一种防治鸡球虫病的活载体疫苗制备方法及其用途和由其制成的口服生物制剂

摘要

本发明公开了一种防治鸡球虫病的活载体疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原基因3-1E基因的成熟肽与枯草芽孢杆菌的表达载体相连获重组表达载体，再将重组表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即得防治鸡球虫病的活载体疫苗。该活载体疫苗能用于预防和/或治疗鸡球虫病。本发明还同时公开了利用上述活载体疫苗制成的防治鸡球虫病的口服生物制剂，由活载体疫苗和载体组成，每克口服生物制剂含有活菌数为108cfu～109cfu的活载体疫苗。

权利要求

1.一种防治鸡球虫病的活载体疫苗的制备方法，其特征是：将序列为GenBank EF069437所示的柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原基因3-1E基因与枯草芽孢杆菌表达载体pBES相连获重组表达载体pBES-3-1E，再将重组表达载体pBES-3-1E转入枯草芽孢杆菌1A751宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即得防治鸡球虫病的活载体疫苗；

所述枯草芽孢杆菌表达载体pBES的构建方法如下：

1)、引物设计

根据pUS186质粒启动子-信号肽序列两端设计引物，序列如下：

5Pb18-1：5’-AGGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTC-3’

3Pb18-1：5’-AAATGCCTCACATTTGTGCCACCTA-3’；

2)、PCR扩增启动子-信号肽序列

以质粒pUS186为模板，5Pb18-1和3Pb18-1为引物，PCR扩增长度为581bp的含

43

B.subtilis强启动子PEσ 和芽孢杆菌淀粉酶天然信号肽SP序列的基因片段；PCR扩增条件是94℃变性2min后进入循环，94℃变性45s，58℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环后在72℃延伸10min；PCR产物标记为PCR/BPS，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

3)、PCR产物PCR/BPS纯化

琼脂糖凝胶回收步骤见试剂盒说明，所述试剂盒为AxyGEN公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒；

4)、双酶切PCR/BPS片段与pBE2载体枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pBE2，是pUB110的衍生载体；分别将质粒pBE2和PCR产物PCR/BPS进行EcoRI和XbaI双酶切，37℃水浴过夜；双酶切体系分别如下：

10×Buffer M 3μl

BSA 0.3μl

EcoRI 1μl

XbaI 1μl

pBE2 24.7μl

Total 30μl；

10×Buffer M 2μl

BSA 0.2μl

EcoRI 1μl

XbaI 1μl

PCR/BPS 15.8μl

Total 20μl；

5)、连接

在1.5ml离心管中加入上述pBE2载体的EcoRI和XbaI双酶切产物3μl、上述PCR/BPS的EcoRI和XbaI双酶切产物5μl、T4DNA连接酶1μl、10×T4DNA ligase buffer 1μl，轻轻混匀，稍离心后，置16℃恒温仪连接过夜；所得的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、进行菌落PCR验证；

上述构建而得的枯草芽孢杆菌表达载体pBES含有强启动子和信号肽。

2.根据权利要求1所述的防治鸡球虫病的活载体疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1)、将3-1E基因克隆入载体pMD18T，得到含有3-1E基因的克隆载体，命名为pMD18T-3-1E；

2)、选用枯草芽孢杆菌表达载体pBES；

3)、将3-1E基因从pMD18T-3-1E用限制性内切酶XbaI与Pst I酶切下来，得到酶切产物；再用限制性内切酶XbaI与Pst I将枯草芽孢杆菌表达载体pBES酶切后，将上述酶切产物用T4DNA连接酶与酶切后的枯草芽孢杆菌表达载体pBES连接；得连接产物；

4)、将上述步骤3)所得的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、进行菌落PCR验证；得到含有3-1E的重组质粒，命名为pBES-3-1E；

