生产免疫细胞的方法及诱发产生免疫作用细胞的方法

摘要

本发明揭露一种生产免疫细胞的方法以及诱发免疫作用细胞的方法。生产免疫细胞的方法包含下列步骤：将免疫细胞以及免疫原组成物予以混合培养，其中免疫原组成物包含有至少两种衍生自人类疱疹病毒第四型的肽或肽库，且可另包含免疫佐剂。此外，诱发免疫作用细胞的方法包含下列步骤：将抗原呈现细胞以及前述的免疫原组成物予以混合成培养物，以及将前述培养物和淋巴细胞共同培养于适当的培养基中，以获取活化免疫作用细胞，而前述培养基中亦可另包含有免疫佐剂。获得的活化免疫作用细胞可用于产生抗EBV免疫反应。

权利要求

1.一种生产免疫细胞的方法，其包含下列步骤：

将一免疫细胞以及一免疫原组成物予以混合培养，其中该免疫原组成物包含有至少两种人类疱疹病毒第四型的肽，其中该肽包含选自于由下列所构成的群组的肽库及其组合：由EBV潜伏性膜蛋白-2多肽、EBV核蛋白-1多肽、EBV核蛋白-3c多肽以及EBV-BZLF-1多肽所衍生的肽库，其中各多肽所衍生的肽库是十五肽库，所述十五肽库中各肽片段为15个氨基酸，且肽库中二相邻之十五肽的序列为11个连续氨基酸残基的重迭。

2.如权利要求第1项所述的生产免疫细胞的方法，其中：

该EBV潜伏性膜蛋白-2多肽的序列是与SEQ ID NO：1相同的序列；

该EBV核蛋白-1多肽的序列是与SEQ ID NO：2相同的序列；

该EBV核蛋白-3c多肽的序列是与SEQ ID NO：3相同的序列；

以及

该EBV-BZLF-1多肽的序列是与SEQ ID NO：4相同的序列。

3.如权利要求第1项所述的生产免疫细胞的方法，其中该免疫细胞系为一抗原呈现细胞或一淋巴细胞。

4.如权利要求第1项所述的生产免疫细胞的方法，其中该免疫细胞系选自由下列细胞所组成的群组所衍生的细胞：外围血液单核细胞、骨髓细胞、造血前趋细胞及干细胞。

5.如权利要求第3项所述的生产免疫细胞的方法，其中该免疫细胞以及该免疫原组成物系以活体外方式进行混合培养，并于一适当培养基中进行，该适当培养基进一步包含一细胞激素，且该细胞激素是选自于由下列所构成之群组：GM-CSF、IL-4、IL-15及其组合。

6.如权利要求第1项所述的生产免疫细胞的方法，其中该免疫原组成物进一步包含一免疫促进剂。

7.一种诱发产生免疫作用细胞的方法，其包含下列步骤：

将一抗原呈现细胞以及一免疫原组成物予以混合成一培养物，其中该免疫原组成物包含有至少两种人类疱疹病毒第四型的肽，其中该肽包含选自于由下列所构成的群组的肽库及其组合：由EBV潜伏性膜蛋白-2多肽、EBV核蛋白-1多肽、EBV核蛋白-3c多肽以及EBV-BZLF-1多肽所衍生的肽库，其中各多肽所衍生的肽库是十五肽库；以及令该培养物和一淋巴细胞共同培养于一适当的培养基中，以获取一活化之免疫作用细胞，其中所述十五肽库中各肽片段为15个氨基酸，且肽库中二相邻之十五肽的序列为11个连续氨基酸残基的重迭。

8.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中：该EBV潜伏性膜蛋白-2多肽的序列是与SEQ ID NO：1相同的序列；

该EBV核蛋白-1多肽的序列是与SEQ ID NO：2相同的序列；

该EBV核蛋白-3c多肽的序列是与SEQ ID NO：3相同的序列；

以及

该EBV-BZLF-1多肽的序列是与SEQ ID NO：4相同的序列。

9.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中该免疫原组成物进一步包含一免疫促进剂。

10.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中该淋巴细胞系选自由下列细胞所组成的群组所衍生的细胞：骨髓细胞、造血前趋细胞及干细胞。

11.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中该适当的培养基含有一细胞激素，该细胞激素是选自于由下列所构成之群组：IL-2、IL-7、IL-15及其组合。

