一种具有治疗类风湿关节炎作用的组合物

摘要

本发明提供一种具有治疗类风湿关节炎作用的组合物，由白芍总苷、青藤碱和甘草酸组成，在治疗类风湿关节炎方面，取得了良好的效果。

权利要求

1.一种具有治疗类风湿关节炎作用的药物组合物，其特征在于，由白芍总苷、青藤碱和甘草酸组成的药物组合物，其质量份数为：30-85质量份数的白芍总苷；5-50质量份数的青藤碱；2-50质量份数的甘草酸。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，所述白芍总苷的提取方法为：将芍药粉碎、

40-90％乙醇回流提取，提取三次，合并提取液，浓缩液为生药量35％-45％时，在浓缩液中加入饱和NaHCO3溶液将pH值调至5.9-6.1，上述药液中加入乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液中加入体积比为30∶70的正丁醇∶乙酸乙酯混合液进行萃取，合并正丁醇乙酸乙酯萃取液，将萃取液浓缩、干燥、粉碎、混合，得白芍总苷提取物。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征是该药物组合物应用于治疗类风湿性关节炎。

说明书

一种具有治疗类风湿关节炎作用的组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及由白芍总苷、青藤碱和甘草酸组成的组合物、该组合物的制备方法及其在治疗类风湿关节炎方面的应用。

背景技术

[0002] 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是风湿病中的一种，是一种难治的自身免疫性疾病，由于对其发病机制尚不清楚，国内外还没有令人满意的疗法。国内外的学者从多个方面开展了大量的研究工作，试图揭示该病的本质特点和机制，寻找药物作用的靶点，开发新的治疗药物，但尚无重大突破。

[0003] RA的主要临床表现为关节肿胀疼痛、晨僵、功能障碍和实验室免疫学等指标异常，目前认为其病理机制主要与机体免疫功能调节失衡有关，关节局部主要表现为滑膜细胞类似肿瘤样异常增殖。RA的治疗需要长期用药，目前临床上的治疗药物有非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药等。非甾体抗炎药(如阿司匹林、双氯芬酸等)只是针对RA的症状控制，不能改善病情，由于其主要通过抑制前列腺素发挥作用，长期使用胃肠道、肝肾损害等不良反应多；慢作用抗风湿药(如甲氨蝶呤等)虽可部分改善RA病情，但起效缓慢，无直接抗炎作用，且由于其主要通过免疫抑制和抗代谢发挥作用，长期使用会出现类似抗肿瘤药物的不良反应。

[0004] 据世界卫生组织和美国风湿病协会的资料显示，全球目前患有急性风湿病、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、骨性关节炎、痛风等风湿病症的患者约有3.6亿人，是医学领域中公认的庞大疾病族群。从患病人数上看，我国也是风湿病的发病大国，风湿性、类风湿性关节炎患者几乎占到人口总数的18％，其中重症患者达到8000万。在我国风湿病患病人群当中，50岁以上人群中约有50％患有不同程度的风湿疾病，在潮湿地区的发病率高达40％。根据相关调查数据显示，从2000年至今，我国风湿病患者每年的用药金额基本都保持在200亿元以上。毋庸置疑，风湿病用药在我国的用药市场中仍将处于潜力发掘期。

[0005] 白芍总苷从传统中药白芍中提取的有效部位，是宁波立华制药独家生产的原料药。批准文号为国药准字H20054521，为国内首创，是唯一的中药来源的治疗风湿免疫性疾病的白芍类药物，无同类竞争产品。是一种全新的抗炎免疫调节药，经药理毒理研究表明，具有较强的抗炎和免疫调节作用，毒性小，无明显不良作用；既有显著的抗炎镇痛作用，又能对患者异常的免疫功能起双向调节作用，使过低或过强的免疫功能恢复正常。和其它治疗类风湿关节炎的药物明显不同的是，白芍总苷具有毒性低微，安全范围大，副作用少而轻，而且不需对症处理的特点。

[0006] 在白芍总苷具有治疗类风湿关节炎确切疗效的基础上，立华制药一直致力于提高疗效、改进工艺等后续产品的开发，在已有文献资料的基础上，进行了相关组合物研究，目的在于提高对类风湿关节炎这一疾病的治疗作用、增进吸收，改善机体对芍药苷的生物利用度。