5)、将上述pBES-3-1E在枯草芽孢杆菌1A751中转化和涂板；得活载体疫苗。

3.利用如权利要求1或2所述的方法制备而得的活载体疫苗制成的防治鸡球虫病的口服生物制剂，其特征是：所述口服生物制剂由活载体疫苗和载体组成，每克口服生物制剂含

8 9

有活菌数为10cfu～10cfu的活载体疫苗。

4.根据权利要求3所述的防治鸡球虫病的口服生物制剂，其特征是：所述载体由重量比为5～50％的沸石粉和50～95％的玉米淀粉组成。

5.根据权利要求4所述的防治鸡球虫病的口服生物制剂，其特征是：所述沸石粉和玉米淀粉均能过80～200目筛。

说明书

一种防治鸡球虫病的活载体疫苗制备方法及其用途和由其

制成的口服生物制剂

技术领域

[0001] 本发明提供一种具有防治鸡球虫病的活载体疫苗制备方法及其用途。 背景技术

[0002] 鸡球虫病是一种对养鸡业危害很大的原虫病，集约化养鸡场是球虫病爆发的最适宜场所，78.7％的集约化养鸡场存在着不同程度的感染，全世界因鸡球虫病造成的经济损失每年约20亿英镑(Lee，2010)。鸡球虫病主要由一种或几种艾美耳球虫传染造成，主要由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病；多发于3月龄以内的仔鸡，尤以15日龄～50日龄的雏鸡最易感染；温暖潮湿的月份多发，冬季发病较少。患急性型球虫病，病程数日至2～3周，多数鸡于发病后6～10d死亡，雏鸡死亡率为50％。慢性型多发生于4～6月份，成鸡病程缓慢，死亡率较低。其发病率可达100％，病死率为
20％～30％，严重者可高达80％。

[0003] 搞好鸡舍的环境卫生是防制球虫病的中心环节，药物预防是防制球虫病的重要手段。自从Levine发现磺胺类药物具有抗球虫作用以来，用作预防球虫的药物有50多种。按其化学结构和生产过程大致分为三大类：一类是聚醚类离子载体抗生素，另一类是化学合成类抗球虫药，第三类是中草药制剂。由于化学药物防治球虫病存在着抗药性，用药方法不当和药物残留等缺点及免疫预防尚存的不足，人们尝试着开发中草药资源，用以防治鸡球虫病，一些研究表明，中草药不仅有抑杀球虫的作用，而且还能增强鸡体的免疫功能，促进鸡的生长发育，提高增重率和生产性能。目前已经研究利用和开发了多种中草药抗球虫剂，防治球虫病效果明显(晋爱兰，2009，李旭红and刘毅，2009)。又如专利200910304688.1公开了一种治疗鸡寄生球虫病的中药组合物，其组合物吸收快、安全系数高，无药残、无毒副作用，不会产生抗药性。但由于目前我国中草药存在着提取复杂、研究程度的限制和研究技术、经费投入等的不足，仍难以看到突破性进展的曙光。