12.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中该淋巴细胞是T淋巴细胞。

13.如权利要求第7项所述的诱发产生免疫作用细胞的方法，其中该淋巴细胞系属自体淋巴细胞。

说明书

生产免疫细胞的方法及诱发产生免疫作用细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明系有关于一种产生免疫细胞的方法，尤指用于产生抗疱疹病毒之免疫细胞的方法。

背景技术

[0002] 1964年Achong与Barr等人首次在伯奇氏淋巴瘤病人细胞中分离并发现艾普斯坦-巴尔二氏病毒(Epstein-BarrVirus，EBV)，中文名称为「人类疱疹病毒第四型」(Human herpesvirus-4，HHV-4)，属于疱疹病毒科线型双股DNA病毒。

[0003] EBV像大多数的疱疹病毒一样有两种生活史：细胞裂解时期(Lyticphase)和潜伏期(Latent phase)。其中，细胞裂解时期多发生在上皮细胞，因为病毒会在细胞内大量复制，最后导致细胞破裂，释出大量的病毒。而潜伏期多发生在B淋巴球，EBV藉由镶嵌在B淋巴球的基因体中，以逃避免疫细胞的攻击，同时也有机会造成淋巴球不正常增生而引起癌化与其它慢性感染症状，例如「伯奇氏淋巴瘤」、「胃腺癌」、「鼻咽癌」、「何杰金氏病」、「T淋巴瘤」、「淋巴球增生性疾病」、「艾滋病相关淋巴癌」与「移植后淋巴球增生疾病」。

[0004] 从分子生物学及EBV结构研究发现，近100个病毒基因会在细胞复制的过程中被表现出来，然而只有10个基因会在被潜伏感染的B细胞(latently infected B cells)表现出来，其中包含有两种未转译RNA(例如EBV-encoded RNA；EBER)、6种核蛋白(例如核蛋白-1(EBV nuclearantigen-1，EBNA1)及核蛋白-3c(EBV nuclear antigen-3c，EBNA3c)与两种膜蛋白(包含潜伏性膜蛋白-1(latent membrane protein-1；LMP1)及潜伏性膜蛋白-2(latent membrane protein-2；LMP2))。在不同潜伏期的病毒会表现不同的蛋白质，这些病毒蛋白亦会在上述恶性肿瘤细胞中大量表现。

[0005] 目前现行治疗EBV相关感染疾病的治疗上，除了外科手术与放射线治疗外，有传统的抗病毒药物(例如acyclovir)与抗肿瘤用药物，及新兴的抗体药物(例如Gp350vaccine；Rituximab)。然而前述药物都无法突破血脑障壁(blood-brain barrier；
BBB)，亦即无法经由体循环(systemic circulation)而到达脑部感染部位，此外，即使这类抗病毒药物有效抑制EBV增生，但是病患往往无法负荷药物所产生的副作用因而降低或停止用药，以致于无法有效治疗。

[0006] 目前对于移植受者之疱疹病毒的感染主要是使用抗病毒试剂进行先行性治疗或预防治疗。然而，这些药理学方式具有其限制，诸如药物毒性、抗药性的发生、不佳的口服生物可利用性(oral bioavailability)以及低效力等问题。死亡率在即使已利用抗病毒试剂治疗之情况下仍然偏高，特别是于疗程中未尽早开始治疗。此外，当病患长期使用这些试剂，对于抗病毒试剂的抗药性会逐渐产生。