[0007] 在治疗类风湿关节炎的组合物及复方的研究方面，与白芍总苷配伍应用的专利主要有以下2个：一个为“用于治疗或改善关节炎的药物组合物和饮食补充剂”的发明专利(授权公告号为：CN 1218697C)。公开了由青藤碱、芍药苷、阿魏酸组成的组合物及治疗类风湿关节炎的作用。另一个为“白芍甘草提取物及其制备方法”的发明专利(授权号为：CN1200723C)，此专利，公开了白芍与甘草的提取物配伍，主要用于解痉止痛，治疗病毒性肝炎作用。相关的论文：白芍总苷(芍药苷)与青藤碱的论文，集中在药动学研究方面，提示青藤碱能增加芍药苷的吸收。白芍总苷(芍药苷)与甘草提取物的研究方面，集中在配伍作用的研究方面。在已有文献基础上，本发明通过大量动物实验和临床试验，证明了采用白芍总苷、青藤碱和甘草酸3种药物的组合物在治疗类风湿关节炎的药效学、药动学、临床疗效方面优于已有文献中提到的其中2种配伍应用的组合物。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种从芍药中提取得到的有效部位白芍总苷和青藤碱提取、纯化得到的有效成分青藤碱(或盐酸青藤碱)以及甘草中提取得到的有效成分甘草酸的构成的组合物及其制备方法。

[0009] 本发明的目的是提供白芍总苷、青藤碱和甘草酸组成的组合物在治疗类风湿关节炎疾病中的应用。

[0010] 上述目的通过以下的技术方案实现：

[0011] 一种药物组合物，其组成包括白芍总苷、青藤碱和甘草酸。其质量份数为：30-85质量份数的白芍总苷；5-50质量份数的青藤碱；2-50质量份数的甘草酸。

[0012] 组合物中白芍总苷、青藤碱、甘草酸的获得形式有2种，一种为采用具有国药准字批准文号的原料药。一种是采用提取分离的方法得到所需的原料。组合物中3种原料的制备方法如下；

[0013] 白芍总苷的制备方法为：将芍药粉碎、40-90％乙醇回流提取，提取三次，合并提取液，浓缩液为生药量35％-45％时，在浓缩液中加入饱和NaHCO3溶液将PH值调至5.9-6.1。上述药液中加入乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液中加入正丁醇∶乙酸乙酯混合液(30∶70V/V)进行萃取，合并正丁醇乙酸乙酯萃取液。将萃取液浓缩、干燥、粉碎、混合，得白芍总苷有效部位提取物。白芍总苷在组合物中的含量以芍药苷及芍药内酯苷为检测指标，芍药苷的含量40％-90％，芍药内酯苷的含量为10％-20％。

[0014] 盐酸青藤碱制备方法为：采用青风藤药材经过粉碎得到青风藤粉，将青风藤粉经碱化水回流提取3次，合并提取液，浓缩得到青藤碱浸膏，将青风藤浸膏上大孔树脂富集得到青藤碱粗品。将青藤碱粗品加盐酸调PH值在2-3.5之间，活性炭脱色，抽滤，再加盐酸调PH值在2-3.5之间，静置过夜，搅拌，抽滤，得到盐酸青藤碱。

[0015] 甘草酸的制备方法为：甘草提取物经大孔吸附树脂富集、水洗、干燥所得的化合物。

[0016] 上述白芍总苷、青藤碱(盐酸青藤碱)和甘草酸组合物的制备方法是：白芍总苷干粉、青藤碱晶体甘草酸粉末和药用辅料制备成口服制剂或注射剂或输液；口服制剂可以是普通片、分散片、缓释片、控释片、口腔崩解片、含片等片剂，丸剂，粉末混合物，颗粒剂，胶囊剂，包衣剂，溶液，乳剂，分散剂，栓剂。这些制剂按照本领域的技术人员熟知的方法制备。如制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规的辅料，例如淀粉，明胶，阿拉伯胶，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物制剂中还可有其他的辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等，制备这些可能的制剂也属于本发明的应用。

