本发明涉及一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括：农田16种物种的线粒体COI基因通用引物，上游：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；下游：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；农田16种物种的线粒体COI基因的特异探针序列；以及PCR扩增和LDR检测程序所用试剂。本发明的试剂盒针对COI基因的通用引物有效扩增出所有目标物种序列，保证了各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到；各目标物种的特异探针进一步又保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量，从而了解田间捕食结构的变化，维护农田生态环境。
1.一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括：(一)PCR扩增体系
(1)农田16种物种的线粒体CO I基因通用引物序列：上游：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
下游：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；
(1)农田16种物种的线粒体CO I基因的特异探针序列：拟水狼蛛，LDR探针：
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTCCTGACATATCTTTTCCTCGAATAAATAATC；
R：P-TTTCTTTTTGGTTATTACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTGGAGCACCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAAC；
R：P-AATATAAGATTTTGGTTACTTCCACCCTCCTTAAT-Fam；
F：TTTTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACAATTATC；
R：P-AATATACGACTAAATAATTTATCTTTTGATCAAATT-Fam；
F：TTTTTTCAGCTCTTTTACTACTTTTATCATTACCTGTTCTC；
R：P-GCTGGAGCCATTACTATGCTTCTTACGGATCGAAATTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG；
R：P-CCTTTAATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTTCCTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAG；
R：P-TAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAATTCCATTTTTTTTT-Fam；
稻纵卷叶螟绒茧蜂，产物长度88bp杆蝇，LDR探针：
F：TTTTTTTTTTTTTTGATTATTACCTCCTTCATTAACTTTATTAATG；
R：P-GCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACTGGTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAAGTAGTATAATTATC；
R：P-CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC；
R：P-TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG；
R：P-GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC；
R：P-TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG；
R：P-TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG；
R：P-AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG；
R：P-CATTAACTTATTTTATAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA；
R：P-CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC；
R：P-ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
2.根据权利要求1所述的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，其特征在于：所述的1×Taq DNA连接酶缓冲液具体组分为：20mM pH 7.6Tris-HCl，25mM KAc，
10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1mM NAD和0.1％Triton X100，缓冲液冷冻贮存。
3.根据权利要求1所述的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，其特征在于：所述的混合探针的方案为将16个物种的特异探针以等浓度混合。
一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于多重LDR分型试剂盒领域，特别涉及一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒。
背景技术
[0002] 田间的多个物种对农田生态系统及其重要，它能为哪一营养关系处于更重要的地位提供指导，田间多个物种的检测分型对于研究生态系统功能非常重要。目前国内外已建立了若干针对田间多个物种的检测分型方法，但这些方法普遍存在着通量小、操作难度大、烦琐，提供信息量少等弱点，妨碍了研究机构对田间多个物种开展有效的科研和检测。现有的检测田间多个物种的方法主要分为两种，一是传统的对其肠道或排泄物进行分析，一是以聚合酶链式反应结合连接酶检测反应为主要技术的高通量、高准确度，高灵敏度分析法。
[0003] 从田间收集多个物种并对其肠道或排泄物进行分析，其检测手段从最初的放射性标记、多克隆抗体和物种的酶谱分析愈发倾向于单克隆抗体与DNA技术，检测靶标亦从单一物种转移到多物种鉴别。但因单克隆抗体制备极其烦琐，且靶标唯一难以实现高通量检测，故在检测田间多个物种中其应用方面大打折扣。而DNA技术在1997年首先在海洋生物捕食链中展示其可行性后，逐渐成为脊椎动物与无脊椎食物链研究的新型模式。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系，但常规的PCR方法需要对每个物种设计相应的引物来扩增，而田间物种种类繁多，无法使用多重PCR技术来监测多达数十种的植食者昆虫，故限制了其应用。