[0004] 使用强毒苗和致弱球虫苗接种预防不失为一种手段，但强毒苗仅适用于种鸡，不完全适用于蛋鸡和肉鸡，肉鸡虽可用弱毒球虫苗，便又存在稳定性差，接种量难于控制，费用高等问题。球虫细胞表面抗原直接与宿主细胞接触，参与球虫侵入宿主细胞及其后的内化 过程，并作为主要抗原成分激发宿主的免疫反应，所以是研制重组疫苗理想的候选抗原。子孢子表面抗原是指在孢子生殖过程中表达的抗原，研究较多的主要有3-1E、cSZ1(覃宗华，2005)、cSZ2(Shah，2010)、TA4(Xu，2008，张莉，2006)等，其中3-1E在子孢子和裂殖子阶段均有表达。如专利200510108341.1公开了利用鸡球虫的3-1E基因等构建了融合基因和嵌合疫苗，并制备了融合蛋白；Song等(2000)将鸡堆型艾美耳球虫(E.acervulina)3-1E抗原基因的cDNA插入载体pMP13，构建成DNA疫苗，E.acervulina攻虫后检测到较高的循环抗体水平(Lillehoj，2000)。Lillehoj等(2005)将3-1E基因分别与白介素IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-18及γ-干扰素等细胞因子佐剂连接，重组体有明显的免疫保护作用(Lillehoj，2005)。覃宗华等(2005)在成功克隆E.acervulina广东株(GD)子孢子表面保护性抗原基因cSZ1的基础上，构建了表达cSZ1的重组减毒沙门氏菌，而后以108或109CFU/只经口免疫4日龄雏鸡，25日龄时2个试验组均能诱导肠道特异性IgA的分泌；
且分别能降低25.1％和46.4％的卵囊产生(覃宗华，谢明权，2005)；相似的是，Shah等以cSZ2构建DNA疫苗，结果表明cSZ2DNA疫苗能诱导免疫反应，通过减少肠损害，体量减轻和卵囊率并形成了区部的保护(Shah，Yan，2010)。Xu等(2006)将E.tenella 3-1E抗原基因和鸡γ-干扰素基因融合形成嵌合基因(prolE)，构建了嵌合DNA疫苗和嵌合蛋白(rlE)，研究表明与DNA疫苗(proE)，DNA疫苗(prolE)能更大程度上减少卵囊脱落，但DNA疫苗(prolE)未能增加抗体滴度和体重；但嵌合蛋白(rlE)则更大程度上减少卵囊脱落，同时也能增加抗体滴度和体重(Xu，2006)。可见，球虫的免疫保护作用越来越受到人们的重视，尤其以子孢子抗原或基因的重组生物制剂效果最佳。

[0005] 然而在规模化养殖中，重组蛋白保护效果却不尽人意，尤其通过口服途径，抗原在消化道降解、吸收率低等原因造成保护剂量的不足。

[0006] 以上文献和专利公开的生产疫苗，采用了在弱毒疫苗、DNA疫苗、重组蛋白和中草药复剂来提高鸡的免疫保护作用。而利用弱毒疫苗，有毒力返强的危险，抗体维持时间不长，有的疫苗由于减毒不彻底，有一定的副作用和不利于运输保存；DNA疫苗产生安全性问题，包括可能致癌和产生DNA抗体及基因漂移等；重组蛋白存在制作过程复杂、成本较高和疫苗需低温保存等缺点；而中草药存在提成本高、作用机制复杂等缺陷。 [0007] 上文中提及的参考文献具体如下：

[0008] 1.Lee，B.H.，W.H.Kim，J.Jeong，J.Yoo，Y.K.Kwon，B.Y.Jung，J.H.Kwon，H.S.Lillehoj，and W.Min，Prevalence and Cross-Immunity of Eimeria Species on Korean Chicken Farms.J Vet Med Sci，2010.(L ee，B.H.，W.H.Kim，J.Jeong，J.Yoo，Y.K.Kwon，B.Y.Jung，J.H.Kwon，H.S.Lillehoj，和W.Min，不同艾美球菌在韩国鸡场的流行和交叉免疫.J Vet Med Sci，2010.)

[0009] 2.晋爱兰，陈秀真，张供领，李亚峰，许腾，and万双秀，中药常山及其组方与西药对鸡球虫病的疗效对比试验.中国动物检疫，2009(008)：p.56-57.

[0010] 3.李旭红和刘毅，中草药复方制剂抗鸡球虫效果的研究.湖南农业科学，2009(005)：p.146-148.

[0011] 4.覃宗华，谢明权，蔡建平，艾哈迈德，and叶秀华，堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究.寄生虫与医学昆虫学报，2005.12(001)：p.6-13. [0012] 5.Shah，M.A.，R.Yan，L.Xu，X.Song，and X.Li，A recombinant DNA vaccine encodingEimeria acervulina cSZ-2 induces immunity against experimental E.tenella infection.VetParasitol，2010.169(1-2)：p.185-9.(Shah，M.A.，R.Yan，L.Xu，X.Song，和X.Li，编码堆形艾美耳球虫cSZ-2的重组DNA疫苗诱导免疫抵抗柔嫩艾美耳球虫侵染.Vet Parasitol，2010.169(1-2)：p.185-9.)