[0007] 为克服前述传统药物所具有的缺点，具有专一性高、副作用低、不易产生抗药性，以及可个体化等优点的免疫疗法便应运而生。现有针对疱疹病毒感染疾病之免疫疗法是使用以活病毒为基础的疱疹病毒抗原来源(herpes virus antigen sources based on live virus)、经疱疹病毒感染的细胞(herpes virus-infected cells)、疱疹病毒基因表现载体(hepresherpes virus geneexpression vector)或者合成的疱疹病毒蛋白或肽，藉以活化对疱疹病毒有专一性免疫反应的抗原呈现细胞(antigen presenting cells)，希望藉由已活化的抗原呈现细胞可以在活体外(ex vivo)或活体内(in vivo)刺激个体产生对EBV有专一性的毒杀型T细胞(CTL)及细胞免疫反应。实验证实，在曾经感染EBV且有血清反应的人体(非急性感染)主要系藉由第一型主要组织兼容复体(MHC class I)的毒杀型T细胞控制EBV，故EBV专一毒杀型T细胞也经常可以从曾经感染过EBV个体的周边血液中发现。此外，潜伏性膜蛋白1及潜伏性膜蛋白2抗原专一性的毒杀型T细胞在体外试验中也已经被证实可以有效的毒杀藉由第一型主要组织兼容复体表现这两种抗原细胞株。但是使用病毒或经病毒感染的细胞作为抗原来源，会有病毒污染以及导致感染的潜在风险；而使用全长疱疹病毒基因或蛋白质作为抗原来源则又有诱发免疫抑制作用(immune suppression)或免疫耐受性(immunetolerance)的问题。

发明内容

[0008] 为克服上述问题，本发明系提供一种生产免疫细胞的方法，包含将免疫细胞以及免疫原组成物予以混合培养，其中免疫原组成物包含有至少两种衍生自人类疱疹病毒第四型的肽。

[0009] 因此，本发明的主要目的在于提供一种生产免疫细胞的方法，可用于诱发针对疱疹病毒之免疫反应，藉以用来预防以及治疗疱疹病毒相关疾病。

[0010] 本发明另一目的在于提供一种生产免疫细胞的方法，由于使用两种、三种或四种EBV肽库组成的混合库作为免疫原组成物，相较于使用仅包含有单一种EBV蛋白质衍生的肽的免疫原组成物，本方法可以更为有效的活化抗-EBV免疫反应。

[0011] 本发明另一目的在于提供一种生产免疫细胞的方法，由于没有使用活病毒、经EBV感染细胞，所使用之抗原亦非全长EBV蛋白质，因此不会产生非所欲的感染问题，且亦不具有诱发免疫抑制作用及免疫耐受等潜在风险。

[0012] 本发明中亦提供一种诱发产生免疫作用细胞(immune effector cells)的方法，其包含下列步骤：将树状细胞以及以及免疫原组成物予以混合成培养物；以及令前述培养物和免疫细胞共同培养于适当的培养基中，以获取活化之免疫作用细胞，其中免疫原组成物包含有至少两种衍生自人类疱疹病毒第四型的肽。

[0013] 因此，本发明的另一目的在于提供一种诱发产生免疫作用细胞的方法，可用于预防以及治疗疱疹病毒相关疾病。

[0014] 本发明另一目的在于提供一种诱发产生免疫作用细胞的方法，由于使用两种、三种或四种EBV肽库组成的混合库作为免疫原组成物，相较于使用仅包含有单一EBV蛋白质衍生的肽的免疫原组成物，本方法可以更为有效的活化抗-EBV免疫反应。

[0015] 本发明另一目的在于提供一种诱发产生免疫作用细胞的方法，由于没有使用活病毒、经EBV感染细胞，所使用之抗原亦非全长EBV蛋白质，因此不会产生非所欲的感染问题，且亦不具有诱发免疫抑制作用及免疫耐受等潜在风险。

