非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及应用

摘要

本发明提供了一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及其应用。通过基于猪瘟病毒(CSFV)石门株感染性cDNA克隆反向遗传操作，构建CSFV E2基因缺失的突变体感染性cDNA克隆，在其开放阅读框的5′端插入乙型脑炎病毒(JEV)囊膜糖蛋白E的主要保护性抗原区编码序列，构建了E2基因缺失的CSFV嵌合突变体；该E2缺失嵌合突变体能在表达CSFVE2p7的反式互补细胞系中拯救出抗猪瘟和乙脑的双价疫苗种毒并进行增殖。该疫苗接种猪体能够诱导机体产生针对CSFV和JEV的特异性免疫应答，而其不能在猪体内形成感染性病毒颗粒和在猪群中传播，疫苗接种猪不产生E2抗体可用于区分CSFV野毒感染猪，是一种安全、高效的非传播双价标记疫苗。

权利要求

1.一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗，其是通过将CSFV全长E2基因缺失，构建得到非传播CSFV E2缺失突变体；将FMDV的2A蛋白编码序列、泛素蛋白编码序列和JEV E蛋白抗原区编码序列融合得到JEV E蛋白抗原区编码基因与2AUbi的融合序列，所述融合序列的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，并将其插入到CSFV E2缺失突变体开放阅读框的5′端，构建得到非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述JEV E蛋白抗原区编码基因5′端含proCSFVN N末端21个氨基酸编码序列。

3.权利要求1或2所述疫苗在制备预防猪瘟和/或乙脑药物中的应用。

4.含有权利要求1或2所述疫苗的药物。

说明书

非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域。本发明涉及一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗及其构建方法，同时涉及该疫苗在预防猪瘟和乙型脑炎中的应用。技术背景

[0002] 猪瘟是猪的一种传染性极强的病毒性疾病，早期称为猪霍乱(Hog Cholera，HC)，可感染各年龄阶段猪，一年四季流行，发病率和死亡率均很高，危害巨大。猪瘟的病原体是猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，在国际兽疫局(OIE)制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入A类16种法定报告的传染病之一。我国近年来猪瘟频繁爆发流行，给养猪业造成了严重经济损失，妨碍了畜牧业的发展和出口贸易，提高对猪瘟的预防和控制水平是科技工作的重大课题。

[0003] CSFV基 因 组 长 为 约12.3kb 的 单 股 正 链RNA，由5 ′ 端 非 编 码 区(5′Untranstaledregion，5′UTR)、一个大的开放阅读框架(ORF)和3′端非编码区(3′UTR)构成。ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻译过程中或翻译后，被病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟蛋白质，包括rns pro4种结构蛋白C、E 、E1、E2和8种非结构蛋白N 、P7、NS2、NS3、NS4A、S4B、NS5A和NS5B。
其中，E2蛋白是CSFV的跨膜糖蛋白，介导病毒的吸附与入侵，是CSFV毒力相关因子和保护性抗原蛋白之一。CSFV感染机体能诱导机体产生高滴度E2抗体。E2常以同源二聚体或E1E2异源二聚体存在于病毒粒子和宿主细胞的表面；E2与下游的P7蛋白有时加工切割不完全，在CSFV感染的细胞中可以发现E2p7这种稳定的中间体。