[0017] 这个技术方案有以下有益效果：

[0018] 1、本发明，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物可以制备成药剂学上的各种剂型，如片剂、胶囊剂、丸剂等，并且可以与其他活性成分组成多组分的药物组合物，提供便于服用、疗效确切的药物。

[0019] 2、本发明，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组成的组合物，在治疗类风湿关节炎方面，取得了良好的效果。附图说明：

[0020] 图1，本发明药动学研究过程中血药浓度-时间曲线图具体实施方式：

[0021] 实施例1：

[0022] 一种芍药苷、青藤碱和甘草酸的组合物，三种组份的重量份数为：白芍总苷80重量份数(800g)；青藤碱15重量份数(150g)；甘草酸5重量份数(50g)。其制备工艺如下：白芍总苷800g、青藤碱150g、甘草酸50g，混合后过100目筛，混匀，得白芍总苷、青藤碱和甘草次酸组合物(组合物A)。

[0023] 实施例2：

[0024] 取实施例1制备的组合物A，加入微晶纤维素100g，加入适当的淀粉调至2500g，加入硬脂酸镁，混合均匀，粉末直接压成5000片，制成片剂。

[0025] 实施例3：

[0026] 取实施例1制备的组合物A，加适量淀粉至1500g，混合均匀，装入0号胶囊，制成5000粒胶囊剂。

[0027] 实施例4：

[0028] 取实施例1制备的组合物A2000g，加入适量糖粉，混合均匀，以乙醇为粘合剂，过40目筛，60℃烘干，整粒后进行分装、制成颗粒剂。

[0029] 实施例5：

[0030] 取实施例1制备的组合物，加注射用水适量，用5％NaOH溶液调PH7.3-7.5。用3号垂熔漏斗过滤。灌封于安瓿中，灭菌，制成注射剂。

[0031] 实施例6：

[0032] 一种芍药苷、青藤碱和甘草酸的组合物，其组成包括：白芍总苷50重量分数(500g)；青藤碱40重量分数(400g)；甘草酸10重量分数(10g)。其制备工艺如下：取白芍总苷500g、青藤碱400g、甘草酸10g，混合后过100目筛，混匀，得白芍总苷、青藤碱和甘草次酸组合物(组合物B)。

[0033] 实施例7：

[0034] 取实施例6制备的组合物B，加入微晶纤维素100g，加入适当的淀粉调至2500g，加入硬脂酸镁，混合均匀，粉末直接压成5000片，制成片剂。

[0035] 实施例8：

[0036] 取实施例6制备的组合物B150g，加入可溶性淀粉850g，蔗糖1000g，混合均匀，制成颗粒过24目标准筛整粒，每袋装1g，即得。

[0037] 实施例9：

[0038] 建立大鼠佐剂性关节炎模型，计数法测定多发性关节炎指数，称重法测定体重、胸腺指数、脾脏指数，用足容积仪测定继发侧关节肿胀度，ELISA法检测巨噬细胞分泌IL-1水平，3H-TdR掺入法测定T、B淋巴细胞增殖反应，HE染色法光镜观察关节病理形态学变化等，考察白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用。

[0039] 1、对AA大鼠关节炎指数的影响：

[0040] 将同一批号的卡介苗(bacillus calmette guerin，BCG)80℃灭活1h，以高压灭菌-1的液体石蜡配制成10g·L 的乳剂，充分碾磨混匀即得弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)，于大鼠左后足趾皮内注射FCA0.1ml致炎。

[0041] 致炎后d16、d20、d24采用关节分数评分法记录各组大鼠多发性关节炎病变的发生及严重程度。每只足爪按下列标准评分：0＝正常；1＝踝关节红斑和轻微肿胀；2＝踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3＝踝关节到跖趾关节或掌关节红斑和中度肿胀；4＝踝关节到趾关节红斑和重度肿胀。最大评分为12分。

[0042] 大鼠造模后，致炎侧足爪关节肿胀明显，造模后d16左右致炎侧以外的其他足爪关节开始肿胀，与模型组相比，d24药物均能明显降低AA大鼠的关节炎指数评分。

[0043] 表1白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物(组合物)对大鼠佐剂性关节炎关节指数的影响

[0044]

[0045]

