瘤果黑种草子药材的鉴别方法

摘要

本发明涉及中药材的鉴别方法技术领域，一种瘤果黑种草子药材的鉴别方法，其按下述步骤进行：第一步，建立瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱；第二步，以上述相同的步骤测定待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱；第三步，将待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱与瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱进行对比，筛选符合瘤果黑种草子标准指纹图谱的瘤果黑种草子药材。与现有技术相比，本方法具有方法简便、精密度高、稳定性和重复性好的特点。利用本方法制定的标准指纹图谱有效鉴别瘤果黑种草子药材，有效监控瘤果黑种草子药材的内在质量。

权利要求

1.一种瘤果黑种草子药材的鉴别方法，其特征在于按下述步骤进行：

第一步，建立瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱：

（1）瘤果黑种草子药材标准品溶液的制备：取瘤果黑种草子药材，粉碎，过20目筛，先用60 ℃至90 ℃沸程的石油醚脱脂，将药渣挥干石油醚后，精密称取该药渣5.00克，加重量百分比为30%的乙醇溶液回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，过滤，滤液置于水浴上蒸干，残渣加水溶解并定容至25毫升，取上清液用孔径为0.45 微米的微孔滤膜过滤，取续滤液作为药材标准品溶液；

（2）参照物溶液的制备：精密称取黑种草苷对照品1.0 毫克，以甲醇溶解，定容制成每

1 毫升含黑种草苷10 微克，作为参照物溶液；

色谱条件：参数为250×4.6 毫米、5 微米的YMC-Pack ODS-A色谱柱；体积百分比为

0.1%的醋酸溶液与乙腈梯度洗脱，梯度条件为0 分钟～40 分钟～60 分钟～80 分钟，乙腈百分比体积浓度依序为0%～10%～19%～19%；流速为0.8 毫升/分钟；柱温为30 ℃；

检测波长为254 纳米；

（4）测定：精密吸取药材标准品溶液和参照物溶液各10 微升分别进样分析，记录时间为80 分钟，得到瘤果黑种草子药材的指纹图谱；

（5）得到瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱：按照上述步骤对10批瘤果黑种草子药材建立高效液相色谱指纹图谱，在指纹图谱中有13个共有特征峰，以13号色谱峰黑种草苷的相对保留时间为1，各共有特征峰的相对保留时间分别为：0.229±0.002、0.313±0.005、

0.333±0.001、0.358±0.003、0.381±0.001、0.423±0.001、0.477±0.003、

0.643±0.002、0.762±0.013、0.921±0.001、0.954±0.001、0.961±0.001、1.000，这些共有特征峰构成了瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱；

第二步，以上述相同的步骤测定待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱；

第三步，将待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱与瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱进行对比，筛选符合瘤果黑种草子标准指纹图谱的瘤果黑种草子药材。

2.根据权利要求1所述的瘤果黑种草子的鉴别方法，其特征在于所述13个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3%，其占总峰面积百分比为10%以上的共有峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均小于3%。

说明书

瘤果黑种草子药材的鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药材的鉴别方法技术领域，是一种瘤果黑种草子药材的鉴别方法，具体地说是用高效液相色谱指纹图谱鉴别瘤果黑种草子药材的鉴别方法。

背景技术

[0002] 黑种草子系维吾尔族习用药材，为毛茛科（Ranunculaceae）黑种草属（Nigella）植物瘤果黑种草(Nigella glandulifera Freyn)的干燥成熟种子。瘤果黑种草又名腺毛黑种草，维吾尔语名斯亚旦，主产于我国新疆和云南西双版纳地区，在新疆大部分地区都有种植，如吐鲁番、鄯善等地，资源丰富；在新疆大部分药材市场都可买到，应用极广。黑种草子以其良好的疗效，被誉为治疗百病的万能灵药，收载于《药物大全》等多部古典医药书籍中。在维吾尔医中，黑种草子三级干热，具有补肾健脑、止咳喘、通经、通乳、活血、解毒、利尿、润肤、乌发、抗衰老等功效，用于胸闷气促、咳嗽气喘、头晕浮肿、耳鸣健忘、经闭乳少、热淋、石淋、脱发等疾病的治疗，收载于各版《中国药典》、《维吾尔药志》、《中国民族药志》以及《中华本草-维吾尔药卷》等医药文献中。《中华人民共和国卫生部药品标准-维吾尔药分册》收载了黑种草子的两个复方制剂，复方斯亚旦生发油和复方斯亚旦生发酊，均用于治疗脱发、斑秃和头皮瘙痒等病症。由于黑种草种子具有独特的芳香味并含丰富的脂肪和挥发性精油，维吾尔族群众常用其作为焙烤面点的调味品。瘤果黑种草子也是藏族、傣族的传统药。瘤果黑种草子为国标傣药七味榼藤子丸的处方药之一，具有清脑醒神、除风解痉、调经止血、温通止痛之功。傣医临床常用于风塔偏盛所致的头昏头痛、失眠多梦；风湿病关节肌肉肿痛及腰膝冷痛；癫痫；痴证、晕车、晕船；月子病（产后病）流血不止、贫血，缺乳，月经不调，痛经，闭经；胃脘疼痛，食少，泄泻。藏族用瘤果黑种草子主治肝炎、肝肿大、胃湿过剩，常配方用。