[0004] 通用引物PCR结合LDR(ligase detection reaction)技术是使用通用引物对多物种的保守区进行扩增，根据种间物种特异性单核苷酸位点，构建不同长度的LDR物种特异探针，利用高温连接酶的高特异性对基因内部的序列差异进行检测，因而具有高通量，高准确度，高灵敏度等特性，是一种可移植性很强的检测方案。线粒体上的COI基因由于具有独特的遗传特性，因此被用来分析生物遗传多样性和亲缘关系。由于探针和引物具有高度敏感性和特异性，使其能对多个物种进行检测分型。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，以克服现今普通的分型试剂盒只能揭示少量猎物的田间捕食规律，难以实现高通量检测的问题。
[0006] 本发明的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括：
[0007] (一)PCR扩增体系
[0008] (1)农田16种物种的线粒体COI基因通用引物序列：
[0009] 上游：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
[0010] 下游：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；
[0011] (2)PCR扩增体系试剂
[0012] 上游引物 0.5μM
[0013] 下游引物 0.5μM
[0014] 10×Buffer 1μl
[0015] dNTP 0.2mM
[0016] Mg2+ 2.0mM
[0017] Taq polymerase 0.1μl(0.5Unit)
[0018] H2O 补水至10μl；
[0019] (二)多重LDR检测体系
[0020] (1)农田16种物种的线粒体COI基因的特异探针序列：
[0021] 拟水狼蛛，LDR探针：
[0022] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTCCTGACATATCTTTTCCTCGAATAAATAATC；
[0023] R：P-TTTCTTTTTGGTTATTACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0024] 拟水狼蛛，产物长度121bp
[0025] 白背飞虱，LDR探针：
[0026] F：TTGGAGCACCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAAC；
[0027] R：P-AATATAAGATTTTGGTTACTTCCACCCTCCTTAAT-Fam；
[0028] 白背飞虱，产物长度70bp
[0029] 大螟，LDR探针：
[0030] F：TTTTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACAATTATC；
[0031] R：P-AATATACGACTAAATAATTTATCTTTTGATCAAATT-Fam；大螟，产物长度73bp[0032] 稻沼蝇，LDR探针：
[0033] F：TTTTTTCAGCTCTTTTACTACTTTTATCATTACCTGTTCTC；
[0034] R：P-GCTGGAGCCATTACTATGCTTCTTACGGATCGAAATTTTTT-Fam；
[0035] 稻沼蝇，产物长度82bp
[0036] 稻纵卷叶螟，LDR探针：
[0037] F：TTTTTTTTCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG；
[0038] R：P-CCTTTAATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTTCCTTTTTTT-Fam；
[0039] 稻纵卷叶螟，产物长度85bp
[0040] 稻纵卷叶螟绒茧蜂，LDR探针：
[0041] F：TTTTTTTTTTGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAG；
[0042] R：P-TAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAATTCCATTTTTTTTT-Fam；
[0043] 稻纵卷叶螟绒茧蜂，产物长度88bp
[0044] 杆蝇，LDR探针：
[0045] F：TTTTTTTTTTTTTTGATTATTACCTCCTTCATTAACTTTATTAATG；
[0046] R：P-GCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACTGGTTTTTTTTTT-Fam；
[0047] 杆蝇，产物长度91bp
[0048] 褐飞虱，LDR探针：
[0049] F：TTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAAGTAGTATAATTATC；
[0050] R：P-CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT-Fam；
[0051] 褐飞虱，产物长度94bp
[0052] 黑肩绿盲蝽，LDR探针：
[0053] F：TTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC；
[0054] R：P-TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0055] 黑肩绿盲蝽，产物长度97bp
[0056] 黑尾叶蝉，LDR探针：
[0057] F：TTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG；
[0058] R：P-GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0059] 黑尾叶蝉，产物长度100bp
[0060] 灰飞虱，LDR探针：
[0061] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC；
[0062] R：P-TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0063] 灰飞虱，产物长度103bp
[0064] 摇蚊，LDR探针：
[0065] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG；
[0066] R：P-TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0067] 摇蚊，产物长度106bp
[0068] 蓟马，LDR探针：
[0069] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG；