[0046] *p＜0.05，**p＜0.01

[0047] 与正常组相比，造模后d16左右致炎侧以外的其他足爪关节开始肿胀，出现肿胀后各用药组开始给药。与模型组相比，d20、d24各药物均能明显降低AA大鼠的关节炎指数评分。

[0048] 在d24各药物比较：

[0049] 于100mg/kg剂量相比较，组合物租降低AA大鼠的关节炎指数评分的效果较白芍总苷与青藤碱组以及白芍总苷与甘草酸租效果明显。

[0050] 2、对AA大鼠足肿胀的影响

[0051] 分别在致炎前和致炎后的d0、d16、d20、d24用足趾容积测量仪测量非致炎侧足爪容积，以大鼠足爪的增长率(d16-d0)/d0、(d20-d0)/d0、(d24-d0)/d0作为肿胀指标。

[0052] 大鼠造模后致炎侧以外的其他足爪出现肿胀，d24与模型组相比白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物能不同程度的降低大鼠足爪肿胀，效果优于其他对照组。

[0053] 表2白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物(芍甘组合物)对大鼠佐剂性关节炎足爪肿胀度的影响

[0054]

[0055]## * **

[0056] p＜0.01vs正常组；p＜0.05，p＜0.01vs模型组.

[0057] 3、对胸腺指数和脾脏指数的影响

[0058] 致炎后d28称重后脱颈处死大鼠，剥离胸腺和脾脏，分别称重，用胸腺和脾脏的重量与大鼠的体重相比，得到胸腺和脾脏指数。

[0059] 大鼠造模后脾脏指数升高，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物能不同程度的降低脾脏指数，大鼠造模后胸腺指数降低，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物药物对胸腺指数无明显影响。

[0060] 表3白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物(芍甘组合物)对大鼠佐剂性关节炎大鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

[0061]

[0062]

[0063] ##p＜0.01vs正常组；*p＜0.05，**p＜0.01vs模型组；

[0064] 大鼠造模后脾脏指数升高，个对照组药物均能不同程度的降低脾脏指数。各药物比较：于100mg/kg剂量相比较，组合物降低脾脏指数的效果较其他组效果显著。

[0065] 4、ConA和LPS诱导的T和B淋巴细胞增殖反应的影响

[0066] 无菌取脾脏、胸腺，制备淋巴细胞悬液(1×107/ml)，在96孔培养板上，每孔加入100μl细胞悬液(终浓度为5×106/ml)及LPS(终浓度4mg/L)或ConA(终浓度3mg/L)，终容积为200μl，各设3个复孔，置37℃、5％CO2培养箱培养42h，诱导T、B淋巴细胞增殖。
终止培养前6h，每孔加入25μCi 3H-TdR，培养结束后将细胞抽滤于玻璃纤维滤纸上，干燥后用液体闪烁计数仪检测，结果以3个复孔cpm的均值表示。

[0067] 与正常组相比，AA大鼠T细胞增殖水平升高，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物药物可以不同程度的降低T细胞的增殖水平，与正常组相比，AA大鼠B细胞增殖水平升高，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物药物可不同程度的降低B细胞的增殖水平。

[0068] 5、IL-1的诱生与检测

[0069] 制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液(1×107/ml)，加入24孔培养板，每孔1ml，置37℃、5％CO2培养箱培养2h，弃取上清液，用D-Hank`s液洗3遍，除去非粘附细胞，获单层细胞，然后各加入500μl DMEM和LPS(终浓度4mg/L)，置37℃、5％CO2培养箱培养48h，诱导产生IL-1，收取上清，-20℃保存，ELISA法检测IL-1含量。

[0070] 与正常组相比，AA大鼠腹腔巨噬细胞在LPS的刺激下分泌IL-1的水平升高，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物可不同程度的降低巨噬细胞在LPS的刺激下分泌IL-1的水平。

[0071] 6、白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物对大鼠AA关节病理变化的作用[0072] 大鼠踝关节以10％甲醛液固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后在光学显微镜下观察踝关节的病理形态。