[0013] 6.Xu，Q.，X.Song，L.Xu，R.Yan，M.A.A.Shah，and X.Li，Vaccination of chickens witha chimeric DNA vaccine encoding Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 induces protectiveimmunity against coccidiosis.Veterinary parasitology，2008.156(3-4)：p.319-323.(Xu，Q.，X.Song，L.Xu，R.Yan，M.A.A.Shah，和X.Li，接种编码柔嫩艾美耳球虫TA4和鸡IL-2的嵌合DNA疫苗的鸡诱导保护免疫抵抗球虫病.Veterinary parasitology，2008.156(3-4)：p.319-323.)

[0014] 7.张莉，秦泽荣，崔尚金，何召庆，and刘尚高，柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达.中国预防兽医学报，2006.28(003)：p.271-274. [0015] 8.Lillehoj，H.S.，K.D.Choi，M.C.Jenkins，V.N.Vakharia，K.D.Song，J.Y.Han，and E.P.Lillehoj，A recombinant Eimeria protein inducing interferon-gamma production：comparison ofdifferent gene expression systems and immunization strategies for vaccination againstcoccidiosis.Avian Dis，2000.44(2)：p.379-89.(Lillehoj，H.S.，K.D.Choi，M.C.Jenkins，V.N.Vakharia，K.D.Song，J.Y.Han， 和E.P.Lillehoj，重组艾美球菌蛋白诱导λ干扰素产生：比较疫苗抵抗球菌病的不同基因表达系统和免疫策略.Avian Dis，2000.44(2)：p.379-89.)

[0016] 9.Lillehoj，H.S.，X.Ding，R.A.Dalloul，T.Sato，A.Yasuda，and E.P.Lillehoj，Embryovaccination against Eimeria tenella and E. acervulina infections using recombinant proteins and cytokine adjuvants.J Parasitol，2005.91(3)：p.666-73.(Lillehoj，H.S.，X.Ding，R.A.Dalloul，T.Sato，A.Yasuda，和E.P.Lillehoj，Embryo.利用重组蛋白和细胞因子佐剂的胚胎接种疫苗抵抗柔嫩艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫侵染.J Parasitol，2005.91(3)：p.666-73.)

[0017] 10.Xu，S.Z.，T.Chen，and M.Wang，Protective immunity enhanced by chimeric DNAprime-protein booster strategy against Eimeria tenella challenge.Avian Dis，2006.50(4)：p.579-85.(Xu，S.Z.，T.Chen，and M.Wang，通过嵌合DNA主要蛋白增强策略增加保护免疫抵抗柔嫩艾美耳球虫侵染.Avian Dis，2006.50(4)：p.579-85.) 发明内容

[0018] 本发明要解决的技术问题是提供一种使用安全且能有效防治鸡球虫病的活载体疫苗及相应的口服生物制剂。

[0019] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治鸡球虫病的活载体疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫子孢子抗原基因3-1E基因的成熟肽与枯草芽孢杆菌的表达载体相连获重组表达载体，再将重组表达载体转入枯草芽孢杆菌宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即得防治鸡球虫病的活载体疫苗。

[0020] 作为本发明的防治鸡球虫病的活载体疫苗的制备方法的改进，其包括以下步骤： [0021] 1)、将3-1E基因的目的片段克隆入载体pMD18T vector，得到含有3-1E基因的克隆载体，命名为pMD18T-3-1E；