[0003] 近年来，国内学者对瘤果黑种草子的化学成分展开了较为系统的研究，从中分离得到了黄酮、皂苷和生物碱等多种化学成分。现代药理研究表明黑种草子具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗血小板聚集、降脂、降糖和保肝等多种生物活性。文献报道对瘤果黑种草子药材的研究多以总黄酮或单个黄酮类成分为定量指标，但是在大部活性成分尚不清楚的情况下，测定一两个化学成分的量还不能真正反映原药材质量的稳定性。

发明内容

[0004] 本发明提供一种瘤果黑种草子药材的鉴别方法，其克服了现有技术之不足，通过高效液相色谱建立瘤果黑种草子标准指纹图谱方法达到对瘤果黑种草子药材的鉴别，从而解决了瘤果黑种草子药材质量控制的问题，其方法简便、精密度高、稳定性和重复性好，较好地实现了对瘤果黑种草子药材真伪鉴别和品质控制。

[0005] 本发明的技术方案是通过以下技术措施来实现的：一种瘤果黑种草子药材的鉴别方法按下述步骤进行：

[0006] 第一步，建立瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱：

[0007] （1）瘤果黑种草子药材标准品溶液的制备：取瘤果黑种草子药材，粉碎，过20目筛，先用60 ℃至90 ℃沸程的石油醚脱脂，将药渣挥干石油醚后，精密称取该药渣5.00克，加重量百分比为30%的乙醇溶液回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，过滤，滤液置于水浴上蒸干，残渣加水溶解并定容至25毫升，取上清液用孔径为0.45 微米的微孔滤膜过滤，取续滤液作为药材标准品溶液；

[0008] （2）参照物溶液的制备：精密称取黑种草苷对照品1.0 毫克，以甲醇溶解，定容制成每1 毫升含黑种草苷10 微克，作为参照物溶液；

[0009] （3）色谱条件：参数为250×4.6 毫米、5 微米的YMC-Pack ODS-A色谱柱；体积百分比为0.1%的醋酸溶液与乙腈梯度洗脱，梯度条件为0 分钟～40 分钟～60 分钟～80 分钟，乙腈百分比体积浓度依序为0%～10%～19%～19%；流速为0.8 毫升/分钟；柱温为30 ℃；检测波长为254 纳米；

[0010] （4）测定：精密吸取药材标准品溶液和参照物溶液各10 微升分别进样分析，记录时间为80 分钟，得到瘤果黑种草子药材的指纹图谱；

[0011] （5）得到瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱：按照上述步骤对10批瘤果黑种草子药材建立高效液相色谱指纹图谱，在指纹图谱中有13个共有特征峰，以13号色谱峰黑种草苷的相对保留时间为1，各共有特征峰的相对保留时间分别为：0.229±0.002、0.313±0.005、0.333±0.001、0.358±0.003、0.381±0.001、0.423±0.001、
0.477±0.003、0.643±0.002、0.762±0.013、0.921±0.001、0.954±0.001、
0.961±0.001、1.000，这些共有特征峰构成了瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱；

[0012] 第二步，以上述相同的步骤测定待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱；

[0013] 第三步，将待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱与瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱进行对比，筛选符合瘤果黑种草子标准指纹图谱的瘤果黑种草子药材。

[0014] 下面对上述技术方案之一作进一步优化或/和选择：

[0015] 上述13个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3%，其占总峰面积百分比为10%以上的共有峰相对峰面积的相对标准偏差RSD均小于3%。

[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0017] 1本发明将瘤果黑种草子药材指纹图谱作为一个整体看待，注重其整体概貌，避免了只测定一、两个化学成分来判定瘤果黑种草子药材整体质量的片面性，为准确评价瘤果黑种草子药材的质量提供了新的标准。

[0018] 2本发明选择重量百分比为30%的乙醇溶液作为提取溶剂，能有效提取瘤果黑种草子中的特征性活性成分黄酮及皂苷类化合物，指纹图谱中共有特征峰均能表征瘤果黑种草子发挥药效的有效成分。

[0019] 3本发明具有方法简便、精密度高、稳定性和重复性好的特点，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异，适于对瘤果黑种草子药材真伪鉴别和品质控制。