[0016] 本发明另一目的在于提供一种诱发产生免疫作用细胞的方法，可选择使用自体淋巴细胞，以降低后续进行细胞治疗时所可能产生的免疫排斥问题。

附图说明

[0017] 第1A图为本发明生产免疫细胞的方法流程示意图。

[0018] 第1B图为本发明所使用的EBV潜伏性膜蛋白-2十五肽库组成示意图。

[0019] 第2图为本发明实验1中IFN-gamma分析图。

[0020] 第3A图为本发明实验2中捐赠者1之IFN-gamma分析图。

[0021] 第3B图为本发明实验2中捐赠者2之IFN-gamma分析图。

[0022] 第4图为本发明实验3中细胞内表现IFN-gamma及CD107a比例分析图。

[0023] 第5A图为本发明实验4CD4族群中表现IFN-gamma及CD107a流式细胞分析图。

[0024] 第5B图为本发明实验4CD8族群中表现IFN-gamma及CD107a流式细胞分析图。

[0025] 第5C图为本发明中实验4中细胞内表现IFN-gamma及CD107a比例分析图。

[0026] 主要组件符号说明

[0027] 免疫原组成物 1

[0028] 肽 11、12、13、14

[0029] EBV潜伏性膜蛋白-2十五肽库 110

[0030] 肽片段 111、112、113

[0031] EBV潜伏性膜蛋白-2完整肽 2

[0032] 抗原呈现细胞 30

[0033] 已活化抗原呈现细胞 31

[0034] 单纯淋巴细胞 40

[0035] 免疫作用细胞 41

[0036] 患者 5

具体实施方式

[0037] 由于本发明系揭露一种生产免疫细胞的方法以及诱发产生免疫作用细胞的方法，其中所利用之免疫学原理、细胞培养、细胞染色及侦测等相关技术，已为相关技术领域具有通常知识者所能明了，故以下文中之说明，不再作完整描述。同时，以下文中所对照之图式，系表达与本发明特征有关之示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制，合先叙明。

[0038] 本发明第一实施例系提供一种生产免疫细胞的方法，包含有下列步骤：将免疫细胞以及免疫原组成物予以混合培养，而所使用的免疫原组成物包含有至少两种衍生自人类疱疹病毒第四型的肽。免疫细胞可为抗原呈现细胞(antigen presenting cell；APC)或淋巴细胞(lymphocyte)。

[0039] 前述的混合培养可采用活体外(ex vivo)方式进行，并在适当的培养基中进行培养，培养基则可进一步包含有GM-CSF、IL-4、IL-15等细胞激素，或是前述细胞激素的任意组合。

[0040] 本发明所提供之免疫原组成物，可包含两种、三种，甚或是四种以上的肽。请参考第1A图，为本发明生产免疫细胞的方法流程示意图。如图所示，免疫原组成物1包含有肽11、肽12、肽13，及肽14。在适当的培养环境下，将免疫原组成物1加入抗原呈现细胞30的培养环境中，促使抗原呈现细胞30活化成为已活化抗原呈现细胞(activatedAPC)31。

[0041] 肽11、肽12、肽13、及肽14均衍生自人类疱疹病毒第四型(humanherpesvirus-4；HHV-4，又称「艾普斯坦-巴尔二氏病毒」Epstein-Barr virus；EBV)。这些肽的种类较佳是由EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c以及EBV-BZLF-1的多肽中，两种或两种以上的多肽所衍生的肽片段组合而成。其中EBV潜伏性膜蛋白-2具有与SEQ ID NO 1实质上相同的序列，EBV核蛋白-1具有与SEQ ID NO 2实质上相同的序列，EBV核蛋白-3c具有与SEQ ID NO 3实质上相同的序列，而EBV-BZLF-1具有与SEQ ID NO 4实质上相同的序列。

[0042] 其中本实施例中所使用的EBV核蛋白-1多肽，并非为全长的EBV核蛋白-1，而为截头型(N-terminal truncated)，截断片段为全长成熟的EBV核蛋白-1其N端第1个氨基酸至第392个氨基酸，故其序列相当于全长成熟EBV核蛋白-1的第393个氨基酸至第641个氨基酸，具有与SEQ ID NO2实质相同的序列。

[0043] 此处表示之本发明所提供之免疫原组成物1，其所包含的肽种类个数可为两种、三种，或四种，但实际上根据本发明的精神，其所包含的肽种类个数除上述所列之情形之外，实可至五种甚或以上。

[0044] 本实施例所提供的免疫原组成物1可用于活体外诱发针对疱疹病毒(herpes virus)之免疫反应上，亦可用于制造治疗疱疹病毒感染疾病之医药品。

[0045] 前述「所衍生的肽片段」系指具有所述蛋白质序列的全部或一部分序列的肽或肽片段。而前述「实质上相同」系指只要氨基酸序列之具有一定程度的相似度，但不影响其编码的蛋白质之活性。上述一定程度的相似度较佳的是70％以上；更佳的是80％以上；以及又更佳的是90％以上。

[0046] 本实施例使用的免疫原组成物，以包含有从EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c以及EBV-BZLF-1多肽中，选择两种或两种以上的多肽所衍生的肽库的组合，其诱发免疫反应的效果较使用单一种多肽衍生肽库的效果为佳；其中又以包含有EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c以及EBV-BZLF-1四种多肽所衍生的肽库的组合为最佳。而所谓的「肽库(peptide pool)」系指由复数个肽片段组成的混合库，同一肽库中的肽片段序列是依同一基因产物的序列所设计，并且延扩(spanning)此基因产物的整体序列，而各相邻片段间具有部分氨基酸重迭(overlapping)，各肽片段的长度较佳为(但不必然)完全相同。