[0022] 2)、选用枯草芽孢杆菌表达载体pBES；

[0023] 3)、将3-1E基因从pMD18T-3-1E用限制性内切酶Xba I与Pst I酶切下来，得到酶切产物；再用限制性内切酶Xba I与Pst I将枯草芽孢杆菌表达载体pBES酶切后，将上述酶切产物用T4 DNA连接酶与酶切后的枯草芽孢杆菌表达载体pBES连接；得连接产物； [0024] 4)、将上述步骤3)所得的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、进行菌落PCR验证；得到含有3-1E的重组质粒，命名为p BES-3-1E； [0025] 5)、将上述pBES-3-1E在枯草芽孢杆菌1A751中转化和涂板；得活载体疫苗。 [0026] 本发明还同时提供了上述活载体疫苗的用途：用于预防和/或治疗鸡球虫病。 [0027] 本发明还同时提供了利用上述活载体疫苗制成的防治鸡球虫病的口服生物制剂，8
该口服生物制剂由活载体疫苗和载体组成，每克口服生物制剂中含有活菌数为10cfu～
9
10cfu的活载体疫苗。

[0028] 作为本发明的防治鸡球虫病的口服生物制剂的改进：载体由重量比为5-50％的沸石粉 和50-95％的玉米淀粉组成。沸石粉和玉米淀粉均能过80～200目筛。 [0029] 在本发明中，活载体疫苗可按照本发明提供的方法制备，沸石粉和玉米淀粉均能通过市购的方式获得。

[0030] 本发明的防治鸡球虫病的口服生物制剂的保藏条件为：室温，有效期为2年。 [0031] 本发明的防治鸡球虫病的口服生物制剂实际使用时，按照占鸡饲料总重的0.1％～1％的比例加入鸡饲料中，均匀混合后即可按照常规方法进行喂食。 [0032] 本发明充分利用了枯草芽孢杆菌的以下优势：1)高分泌能力，使得重组表达的药用蛋白不需要经过下游的纯化和分离，也使得分泌的抗原蛋白能有效递呈至宿主的免疫系统引起免疫应答；2)将抗原蛋白展示于芽孢外表面，可作为口服疫苗的应用；3)芽孢耐热、耐酸及耐盐的特性，能耐受胃肠道环境且更利于保存；4)快速、简捷的发酵和生产技术； [0033] 5)本身为益生菌，若作为疫苗载体可起到佐剂的作用。

[0034] 本发明所提供的口服生物制剂，具有使用方便、预防治疗并举、生产成本低、生产方便等特点。

[0035] 采用本发明方法制备而得的活载体疫苗不需要纯化，可直接用于生产防治鸡球虫病的口服生物制剂，免去蛋白质处理的复杂工序，因而具有很好的推广使用价值。 具体实施方式

[0036] 下面的实施例有助于本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0037] 以下％均为重量％。

[0038] 下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法。

[0039] 实施例1、含有抗原基因3-1E重组质粒的构建

[0040] 一、抗原3-1E基因的克隆

[0041] 1、3-1E基因的克隆

[0042] 按照常规技术从感染E.tenella的肉鸡粪便中纯化孢子化卵囊，并提到纯种孢子化卵囊中的总RNA，以反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，并以反转录的cDNA为模板，以上游引物(SEQ ID NO：1)：

[0043] 5P31E-BS 5’-TCTAGAAATGGGTGAAGAGGCTGATACT-3’和

[0044] 下游引物(SEQ ID NO：2)：

[0045] 3P31E-BS5’-CTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’进行 PCR，获得目的基因(3-1E基因)。

[0046] PCR反应体系为：

[0047] cDNA 1.0μl

[0048] 引物5P31E-BS(10mM) 1.0μl

[0049] 引物3P31E-BS(10mM) 1.0μl

[0050] Taq酶(5U/μl) 0.5μl

[0051] 10×PCR buffer(含Mg2+) 5.0μl

[0052] dNTP(10mM each) 1.0μl

[0053] ddH2O 40.5μl

[0054] Total 50.0μl

[0055] 稍离心，置于PCR仪中；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，40℃退火30s，72℃延伸40s，反应5个循环；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，反应30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR产物标记为3-1E，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。并割胶回收，琼脂糖凝胶回收步骤见试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，AxyGEN公司)说明。 [0056] 将513bp的3-1E基因(序列见GenBank EF069437)的目的片段克隆入载体pMD18Tvector(购于TaKaRa生物工程有限公司(大连))中，得到含有3-1E基因的克隆载体，命名为pMD18T-3-1E。

