种名、来源及数量见下表。

[0057] 表1

[0058]

[0059]

[0060] 注：+为有扩增产物；-为无扩增产物。

[0061] 1.2菌丝体培养与收集

[0062] 将供试的黄瓜黑星病菌在PDA平板上，21℃培养5-7天后，从菌落边缘切取菌丝块转至PDB液体培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)中(每250ml锥形瓶中装100ml培养液)，21℃，100rpm振荡培养7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20℃保存备用。

[0063] 将供试的西瓜枯萎病菌、西瓜蔓枯病菌在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上，26℃培养7天后，从菌落边缘切取菌丝块转至PDB液体培养基中(每250ml锥形瓶中装100ml培养液)，28℃，100rpm振荡培养7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20℃保存备用。

[0064] 1.3基因组DNA的提取

[0065] 1.3.1菌丝基因组DNA的提取

[0066] 根据Sun等[2]方法改进优化：

[0067] A、0.008g菌丝粉样品，石英砂研钵研磨，移至1.5毫升管，加25微升20％SDS，加700微升提取液，50微升溶菌酶，旋涡混匀；

[0068] B、37℃水浴30分钟，加700微升氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心混合，12000rpm(转/分钟)离心5分钟；

[0069] C、取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心混合，12000rpm离心5分钟；

[0070] D、取上清液，加等体积的异戊醇，10％体积的NaAc(pH5.2)溶液，-20℃沉淀20分钟；

[0071] E、12000rpm离心5分钟，弃上清液，用70％乙醇洗沉淀3次，干燥后加100微升TE(核苷酸保存缓冲液，主要成分是Tris-HCl和EDTA)充分溶解，-20℃保存。

[0072] 1.3.2发病组织DNA的快速提取：

[0073] 根据Hong等[3]的方法改进优化：取一段新发病的植物组织(叶片或瓜肉)，每毫克组织加入20μl 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入495μl 0.1mMTris缓冲液(PH 8.0)，混匀后取
1μl直接用于PCR反应。

[0074] 1.4核糖体基因转录间隔区ITS的PCR扩增和序列测定

[0075] 采用真核生物的通用引物ITS4/ITS5扩增黑星病基因组DNA，引物由上海生工合成：

[0076] ITS4(5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)

[0077] ITS 5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)

[0078] PCR扩增反应程序：95℃预变性10分钟，进入循环，94℃变性30秒，42℃退火2分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后，取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。扩增产物由上海生工测序。

[0079] 1.5.引物HX1/HX2的设计

[0080] 根据黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum rDNA的ITS序列，比对近缘种及瓜类不同致病病原菌的ITS序列同源性，同时为了和瓜枯萎病、瓜蔓枯病、瓜炭疽病、瓜菌核病等瓜类病害检测引物组合多重PCR，扩增产物设定200bp左右最佳。用引物设计软件Primer Premier 5设计出特异性引物HX-1/HX-2，序列如下：

[0081] HX-15′-TGTTGTCCGACTCTGTTGC-3′

[0082] HX-25′-CATTTCGCTGCGTTCTTC-3′

[0083] 并对引物进行分析和评价，理论上PCR扩增产物的大小应为190bp。

[0084] 1.6引物HX1/HX2退火温度的选择

[0085] 根据HX1/HX2的碱基序列初步估算退火温度为58℃，在58℃到66℃之间设计梯度PCR程序，共8个梯度，依次为：58.0℃、58.6℃、59.7℃、61.2℃、63.0℃、64.4℃、65.5℃、66℃，摸索出引物扩增的最佳退火温度。

[0086] 1.7引物HX1/HX2的PCR扩增

[0087] 引物HX-1/HX-2检测黑星病的PCR反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物各0.5μl，模板DNA若干.在PTC-200PCR仪上扩增。反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共32个循环，最后72℃延伸
7分钟。反应结束后，取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。

[0088] 1.8三重PCR体系的建立

[0089] 1.8.1三重PCR引物的筛选

[0090] 选择合适的引物进行多重组合时首先要考虑引物的扩增产物大小不能太接近，便于电泳图谱分析，也便于实际应用推广。扩增产物范围一般相差40-100bp时较为合适，对于扩增片段相差较小和较大的组合，都不宜于进行数据的统计和分析。

[0091] 对现有文献报道检测瓜类病害的引物进行搜索，根据扩增产物片段大小选定两对引物：Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2。本文所用的引物组合如下表2所示：

[0092] 表2

[0093]真菌 引物序列 产物(bp)
Cladosporium HX-1：5′-TGTTGTCCGACTCTGTTGC-3′
190
cucumerinum HX-2：5′-CATTTCGCTGCGTTCTTC-3′
Fusarium Fn-1：5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′
327
oxysporum Fn-2：5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′
Didymella bryoniae Mn-1：5′-GGATCATTACCTAGAGTTG-3′
442
Mn-2：5′-ACGTCGTCGTTGTGAGTG-3′

[0094] 1.8.2引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系的优化[0095] 设定10个退火温度梯度：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃。对延伸时间设定四个时间梯度：1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟。循环次数的优化：循环次数选择20、25、30、35、40和45次进行多重PCR体系的优化。