[0047] 本发明所使用的肽库中各肽片段以介于12至20个氨基酸之间为佳，其中又以为15个氨基酸为最佳。此外，在相邻的肽片段间，具有互相重迭的序列，而互相重迭长度以介于10至15个连续氨基酸残基为佳，其中又以具有11个连续氨基酸残基重迭为最佳。

[0048] 例如，请参考第1B图，为本发明中所使用的「EBV潜伏性膜蛋白-2十五肽库(pentadecapeptides)」组成示意图。举例而言，本实施例所提供之免疫原组成物1中的肽11系为EBV潜伏性膜蛋白-2十五肽库110。如图所示，EBV潜伏性膜蛋白-2十五肽库110包含有复数个长度为15个氨基酸的肽片段，其中肽片段111其序列由EBV潜伏性膜蛋白-2完整肽2的第1个氨基酸至第15个氨基酸，肽片段112由于必须满足长度为15个氨基酸且与肽片段111之间有11个连续氨基酸残基重迭的条件，故其序列是由EBV潜伏性膜蛋白-2完整肽2的第4个氨基酸至第19个氨基酸；而为满足上述条件，肽片段113其序列则是由EBV潜伏性膜蛋白-2第8个氨基酸至第23个氨基酸，后续以此类推，直至EBV潜伏性膜蛋白-2的最后一个氨基酸。但是最后若是不足4个连续的氨基酸时，则藉由增加重迭部分之氨基酸序列，以满足各肽为15员(15-mer)的条件。因此，此肽库中的所有肽片段，其序列总长即延扩EBV潜伏性膜蛋白-2基因产物整体序列。

[0049] 本实施例中所使用的免疫细胞可以是树状细胞或淋巴细胞，较佳系由下列细胞所衍生而得：外围血液单核细胞(peripheral blood mononuclearcell)、骨髓细胞(bone marrow cell)、造血前趋细胞(hematopoietic progenitorcell)或干细胞(stem cell)。

[0050] 本实施例所提供的免疫原组成物由于包含有其中两种、三种或四种EBV肽库组成的混合库(mixed pool)，相较于单一的EBV蛋白质衍生的肽可以更为有效的活化抗-EBV免疫反应，在下列的实验中，实验结果证实使用本实施例所提供的免疫原组成物，最终得到的+ +活化CD8 以及CD4T细胞对于EBV具有专一性，并具有高作用功能(effector functions)。

[0051] 为了要制成治疗用途的医药品，本实施例中的免疫原组成物可进一步包含生理上可接受之载剂或赋型剂、免疫促进剂(immunostimulant)，其中免疫促进剂可进一步包含有佐剂(adjuvant)。前述佐剂可为完全(complete)或不完全(incomplete)佐剂，并可由避免抗原快速代谢之物质及/或免疫反应刺激物(stimulator of immune responses)所组成，例如由氢氧化铝及/或矿物油组成的避免抗原快速代谢之物质。而前述免疫反应刺激物则可为界面活性剂(surface active agent)的共聚合物(copolymer)、由百日咳杆菌所衍生之蛋白质(Bordetalla pertussis derived proteins)、由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)所衍生之蛋白质、-galatosylceramide(-GalCer)及其衍生物以及由CpG所衍生的聚核苷酸(polynucleotides)，或是由上述物质任意混合而组成。

[0052] 本发明第二较佳实施例系提供一种诱发产生免疫作用细胞的方法，包含下列步骤：

[0053] A.将抗原呈现细胞以及免疫原组成物予以混合成培养物，其中免疫原组成物之组成特征如第一较佳实施例中所述。

[0054] B.将前述培养物和淋巴细胞共同培养于适当的培养基中，以获取活化之免疫作用细胞。其中淋巴细胞以T淋巴细胞为佳，而适当的培养基则可添加IL-2、IL-7、IL-15等细胞激素，或是添加前述细胞激素的组合。