[0057] 2、构建枯草芽孢杆菌表达载体pBES：

[0058] 可参照傅玲琳《对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究.浙江大学博士论文，2008》进行构建，具体内容如下： [0059] 2.1引物设计

[0060] 根据pUS186质粒启动子-信号肽序列两端设计引物，序列如下：

[0061] 5Pb18-1：5’-AGGCTTTTAAGCCGTCTGTACGTTC-3’(SEQ ID NO：3)

[0062] 3Pb18-1：5’-AAATGCCTCACATTTGTGCCACCTA-3’(SEQ ID NO：4)

[0063] 2.2PCR扩增启动子-信号肽序列

[0064] 以质粒pUS186为模板，5Pb18-1和3Pb18-1为引物，PCR扩增长度为581bp的含43
B.subtilis强启动子PEσ 和芽孢杆菌淀粉酶天然信号肽SP序列的基因片段。PCR扩增条件是94℃变性2min后进入循环，94℃变性45s，58℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环后在72℃延伸10min。PCR产物标记为PCR/BPS，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。 [0065] 2.3PCR产物PCR/BPS纯化

[0066] 琼脂糖凝胶回收步骤见试剂盒(AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，AxyGEN公司)说明。

[0067] 2.4双酶切PCR/BPS片段与pBE2载体

[0068] 枯草芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭载体pBE2，是pUB110的衍生载体，可按郭兴华等方法(郭兴华，熊占，周民，贾士芳，许怡.枯草杆菌一大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报.1991，7(3)：224-229)构建保存。分别将质粒pBE2和PCR产物PCR/BPS进行EcoRI和XbaI双酶切，37℃水浴过夜。双酶切体系分别如下：

[0069]

[0070] 2.5连接

[0071] 在1.5ml离心管中加入pBEC(EcoRI-XbaI)3μl、PCR/BPS(EcoRI-XbaI)5μl、T4DNA连接酶1μl、10×T4 DNA ligase buffer 1μl，轻轻混匀，稍离心后，置16℃恒温仪连接过夜。所得的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、进行菌落PCR验证。

[0072] 上述构建而得的枯草芽孢杆菌表达载体pBES含有强启动子和信号肽。 [0073] 3、将3-1E基因从pMD18T-3-1E用限制性内切酶Xba I与Pst I酶切下来，得到酶切产物；再用限制性内切酶XbaI与Pst I将枯草芽孢杆菌表达载体pBES酶切后，将上述酶切产物用T4DNA连接酶与其连接(3-1E基因可与任何枯草菌表达载体相连)，连接反应时间为16小时；得连接产物。

[0074] 4、将上述步骤3所得的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、进行菌落PCR验证，所用引物为：

[0075] 上游引物5P31E-BS 5’-TCTAGAAATGGGTGAAGAGGCTGATACT-3’和下游引物 [0076] 3P31E-BS 5’-CTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGGAAGCCGCCCTGGTACAGGT-3’ [0077] PCR验证体系同步骤1。

[0078] 将扩增到目的片段的克隆子提质粒、用限制性内切酶Xba I与Pst I进一步酶切鉴定，得到513bp的酶切片段的为阳性克隆质粒。再对其进行测序列分析，得到正确的含有3-1E的重组质粒，命名为pBES-3-1E。

[0079] 实施例2、重组枯草芽孢杆菌(防鸡球虫病的活载体疫苗)的制备方法： [0080] 将上述实施例1所构建的重组表达载体(重组质粒)pBES-3-1E在枯草芽孢杆菌1A751(来源于美国杆菌保藏中心BGSC)中转化(可转化任何枯草芽孢杆菌菌株)： [0081] 挑斑枯草芽孢杆菌1A751于4ml GMI培养基中(试管)，30℃培养过夜，100r/min(慢摇)10％(体积比)转接于6ml GMI培养基(三角瓶)，37℃培养3.5h，200r/min(快摇)；10％转接于20ml GMII培养基(三角瓶)，37℃培养90min，100r/min(慢摇)；离心收集菌体(1/10体积的上清液悬浮菌体)：将20ml菌液分装到4个10ml的离心管(每管
5ml)，离心收集菌体，每管剩0.5ml上清重新悬浮菌体；0.5ml菌液加重组质粒5μl；室温放置10min；