[0096] 根据所得的扩增产物条带亮度，对引物量进行优化，条带亮度弱的，适当增加引物量：设定10μM引物Fn-1、Fn-2的量的三个梯度：0.6μl、0.7μl、0.8μl，设定10μM引物Mn-1、Mn-2的量的三个梯度：0.6μl、0.7μl、0.8μl，做正交实验，在退火温度在46℃时，其他条件不变，对三重PCR体系引物量优化选择，结果表明当10μM引物Fn-1、Fn-2、Mn-1、Mn-2量都为0.7μl时，反应结果最好，327bp、190bp和442bp三个条带都比较亮，亮度相差不大。

[0097] 最终优化出引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR的反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物HX-1、HX-2、Fn-1、Fn-2、Mn-1、Mn-2分别为0.5μl、0.5μl、0.7μl、0.7μl、0.7μl、0.7μl，模板各1μl。反应程序：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后，取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。

[0098] 1.8.3引物HX-1/HX-2检测体系和三重PCR检测体系的灵敏度：

[0099] 将所培养的枯萎病、蔓枯病菌、黑星病菌菌液冷冻抽干，利用优化好的尿素法提取基因组DNA，根据核算定量仪测定基因组DNA的核苷酸浓度，将基因组DNA模板浓度调至10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，在优化好的引物HX-1/HX-2检测体系和三重PCR检测体系条件下扩增，根据扩增产物的电泳情况，确定反应灵敏度。

[0100] 1.9西瓜发病组织的快速检测

[0101] 分别取0.5g发病的枯萎病、蔓枯病、黑星病植物茎组织，液氮研磨后，用改进后的CTAB法提取染病组织基因组DNA。然后利用优化好的引物HX-1/HX-2检测体系和三重PCR体系扩增检测。

[0102] 2结果与分析

[0103] 2.1引物HX1/HX2退火温度的选择

[0104] 根据引物HX1/HX2的碱基序列初步估算其退火温度为58℃，为了提高引物检测的特异性，要尽量提高退火温度，设计从58℃到66℃之间的梯度来对黄瓜黑星病菌进行扩增，结果表明，在58℃到61.2℃之间有明显很亮的带，在63.0℃带型比较弱，而在64℃到66℃之间带型几乎看不见了，为了保持检测的稳定性，设定退火温度为60℃(图1)。

[0105] 2.2引物HX-1/HX-2的特异性检验

[0106] 根据黄瓜黑星病菌Cladosporium cucumerinum rDNA的ITS序列，比对近缘种及瓜类不同致病病原菌的ITS序列同源性，利用Primer Premier5.0软件设计出一对引物HX1/HX2，能够从供试的9个Cladosporium cucumerinum菌株DNA中扩增出190bp的产物，而Cladosporium fulvum和其他65个相关和近似菌株及空白对照均无扩增条带(图2)。

[0107] 2.3引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系特异性检测[0108] 按照1.8.2中的三重PCR反应体系，同时扩增供试的瓜黑星病菌、枯萎病菌、蔓枯病菌的基因组DNA，能够同时扩增出190bp、327bp、442bp的条带，而相关或近似菌株及空白对照均无扩增条带(图3)。

[0109] 2.4引物HX1/HX2灵敏度检测

[0110] 将所培养的瓜黑星病菌液冷冻抽干，利用优化好的尿素法提取基因组DNA，根据核算定量仪测定基因组DNA的核苷酸浓度，将基因组DNA模板浓度调至10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，在优化好的PCR条件下扩增，根据扩增产物的电泳情况，确定反应灵敏度(图4)。

[0111] 2.5引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR体系检测灵敏度[0112] 将所培养的瓜枯萎病、蔓枯病、黑星病菌液冷冻抽干，利用优化好的尿素法提取基因组DNA，根据核算定量仪测定基因组DNA的核苷酸浓度，将基因组DNA从10ng/μl开始依次10倍往下稀释至1fg/μl，每浓度取1μl为模板，用三重PCR体系进行PCR扩增。结果表明在25μl的反应体系中，引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2扩增单个模板时，能够清楚的检测到10pg/μl的基因组DNA(图5)，引物HX-1/HX-2、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2同时扩增三个模板时，能够检测到300pg/μl的基因组DNA(图6)。

[0113] 2.6实体组织检测

[0114] 按照1.7中的方法从发病的黄瓜黑星病、西瓜枯萎病和西瓜蔓枯病的发病组织以及健康组织提取DNA，用引物HX-1/HX-2PCR体系和三重PCR体系进行检测。结果显示，用引物HX-1/HX-2在发病的黑星病组织上提取的DNA能够扩增出190bp的条带，而其他的健康组织上没有产生条带(图7)。按照1.8.2中的方法从发病的黄瓜黑星病、西瓜枯萎病和西瓜蔓枯病的发病组织以及健康组织提取DNA，用三重PCR体系进行检测。结果显示，在发病组织上提取的DNA能够扩增出条带，而其他的健康组织上没有产生条带(图8)。

[0115] 尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

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[0132] <170>PatentIn version 3.3

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[0135] <212>DNA

[0136] <213>人工序列

[0137] <220>

[0138] <223>引物

[0139] <400>1

[0140] tgttgtccga ctctgttgc 19

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