[0055] 请继续参考第1A图，在适当的培养环境下，将免疫原组成物1加入抗原呈现细胞30的培养环境中，促使抗原呈现细胞30活化成为已活化抗原呈现细胞31。再将上述已活化抗原呈现细胞31与单纯淋巴细胞( )40共同培养，使单纯免疫细
胞40增殖(cell expansion)以及活化(cell activation)成为免疫作用细胞(effector cell)41。由于此种方式取得之免疫作用细胞41具有在活体内辨识及清除免疫原组成物1之功能，故可利用适当方式将免疫作用细胞41注射至患者5体内，促使患者5产生后天免疫反应(adaptive immunity)，用以治疗疱疹病毒感染疾病。

[0056] 此 外，本 实 施 例 中 所 使 用 之 淋 巴 细 胞 可 选 用 自 体 淋 巴 细 胞(autologouslymphocytes)，以降低后续进行活体细胞治疗时，所可能产生的免疫排斥风险。

[0057] 实验结果显示，经由本实施例所得到免疫作用细胞(不论是CD4或CD8族群)，具有针对EBV的专一性。此外，实验结果进一步显示，相较于受到仅含单一种肽库，包含有两种、三种的免疫原组成物刺激而得的树突细胞的活化效果较佳，而受到包含有四种肽库(EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c及EBV-BZLF-1)免疫原组成物刺激后所得的树突细胞，其诱发出的免疫细胞其作用效果最强。

[0058] 本发明将进一步藉由下面的实验来作说明，但并非用以限定本发明的权利要求权利。

[0059] 实验材料与方法

[0060] 肽以及抗原

[0061] 使用于下面各实验中的15员肽库(15-mer peptide pools)是购自于JPTPeptide Technologies GmbH(Berlin，Germany)，其包括延扩(spanning)以下列者整体之具有11个氨基酸部分重迭的序列之十五肽库(pentadecapeptides)：EBV潜伏性膜蛋白-2(SEQ ID NO：1)(497个氨基酸，其所衍生的肽库含122种肽)、EBV核蛋白-1(SEQ ID NO：2)(249个氨基酸，其所衍生的肽库含60种肽)、EBV核蛋白-3C(SEQ ID NO：3)(641个氨基酸，所衍生的肽库含265种肽)以及EBV-BZLF-1(SEQ ID NO：4)(245个氨基酸，所衍生的肽库含59种肽)。其它抗原及肽可以藉由不同方法合成。其中由WT-1(Wilm’s tumor 1)(Swiss prot：P19544)所衍生的肽库(WT33；JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，Germany)以及由C型肝炎病毒之核心病毒(core protein of Hepatitis C virus)(NCBI ACCESSION：
ABV46234(1-191 //product＝″core protein″)所衍生的肽库，并以Peptide Scan
15/11之方式，自JPT Peptide Technologies公司(JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，Germany订购，其等系被用来作为非专一性肽库。

[0062] 外围血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离[0063] 下列各实验中所使用的血浆析离的血液(apheresis blood)以及全血系取自于健康的捐赠者。下列实验所使用的外围血液单核细胞系用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare Bio-Sciences AB，NJ，USA)藉由梯度密度离心予以制备(Han S.et al.，2008，Molecular Therapy，16：269-279)。制备而得的外围血液单核细胞的存活率藉由锥虫蓝染色(trypan blue staining)予以测定，只有细胞存活率大于80％之组别的细胞会继续使用于下列实验。

[0064] 树状细胞(dendritic cells，DC)的制备

[0065] 将外围血液单核细胞以1×107细胞/孔(cells/well)的细胞密度置于6孔盘中，以将外围血液单核细胞培养于AIM-V培养基(Gibco-BRL，CA，USA)中历时2小时进行贴附。接而，温和的移除未贴附的细胞，并且进行冷冻作为用于后续共培养实验中之T淋巴细胞的来源。将贴附的细胞予以培养于添加有50ng/mL之GM-CSF(Biosource，CA，USA)以及25ng/mL之IL-4(Biosource，CA，USA)的AIM-V培养基中。为了产生树状细胞，细胞以GM-CSF以及IL-4培养历时24小时，再以IFN-gamma(20ng/mL)(Gentaur)、TNF-alpha(50ng/mL)(R&D systems，MN，USA)、IL-1beta(10ng/mL)(R&D systems，MN，USA)、IL-6(10ng/ml)(R&D systems)以及PGE2(1μM)(Sigma-Aldrich，MO，USA)培育24小时，作为成熟化反应(maturation)。树状细胞之表现型(phenotype)藉由流式细胞分析法分析。