[0004] 早在1951年，我国研究人员筛选出免疫原性优良的CSFV石门毒株(殷震，1997)，该毒株作为中国CSFV标准强毒株沿用至今。当时使用CSFV石门毒株，灭活制成猪瘟结晶紫甘油灭活疫苗，使用后迅速控制了国内的猪瘟疫情。1954-1956年间，中国兽药监察所等单位的研究人员将CSFV强毒株(其中包括标准强毒石门株)适应家兔，在兔体连续传代，选育出一株对猪基本无毒力，并保持CSFV免疫原性的兔化毒株，即中国猪瘟兔化弱毒疫苗株(hog cholera lapinized vaccine，HCLV)。猪瘟兔化弱毒疫苗的成功研制和应用，对我国猪瘟的预防和控制起了决定性作用。然而，近50年来猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用，并未控制猪瘟的发生。近年来，我国猪瘟的发生出现了许多新特点，表现为从频发的大流行转变为无规律的散发流行；临床症状从典型变为非典型猪瘟，病毒毒力降低，病程由急性、亚急性转变为以慢性为主，出现持续感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍以及新生仔猪的先天性感染等。尽管疫苗的免疫剂量和免疫次数增加，仍不能控制猪瘟的发生，而且呈蔓延趋势。其中，猪瘟兔化弱毒疫苗接种与CSFV野毒感染猪不能用血清学检测方法相区分，无法剔除CSFV野毒感染猪，一旦发生感染，病毒长期存在，是导致猪瘟散发流行的主要原因之一。猪瘟的发生、传播和流行是严重制约我国养猪业健康发展、增加农民收入和发展国际贸易的瓶颈。为满足我国对猪瘟预防、控制和最终根除的需要，研制新一代猪瘟疫苗制品以替代传统的猪瘟兔化弱毒疫苗，势在必行。

[0005] 流行性乙型脑炎，又称日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)，是一种自然疫源性人畜共患的急性传染病，由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，通过蚊为媒介传播，以高热和狂暴或沉郁等中枢神经症状为特征。JEV与CSFV同属黄病毒科成员，其基因组为约11kb大小的单股正链RNA分子，由5′端非编码区、大的开发阅读框(ORF)和3′端非编码区组成。ORF 依次编码C-PreM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5等11种蛋白质。其中，E蛋白是JEV的主要结构蛋白，由500个氨基酸组成，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。早期研究结果表明，E蛋白的保护性抗原表位集中在蛋白质结构域III的氨基酸序列内(位于E蛋白第292-402位氨基酸)[Virology，1999，26：31-42；Vaccinc，2003，21：2516-2522]。

[0006] JEV主要侵害人的中枢神经系统，引起急性病毒性脑炎，导致高病死率，或神经-精神后遗症；JEV感染猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间扩增宿主，是本病最主要的传染源。因此，预防、控制乙脑对于提高养猪效率和促进公共卫生安全都具有十分重要的意义。

[0007] 疫苗免疫注射是防治流行性乙脑发生的唯一可靠方法，虽然现有的灭活疫苗和弱毒疫苗对乙脑的预防控制起了很大作用，但传统的乙脑疫苗，无论是灭活疫苗还是减毒活疫苗都存在明显不足。鼠脑灭活疫苗有较多的脑组织成分，接种后易发生严重的变态反应性脑脊髓炎，同时存在注射剂量大、保护效力不持久等缺点；减毒活疫苗则存在毒力回复的潜在危害。因此，开发安全有效，价廉的新一代乙脑疫苗显得尤为迫切和重要。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗。

[0009] 本发明的另一个目的在于提供该疫苗在制备防治猪瘟和/或乙脑药物中的应用。

[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案是：通过将CSFV全长E2基因或其部分缺失，构建得到非传播CSFV突变体；将FMDV的2A蛋白编码序列、泛素蛋白Ubi编码序列和JEV E蛋白抗原区编码序列融合得到融合序列，并将其插入到CSFV突变体开放阅读框的5′端，构建得到非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗。

[0011] 所述融合序列的上游含CSFVNproN末端21个氨基酸编码序列。该融合序列编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，进而，本发明还提供该融合多肽及其编码基因。在本发明一个优选的实施方式中，所述融合序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示。

[0012] 其中，所述CSFV为其感染性cDNA克隆，优选为石门株感染性cDNA克隆。在本发明优选实施方式中，该克隆为pT7SM。

[0013] 本发明通过在CSFV感染性cDNA克隆上反向遗传操作，缺失全长E2基因或其部分区域，在ORF的5′端插入JEV E蛋白保护性抗原区编码序列(SEQ ID NO.15)，构成了非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗。该疫苗种毒株只能在表达E2的互补细胞系上增殖和形成完整的病毒颗粒，不能在其他细胞上传代，是非常安全的非传播减毒活疫苗。由于其缺失了CSFV E2蛋白或其部分区域，疫苗免疫接种不能引起猪体产生E2抗体，通过ELISA方法检测E2抗体能够区分疫苗接种与CSFV自然感染猪，是一种标记疫苗。另一方面，在CSFV E2缺失突变体毒株中表达乙脑病毒E蛋白保护性抗原表位，该疫苗免疫接种能诱导机体抗猪瘟和乙脑的特异性免疫应答和有效保护，是一种有效的双价疫苗。