[0082] 涂板：

[0083] 直接吸200μl菌液涂布LB(Kana 5μg/ml)平板；于37℃培养箱至单菌落出现。挑取转化子进行PCR和酶切验证，鉴定扩增出513bp的克隆子即为转化子。挑斑工程菌B.subtilis(pBES-3-1E)至含5％(质量比)葡萄糖和0.2％(质量比)谷胺酰胺的LB培
9
养基中，37℃，180rpm振荡培养至细胞密度为10cfu/ml，收集菌体后用玉米淀粉吸附，并进
10
行菌落计数。具体可为：每克玉米淀粉吸附10 cfu活载体疫苗；得菌粉。 [0084] 实施例3、预防鸡球虫病的口服生物制剂的制备

[0085] 将25重量份的沸石粉与75重量份的玉米淀粉相混合，该沸石粉和玉米淀粉均能过100目筛；得载体。

[0086] 将实施例2所得的菌粉与上述载体按1∶9的重量比进行混合，简单加以搅拌混9
合即得防治鸡球虫病的口服生物制剂；每克该口服生物制剂含有10cfu的活载体疫苗。 [0087] 实施例4免疫保护试验

[0088] 100只1日龄艾维音肉鸡随机分成5组，每组20只。分别为非感染非免疫对照组(CK1)、感染非免疫对照组(CK2)、芽孢杆菌空载体对照组(B.S[pBES]，记为B.S-P，其含量等同本发明)、口服本发明(实施例3)的生物制剂的作为试验组(B.S[pBES-3-1E]，记为 B.S-31E)、抗球虫药癸氧喹酯对照组(Decoquinate，记为Dec)。

[0089] 芽孢杆菌空载体对照组：5g芽孢杆菌空载体/kg饲料。

[0090] 试验组(本发明)：5g口服生物制剂/kg饲料。

[0091] 抗球虫药癸氧喹酯对照组：0.5g癸氧喹酯/kg饲料。

[0092] 预试期7天后，试验组及对照组均采用拌料方式进行口服免疫，连续免疫10天。试验期间自由采食和饮水。17日龄(攻虫前)时，每组随机宰杀5只，取全血、血清及盲肠粘膜，以备指标测定。24日龄时(攻虫后第8天)全部宰杀。

[0093] 试验结果如下：

[0094] 1、增重效果

[0095] 表1各组鸡体重变化

[0096]

[0097] 注：同列肩标不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)，含相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，下同。

[0098] 表2各组鸡体增重变化

[0099]

[0100] 注：平均增重1是指攻虫前鸡的增重；平均增重2是指攻虫后鸡的增重； [0101] 由表1和表2可见免疫前各组鸡体重变化差异不显著(P＞0.05)。免疫后攻虫前，B.S-P组相对增重不仅显著高于B.S-31E组和Dec组(P＜0.05)，也显著高于CK1组(P＝0.048)，B.S-31E组和Dec组略低于CK1组，但差异不显著(P＞0.05)。以上结果表明，含空表达 载体的枯草芽孢杆菌能显著促进肉鸡的生长；表达3-1E基因的口服生物制剂组和癸氧喹酯对肉鸡生长无不良影响。

[0102] 攻虫后，所有感染组鸡相对增重均显著低于非感染组(CK1组)(P＜0.05)；在感染组中，B.S-31E组和Dec组鸡相对增重显著高于CK2组和B.S-P组(P＜0.05)，而B.S-31E组和Dec组差异均不显著。以上结果表明，口服生物制剂组、癸氧喹酯对球虫病引起的体重降低有一定的抑制作用，而含空表达载体的枯草芽孢杆菌无此作用。