[0066] 以树状细胞活化且经体外(ex vivo)扩增的抗原专一性免疫细胞

[0067] 经树状细胞活化的免疫细胞的分离及培养方法是依据Han等人所提出的方法(Han S.et al.，2008，Molecular Therapy，16：269-279)。简言之，经由前段方式所制得的成熟树状细胞，被装载(loaded)以肽(5μg/mL)或其它抗原历时3小时，并予以辐射照射(2,500rads)。树状细胞与同源性非贴附性外围血液单核细胞(PBMC)以1∶20的比例予以共培养于具有2-5％人类AB血清之AIM-V培养基中。于第三天，予以添加IL-2(Gentaur，Aachen，Germany)、IL-7(Gentaur)以及IL-15(Gentaur)。接着，每隔一天予以添加新鲜的具有该等细胞激素(cytokines)之培养基。共培养物中之T细胞的功能分析是透过细胞内细胞激素染色(intracellular cytokine staining)来进行。

[0068] CD107a 以 及 细 胞 内 细 胞 激 素 染 色 (CD107a and intracellular cytokinestaining)

[0069] 细胞染色之分析是如Han等人之著作所述者予以进行(Han et al.，同上述)。简5
言之，3×10 个经扩增的EBV专一性免疫作用细胞(expanded EBVimmune effector，IE)使用经抗原装载的同源性树状细胞(anitgen-loadedautologous DCs)或单核细胞于有或没有抗-CD 107a-FITC的AIM-V培养基中予以进行刺激。于刺激反应1小时后，予以添加孟宁素(Monensin)(Sigma)。于5小时后，细胞针对CD4及CD8染色、固定(fixed)、穿孔(permeablized)并且利用针对IFN-gamma的抗体(全部来自于BD Bioscience)并使用FIX/PERM以及PERM/Wash solution(BD)予以染色。

[0070] 酵素连结免疫斑点分析(Enzyme-linked ImmunoSpot assay，ELISpotassay)[0071] 新 鲜 分 离 的 PBMC以1×105cell/well的 浓 度 盛 盘 于 涂 布 有 10μg/mlanti-IFN-gamma(1-D1K；MabTech)之96-孔盘并且使用5％去活性人类AB血清(inactivated human AB serum)(Valley Biomedical，USA)予以阻隔(block)。细胞利用不同的肽库的组合以二重复的方式进行刺激反应。于37℃于5％CO2下培育18至20小时后，将细胞予以冲离并将1μg/ml经生物素标记的抗-IFN-gamma(biotin labeled anti-IFN-gamma)(7-B6-1；MabTech)予以加入。藉由加入链霉抗生物素标记的碱性磷酸酯酶(Streptavidin conjugated alkaline phosphatase，Streptavidin conjugatedALP)(MabTech)以产生呈色反应[斑点(spots)]，继而加入将受质BCIP/NBT-plus(Bio-Rad)。
6
斑点的数目藉由ELISPOT读取仪(AutoImmuneDiagnostika)计算出，以每1×10 的PBMC中含有斑点形成细胞(spot-formingcell，SFC)表示。

[0072] 实验1

[0073] 选择5位健康的捐赠者，取得其周边血液单核细胞，以EBV潜伏性膜蛋白-2肽库(Lmp2)、EBV核蛋白-3c肽库(EBNA3c)及EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c及EBV-BZLF-1四种组合肽库(4mix)分别刺激，进行培养20小时后，以ELISpot分析方法进行IFN-gamma分析。实验结果如第2图所示，其中实验结果显示不论哪一位捐赠者，使用四种组合(4mix)肽库刺激后所产生的IFN-gamma效果最佳。