[0070] R：P-AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0071] 蓟马，产物长度109bp
[0072] 水蝇，LDR探针：
[0073] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG；
[0074] R：P-CATTAACTTTATTATTAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；
[0075] 水蝇，产物长度112bp
[0076] 蚜虫，LDR探针：
[0077] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA；
[0078] R：P-CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0079] 蚜虫，产物长度115bp
[0080] 二化螟，LDR探针：
[0081] F：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC；
[0082] R：P-ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam；
[0083] 二化螟，产物长度118bp；
[0084] (2)LDR检测体系试剂
[0085] 混合探针 0.1umol/L
[0086] 10×Buffer 1μl
[0087] PCR扩增DNA模板 1μl
[0088] Taq 0.1μl(4Unit)
[0089] H2O 补水至10μl。
[0090] 所用的1×Taq DNA连接酶缓冲液具体组分为：20mM Tris-HCl(pH 7.6)，25mM KAc，10mM Mg(Ac)2，10mM DTT，1mM NAD和0.1％Triton X100，缓冲液应冷冻贮存。
[0091] 所述的混合探针的方案为将16中物种探针以等浓度混合。
[0092] 本试剂盒主要由通用引物PCR和特异探针LDR两部分组成。在PCR中，设计的通用引物同时扩增出所选物种的CO I基因序列，再经过连接反应，各物种特异的LDR探针达到分型的目的。LDR信号由ABI Prism 377型核酸分析仪检出，测得的荧光值作为定性的依据。
[0093] 本试剂盒的设计原理包括以下步骤：
[0094] (1)靶标基因的确定、稻田捕食者及其猎物的获得
[0095] 选取的稻田捕食者为拟水狼蛛，猎物为白背飞虱、大螟、稻沼蝇、稻纵卷叶螟、稻纵卷叶螟绒茧蜂、杆蝇、褐飞虱、黑肩绿盲蝽、黑尾叶蝉、灰飞虱、摇蚊、蓟马、水蝇、蚜虫和二化螟，一共16种；选取线粒体上的CO I基因作为靶标基因，进行分型研究，构建多物种联合检测的PCR体系和多重LDR体系；
[0096] (2)线粒体CO I基因片段的通用引物PCR扩增及测序
[0097] 特异PCR引物扩增拟水狼蛛及其猎物的CO I基因序列，将通用引物扩增的PCR产物克隆到大肠杆菌的质粒里，并测序，得到包括拟水狼蛛在内的16个物种的序列，每个物种尽量测10个体，用于评估个体间的SNP影响；
[0098] (3)序列比对及探针设计
[0099] 将测序的物种用DNAssist软件比对，找出COI基因扩增片段的种间差异，寻找种间物种特异性单核苷酸位点，构建LDR物种特异探针，选出的位点须经物种个体间比对，排除种内SNP位点位于该物种特异性单核苷酸位点上；
[0100] 针对物种特异性核苷酸位点设计LDR探针，各物种连接探针连接产物长度为70～121bp，相邻片段间隔为3bp；
[0101] (4)探针特异性检测及优化
[0102] 抽提各物种的标准质粒，定量到统一浓度(10pg/μL)。首先，取单模板和单探针做探针特异性评估，经测序仪分析，所有探针均有预测长度连接产物生成；其次，取单模板和多探针做探针特异性评估，经测序仪分析，特异性良好。最后，多模板多探针检测，将16个物种的标准质粒等浓度混合(总浓度10pg/μL)，利用CO I的通用引物进行扩增，然后用多重探针进行检测，得到多重探针检测方案。
[0103] 有益效果
[0104] 本发明的试剂盒针对CO I基因的通用引物有效扩增出所有目标物种序列，保证了各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到；各目标物种的特异探针进一步又保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量，从而了解田间捕食结构的变化，维护农田生态环境。
附图说明
[0105] 图1为CO I基因的通用引物PCR结合LDR检测多个物种的示意图；
[0106] 其中，(A)16个物种的标准质粒DNA，(B)线粒体上CO I基因的通用引物，(C)利用CO I基因通用引物和质粒DNA模板进行的PCR反应，(D)针对CO I基因通用引物扩增区段设计的特异LDR探针，(E)针对CO I基因通用引物扩增区段设计的不同长度的特异LDR探针，(F)进行的是按特异探针混合方案进行的多重LDR反应，(G)ABI Prism 377型核酸分析仪上获得的单模板单探针荧光定量分型分析图，(H)ABI Prism 377型核酸分析仪上获得的16个物种的多模板多探针荧光定量分型分析图。
具体实施方式
[0107] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0108] 实施例1
[0109] (一)拟水狼蛛DNA和被食者DNA的通用引物扩增
[0110] (1)将16个物种的标准质粒等浓度混合，总浓度为10pg/μL；
[0111] (2)通用引物
[0112] 上游：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
[0113] 下游：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；
[0114] (3)扩增体系(10μl)：
[0115] 上游引物 0.5μM
[0116] 下游引物 0.5μM
[0117] 10×Buffer 1μl
[0118] dNTP 0.2mM
[0119] Mg2+ 2.0mM
[0120] Taq polymerase 0.1μl(0.5Unit)
[0121] 加水至10μl；
[0122] (4)扩增程序：
[0123] 95℃15min
[0124] 94℃30s→50℃1min→72℃2min(35cycles)
[0125] 72℃7min→4℃ forever
[0126] (二)拟水狼蛛DNA和被食者DNA的连接酶检测反应(LDR)
[0127] (1)将通用引物扩增所得PCR产物作为模板用于LDR信号检测
[0128] (2)LDR体系(10μl)：
[0129] 混合探针 0.1umol/L
[0130] 10×Buffer 1μl
[0131] 模板 1μl
[0132] Taq polymerase 0.1μl(4unit)
[0133] 加水至10μl
[0134] 其中，16个物种的特异探针等浓度混合；
[0135] (3)LDR反应程序：
[0136] 95℃2min
[0137] 94℃30s→60℃2min(35cycles)。