[0103] 2、OPG值(克粪便卵囊数)

[0104] 攻虫后每天检查粪便，从第5天开始分别收集各组粪便，连续收集6天，混匀后，每组各取1g，加入10mL蒸馏水制成10倍稀释液，经充分搅拌均匀后于显微镜下用红细胞计数板计数每克粪便中的虫卵数。卵囊减少率(保护率)＝[(感染非免疫组粪便卵囊排出量-试验组粪便卵囊排出量)/感染非免疫组粪便卵囊排出量]×100％。结果如表3所示。

[0105] 表3各组OPG值

[0106]

[0107] 由表3可见，CK1组(非攻虫组)粪便中无卵囊；与CK2组相比，B.S-P组、口服生物制剂组和Dec组的克粪便卵囊数均极显著降低(P＜0.01)，其中口服生物制剂组又极显著低于B.S-P组和Dec组，后二者差异不显著。以CK1组和CK2组卵囊减少率分别为100％和0％计，B.S-P组、口服生物制剂组和Dec组的卵囊减少率分别为45.17、63.70和31.87％。
以上结果表明，含空载体或3-1E抗原基因的枯草芽孢杆菌及癸氧喹酯对鸡球虫在体内的繁殖均有一定的抑制作用，其中口服生物制剂组的效果最好。

[0108] 3、盲肠病变记分

[0109] 攻虫后第8天，每组取5只扑杀，观察盲肠病变。

[0110] 相对病变计分＝(试验组病变记分/感染非免疫组病变记分)×100％ [0111] 按Johnson等的方法进行盲肠病变记分，将盲肠病变分为0-+4五个等级。 [0112] 0分，无肉眼病变

[0113] +1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。 [0114] +2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。 [0115] +3分，盲肠内有多量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。

[0116] +4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分。结果如表4所示。

[0117] 表4各组盲肠病变记分

[0118]

[0119] 由表4可见，CK1组盲肠无病变；与CK2组和B.S-P组相比，口服生物制剂组和Dec组的盲肠病变记分均极显著降低(P＜0.01)，说明口服生物制剂组和癸氧喹酯均对鸡球虫造成的盲肠病变有一定的改善作用。

[0120] 4、抗球虫指数(ACI)

[0121] 抗球虫指数(ACI)＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)

[0122] 存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％

[0123] 相对增重率＝(最后扑杀时重/非感染非免疫组增重)×100％

[0124] 病变值＝各试验组的平均病变记分(0-4)×10

[0125] 卵囊值按以下方法计算(如表5)，结果如表6所示。

[0126] 表5

[0127] 粪便卵囊排除数(106) 卵囊值

[0128] 小于0.1 0

[0129] 0.1-1.0 1

[0130] 2.0-5.0 10

[0131] 6.0-10.0 20

[0132] 大于11.0 40

[0133] 以ACI≥180为保护效果显著，ACI＝160-179为保护效果一般，ACI＜160为无保护效果。

[0134] 表6、各组抗球虫指数

[0135]

[0136] 由表6可见，所有攻虫组的ACI显著低于CK1组(P＜0.05)，但Dec组和口服生物制剂组ACI分别比CK2组显著提高了18.5％(P＝0.002)和18.8％(P＝0.001)，分别比B.S-P组显著提高了14.6％(P＝0.033)和14.9％(P＝0.029)。根据“ACI≥180为保护效果显著，ACI＝160-179为保护效果一般，ACI＜160为无保护效果”这一原则可以判断，表达3-1E抗原基因的枯草芽孢杆菌(本发明的口服生物制剂)和癸氧喹酯均有显著保护效果；枯草芽孢杆菌也有一定保护作用，但效果一般。

[0137] 以上结果说明，本发明的口服生物制剂是一种防预防鸡球虫病效果最好的安全的、使用方便的生物制剂。

[0138] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。