[0074] 实验2

[0075] 取两位健康捐赠者的周边血液单核细胞，分别用下列包含不同肽肽库组合的免疫原组成物进行刺激，培养20小时后，以ELISpot分析方法，进行IFN-gamma分析。各组合分别为：1：EBV潜伏性膜蛋白-2，2：EBV核蛋白-3c，3：EBV核蛋白-1，4：EBV-BZLF-1，5：EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-3c，6：EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-1，7：EBV核蛋白-3c+EBV核蛋白-1，8：EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-1+EBV核蛋白-3c，9：EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-1+EBV核蛋白-3c+EBV-BZLF-1。其结果如第3A图及第3B图所示，分别为捐赠者1及2的实验结果。实验结果进一步显示使用四种肽库组合(组合9)，刺激周边血液单核细胞产生IFN-gamma的效果强于使用单一种肽库(组合1-4)、任两种肽库组合(组合5-7)或三种肽库组合(组合8)。

[0076] 实验3

[0077] 依照前述的实验方法，以单一种的肽库：EBV潜伏性膜蛋白-2(Lmp2)、EBV核蛋白-1(ENBA1)、EBV核蛋白-3c(EBNA3c)或EBV-BZLF-1(BZLF 1)，及包含EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-1+EBV核蛋白-3c+EBV-BZLF-1四种组合肽库(4mix)，分别处理树突细胞进而刺激T细胞共同培养15天后，将依上述五种方式刺激活化所得的五种免疫作用细胞，各自针对带有专一性抗原的树突细胞再次进行刺激5小时，同时以非专一性抗原(WT-1)处理之同源的树突细胞作为对照组。前述受到再刺激的免疫细胞，观察其细胞内IFN-gamma及CD107a的产生量，再将各组中专一性抗原所得到IFN-gamma及CD107a表现的值扣除非专一性抗原的背景值，分CD4及CD8族群绘制成柱状图，藉以对EBV专一性作用细胞的功能进行评估。实验结果如第4图所示，单一种肽库刺激免疫作用细胞在功能检测上具有些微的效果，但以四种肽库混合刺激方式所得的免疫作用细胞，则表现出最高的IFN-gamma细胞激素及CD107a，免疫效果为最好，这样的现象在CD4及CD8族群中都可以看到。

[0078] 实验4

[0079] 首 先将 树 突 细 胞 以EBV潜 伏 性 膜 蛋 白-2+EBV核 蛋 白-1+EBV 核蛋白-3c+EBV-BZLF-1四种组合肽库处理，并与未活化之T细胞进行共同培养15天，以得出活化的免疫作用细胞。将依前述方式所活化的免疫作用细胞，分别使用带有单一种肽库：EBV潜伏性膜蛋白-2、EBV核蛋白-1、EBV核蛋白-3c或EBV-BZLF-1，以及EBV潜伏性膜蛋白-2+EBV核蛋白-1+EBV核蛋白-3c+EBV-BZLF-1四种组合肽库(4pepmix)的树突细胞再次刺激。正向的对照组为以佛波醇酯(phorbol-12-myristate-13-acetate)及离子霉素(Inonmycin)(PMA+Inomysin)刺激树突细胞来活化前述得出的免疫作用细胞，负向对照组则使用带有非专一性抗原(WT-1)的树突细胞。而以未处理的免疫作用细胞(IE only)作为基准。经由前述再刺激处理所得的免疫细胞，观察其细胞内IFN-gamma及CD107a的产生量，藉以评估对抗原专一性作用细胞的功能。实验结果为第5A图、第5B图及第5C图所示，其中第5A图及第5B图分别为经流式细胞分析仪所得之CD4及CD8族群分析图。第5C图则表示同时表现有IFN-gamma及CD107a的细胞所占细胞全体中的百分比，结果显示，不管是在CD4或是CD8族群中，使用四种肽库混合处理的树突细胞所活化得出的免疫作用细胞针对带有任何单一种EBV肽库的再刺激都有反应，其中又以受到带有4种四种EBV肽库混合的树突细胞的再刺激效果最佳。

[0080] 以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并非用以限定本发明申请专利权利；同时以上的描述对于熟之本技术领域之专门人士应可明了与实施，因此其它未脱离本发明所揭示之精神下所完成的等效改变或修饰，均应包含于下述之权利要求。

[0081] 序列表

[0082] <110>鑫品生医科技股份有限公司

[0083] <120>生产免疫细胞的方法及诱发产生免疫作用细胞的方法

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[0166] <223>人类疱疹病毒第四型AG876(Human herpesvirus 4 strain AG876)核蛋白-1(EBNA-1)经N端裁切之蛋白片段，相当于全长成熟EBV核蛋白-1的第393个氨基酸至第641个氨基酸

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