[0020] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。

附图说明

[0021] 图1是采用不同溶剂提取所得的瘤果黑种草子药材的指纹图谱；其中，色谱图从下向上依次为70%乙醇提取、50%乙醇提取、本发明的（即30%乙醇提取）和水提取，乙醇溶液的浓度为重量百分比。

[0022] 图2是采用不同提取方法所得的瘤果黑种草子药材的指纹图谱；其中，色谱图从下向上依次为本发明的（即加热回流提取）、超声10min提取、超声20min提取和超声30min提取。

[0023] 图3是本发明测定的瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱（共有模式图）；图中从左到右分别标出了其共有特征峰1至13号。

[0024] 图4是参照物黑种草苷色谱图。

[0025] 图5为用本发明测定的不同产地瘤果黑种草子药材指纹图谱的比较；其中，色谱图从下到上依次为：和田于田、喀什岳普湖、奇台、吐鲁番、和田1、喀什1、伊犁、喀什2、和田2、鄯善。

具体实施方式

[0026] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明不局限于此。

[0027] 本发明的实施例：瘤果黑种草子药材的鉴别方法。

[0028] 1仪器与试药。

[0029] 1.1仪器。

[0030] 岛津LC-10ADvp高效液相色谱仪，SPD-M10Avp检测器。

[0031] 1.2试药。

[0032] 瘤果黑种草子药材共10批，分别采自新疆和田、和田于田、喀什、喀什岳普湖、奇台、吐鲁番、伊犁、鄯善等地；黑种草苷对照品自制，纯度大于98%；乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

[0033] 2方法与结果。

[0034] 2.1色谱条件的确定。

[0035] 2.2.1流动相的选择。

[0036] 在YMC-Pack ODS-A色谱柱（250×4.6 毫米，5微米）、0.8 毫升/分钟流速、30 ℃柱温的条件下，比较了甲醇与0.1%醋酸系统、乙腈与0.1%醋酸系统进行梯度洗脱的色谱图，结果发现甲醇与0.1%醋酸系统基线漂移较大，所以选择乙腈与0.1%醋酸系统。优选0.1%醋酸(体积百分比)与乙腈系统的梯度洗脱条件，结果发现在梯度条件0 分钟～40 分钟～60 分钟～80 分钟，乙腈0%～10%～19%～19%时，各组分得到较好的分离。

[0037] 2.2.2检测波长的选择。

[0038] 采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，分别比较了210纳米至400 纳米的色谱图，结果发现在254 纳米处色谱峰较多且峰型较好，各峰的响应值最高。因此确定254 纳米为检测波长。

[0039] 2.2.3确定的色谱条件。

[0040] 通过上述实验，确定的色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A色谱柱（250×4.6 毫米，5 微米）；流动相：0.1%醋酸(体积百分比)和乙腈，采用梯度洗脱方式，0 分钟～40 分钟～60 分钟～80 分钟，乙腈0%～10%～19%～19%；流速：0.8 毫升/分钟；柱温：30 ℃；检测波长：254 纳米；运行时间：80 分钟。

[0041] 2.2参照物溶液的制备。

[0042] 精密称取黑种草苷对照品1.0 毫克，以甲醇溶解，制成每1 毫升含黑种草苷10 微克，作为参照物溶液。

[0043] 2.3药材标准品溶液制备方法考察。

[0044] 由于瘤果黑种草子中含有较多油脂，故将其在提取前进行脱脂处理。取瘤果黑种草子，粉碎，过20目筛，加10倍体积的石油醚（沸程为60 ℃至90 ℃）回流提取3次，每次1小时，过滤，将脱脂后的药渣晾干，备用。

[0045] 2.3.1提取溶剂的考察。

[0046] 水提取：精密称取脱脂后的瘤果黑种草子粉末10 克，加10倍重量的水回流提取2次，每次1.5 小时，合并提取液，过滤，滤液水浴浓缩至20 毫升（药材:药液=1:2），放置至室温后，加入40 毫升乙醇（药液:乙醇=1:2）进行醇沉，放置12 小时，过滤。滤液蒸干，加水溶解并定容至50 毫升容量瓶中，取上清液用微孔滤膜（孔径为0.45 微米）过滤，取续滤液作为供试品溶液。进样10 微升，记录色谱图。见附图1。

[0047] 不同浓度乙醇提取：精密称取3份脱脂后的瘤果黑种草子粉末5 克，分别加入10倍重量重量百分比分别为30%的乙醇溶液或50%的乙醇溶液或70%的乙醇溶液回流提取2次，每次1.5 小时，合并提取液，过滤，滤液蒸干，加水溶解并定容至25 毫升容量瓶中，取上清液用微孔滤膜（孔径为0.45 微米）过滤，取续滤液作为供试品溶液。进样10 微升，记录色谱图。见附图1。