[0073] 与正常大鼠相比，光镜下可见AA模型组大鼠的滑膜组织中滑膜细胞增生明显，层次增多，排列紊乱，滑膜下层纤维组织增生，炎性细胞浸润及血管翳形成，软骨中炎性细胞浸润，软骨组织破坏。各用药组均可不同程度改善以上病理变化，主要表现为滑膜细胞层未见明显增多，少量炎性细胞浸润。

[0074] 与模型组比较，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物各剂量组均明显改善滑膜下层炎性细胞浸润和滑膜血管充血。与白芍总苷、青藤碱组以及白芍总苷与甘草酸组对比，从病理图片上看，组合物组改善关节炎的效果最佳。

[0075] 通过上述研究实验综合表明，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物对类风湿关节炎具有治疗作用，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物具有降低关节炎指数、降低升高的脾脏指数、下调升高的T、B细胞增殖反应、抑制巨噬细胞分泌IL-1等作用。病理图片显示，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物可不同程度改善类风湿关节炎的病理变化，主要表现为滑膜细胞层未见明显增多，少量炎性细胞浸润。在治疗作用方面优于白芍总苷与青藤碱对照组以及白芍总苷与甘草酸对照组。

[0076] 白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物在治疗湿疹方面的疗效评定试验。

[0077] 实验方案：

[0078] 采用开放、随机、对照临床试验方法，各单位观察合格病例40例。受试者按随机数字分配至以下两组中，治疗组：白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物(组合物采用胶囊剂，每个胶囊含400mg药物组合物)；对照组1：白芍总苷、青藤碱组；对照组2：白芍总苷、甘草酸组；进行为期12-24周的临床观察。在治疗4周后观察疗效指标，12-24周结束后观察治愈个数。

[0079] 计划入组550例，实际入组病例485例，脱落65例，最终完成合格试验病例456例。其中白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物组141例；对照组1为165；对照组2为150例。

[0080] 入组病例基线情况为男167占54.58％，女139占45.42％.

[0081] 实验结果：

[0082] 表4.三组病例治疗后综合疗效评估的分析

[0083]

[0084] 从治疗4周后的疗效指标上来看，治愈、显效、有效及无效的分级分析上来看，白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物要优于对照组1(白芍总苷、青藤碱组)及对照组2(白芍总苷、甘草酸组)。说明白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物可以提高类风湿关节炎的治疗效果。

[0085] 白芍总苷、青藤碱和甘草酸组合物的药动学研究实验结果。

[0086] 实验方法：

[0087] 新西兰兔雄性，2.0Kg，12只分为四组，第一组芍药苷水溶液灌胃给药，灌胃剂量为325mg.kg-1，第二组同时给予白芍总苷水溶液和青藤碱混悬液各325mg.kg-1(对照组1)；
第三组同时给予白芍总苷、青藤碱及甘草酸各325mg.kg-1(组合物组)；第四组给予白芍总苷及甘草酸325mg.kg-1(对照组2)各分别在给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h从耳缘静脉取血0.5ml，置于肝素化试管中，离心，6000r·min-1，10min，取血浆。按血浆样品处理方法操作，HPLC分析。代入线性回归曲线计算各个时间点血浆中芍药苷的含量。

[0088] 血药浓度分析方法：

[0089] 色谱系统条件

[0090] HPLC：Agilent 1100series；Dikma Technoiogies Diamonsil(砖石)C18色谱柱(5μ150×4.6mm迪马公司)；C18预柱；流动相：甲醇-0.01％HAc 40∶60；柱温：25℃；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1。

[0091] 血浆样品处理方法

[0092] 以高氯酸沉淀蛋白法处理血浆样品：取血浆0.1ml，加到1.5ml离心管中，加入6％高氯酸0.1ml，漩涡振荡5min，12000r·min-1，离心10min，取上清液，HPLC分析。该方法操作简单方便，且专属性好，灵敏度高，血浆中杂质不干扰含量的测定，

[0093] 相对生物利用度实验结果

[0094] 新西兰兔灌胃给药后于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h从耳缘静脉取血，血浆样品处理后，HPLC分析后。记录峰面积，代入线性回归曲线，计算各个时间点血药浓度，结果见如表5，血药浓度-时间曲线如图1所示。

[0095] 表5新西兰兔口服给药四组实验血药浓度-时间数据(n＝3)

[0096]