[0048] 从附图1中可以看出，水提取与不同浓度乙醇提取制备的样品其色谱图大体一致，但是重量百分比为30%的乙醇溶液提取样品的色谱峰多，而且峰形好，因此选择用重量百分比为30%的乙醇溶液回流提取制备药材标准品溶液。

[0049] 2.3.2提取方法的考察。

[0050] 精密称取3份脱脂后的瘤果黑种草子粉末5 克，各加入重量百分比为30%的乙醇溶液25 毫升，分别超声提取10 分钟或20 分钟或30分钟，过滤，滤液蒸干，加水溶解并定容至25 毫升容量瓶中，取上清液用微孔滤膜（孔径为0.45 微米）过滤，取续滤液作为供试品溶液。进样10微升，记录色谱图，并与重量百分比为30%的乙醇溶液回流提取样品的色谱图进行对比，见附图2。从附图2中可以看出，3种提取方法的色谱图大体一致，但是回流提取样品的色谱峰多，且峰形好，因此选择回流提取法。

[0051] 2.3.3确定的药材标准品溶液制备方法。

[0052] 通过上述实验，确定的药材标准品溶液制备方法为：取瘤果黑种草子，粉碎，过20目筛，加10倍重量的石油醚（沸程为60 ℃至90 ℃）回流提取3次，每次1 小时，过滤，将脱脂后的药渣晾干。精密称取脱脂后的瘤果黑种草子粉末5 克，加入10倍重量重量百分比为30%的乙醇溶液回流提取2次，每次1.5 小时，合并提取液，过滤，滤液蒸干，加水溶解并定容至25 毫升容量瓶中，取上清液用微孔滤膜（孔径为0.45 微米）过滤，取续滤液作为药材标准品溶液。

[0053] 2.4指纹图谱的方法学考察。

[0054] 2.4.1稳定性试验。

[0055] 取瘤果黑种草子，按确定的药材标准品溶液制备方法操作，分别于0 小时、2 小时、4 小时、6.5 小时、24 小时进样10 微升进行测定。以黑种草苷为对照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%，占总峰面积百分比10%以上的共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 小时内稳定。

[0056] 2.4.2精密度试验。

[0057] 取同一药材标准品溶液，连续进样5次。以黑种草苷为对照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%，占总峰面积百分比10%以上的共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，表明本方法精密度良好。

[0058] 2.4.3重复性试验。

[0059] 取同一批瘤果黑种草子6份，按照确定的药材标准品溶液制备方法操作并测定，以黑种草苷为对照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%，占总峰面积百分比10%以上的共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，表明本方法重复性良好。

[0060] 2.5指纹图谱及技术参数。

[0061] 2.5.1指纹图谱及共有峰的标定。

[0062] 将10批次不同产地瘤果黑种草子制成药材标准品溶液进行测定，应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版，国家药典委员会）比较10批次不同产地瘤果黑种草子的色谱图，其中有13个色谱峰是共有的，确定为共有峰，见附图3（共有模式图）。其中峰13为黑种草苷，见附图3、4。

[0063] 不同产地瘤果黑种草子药材指纹图谱比较见附图5。以13号峰黑种草苷色谱峰的相对保留时间为1，各共有特征峰的相对保留时间分别为：0.229±0.002、0.313±0.005、0.333±0.001、0.358±0.003、0.381±0.001、0.423±0.001、0.477±0.003、
0.643±0.002、0.762±0.013、0.921±0.001、0.954±0.001、0.961±0.001、1.000，这些共有特征峰构成了瘤果黑种草子药材的指纹特征。

[0064] 2.5.2相似度评价。

[0065] 应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版，国家药典委员会），对10批次不同产地瘤果黑种草子样品S1-S10的小时PLC色谱图进行相似度分析，结果见表1。

[0066] 从表1中可以看出，样品Sl-S10与对照指纹图谱R的相似度大于0.9，符合指纹图谱的要求，可建立共有模式。

[0067] 以上述相同的步骤测定待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱；将待测的瘤果黑种草子药材样品的指纹图谱与瘤果黑种草子药材的标准指纹图谱进行对比，筛选符合瘤果黑种草子标准指纹图谱的瘤果黑种草子药材，这样就能实现对瘤果黑种草子药材真伪鉴别和品质控制。

[0068] 3小结

[0069] 本发明根据瘤果黑种草子中特征性成分黄酮和皂苷类成分，采用脱脂、重量百分比为30%的乙醇溶液提取、以黑种草苷对照品作为参照物建立其标准指纹图谱，方法简单可靠。本发明为瘤果黑种草子的种植和生产的质量控制以及瘤果黑种草子的鉴别提供了一个好方法。