[0014] 本发明还提供制备非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗的方法，其包括如下步骤：A)构建CSFV石门株全长感染性cDNA克隆，得到重组质粒pT7SM；B)PCR扩增CSFV石门株基因组中E2基因相邻的上游1671bp编码序列(770-2440nt)，下游902bp编码序列(3560-4461nt)，重叠PCR融合E2上、下游两端片段产生E2基因缺失片段；C)限制性核酸内切酶ClaI和Kpn1双酶消化E2基因缺失的重叠PCR融合片段，将其替换pT7SM的E2基因及两端相邻区域，得到缺失E2基因的重组质粒pT7SMdelE2；D)PCR分别扩增获得含proN N端21个氨基酸编码片段的CSFV 5′非编码区、JEV E蛋白抗原区编码序列和2AUbi编码序列，重叠PCR技术融合成大片段，经限制性核酸内切酶SalI和ClaI双酶消化，克隆至pT7SMdelE2中，获得制备双价标记减毒活疫苗的嵌合感染性cDNA克隆pT7SMdelE2/JEV-ΔE(详见具体实施例1)。

[0015] 在本发明中，双价疫苗种毒的拯救是在表达CSFV E2p7蛋白的反式互补PK15细胞系(PK15/E2p7)中完成。具体的：以感染性cDNA克隆pT7SMdelE2/JEV-ΔE为模板，体外转录出基因组RNA，采用LipofectAmine2000将RNA转染PK15/E2p7细胞系，5％CO237℃孵育72h，经冻融细胞和差速离心，收集细胞培养上清病毒液，病毒经在PK15/E2p7上传代和滴度测定，获得表达JEV E蛋白抗原表位、E2基因缺失的CSFV嵌合病毒突变体(详见具体实施例1)。

[0016] 本发明非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗具有如下优点：与传统的CSFV及JEV疫苗相比较，该疫苗是一种非传播基因工程双价标记减毒活疫苗，接种后能同时预防猪瘟和乙脑两种疫病；疫苗接种动物不产生E2抗体，通过ELISA方法检测CSFV E2抗体，可区分疫苗接种和CSFV野毒感染猪，是一种可替代传统猪瘟和乙脑疫苗的新型疫苗，可用于猪瘟和乙脑的防制，以及猪瘟净化和根除。

附图说明

[0017] 图1为一种非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗结构与组成示意图。

[0018] 图2为间接免疫荧光染色和Western blot检测PK15/E2p7细胞系中E2蛋白表达：A.PK15/E2p7细胞系E2单抗免疫荧光染色；B.普通PK15细胞免疫荧光染色；C.Western blot检测PK15/E2p7细胞系中E2p7蛋白表达。

[0019] 图3为间接免疫荧光染色检测非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗感染PK15/E2p7细胞系后表达NS3蛋白：A.感染双价疫苗重组病毒的PK15/E2p7细胞系经抗NS3多克隆抗体免疫荧光染色；B.未感染重组病毒的PK15/E2p7细胞免疫荧光染色。

[0020] 图4为非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗感染PK15/E2p7细胞系后Western blot检测重组病毒接种细胞中CSFV NS3蛋白(A)和JEV E蛋白(B)的表达。图4A和4B中，第1列为感染双价疫苗种毒的PK15/E2p7细胞裂解组分；第2列为未感染病毒的PK15/E2p7细胞裂解组分。

[0021] 图5为非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种诱导小鼠产生的血清JEV特异性IgG(A)、JEV中和抗体(B)和抗JEV强毒株致死攻击的保护效力(C)。

[0022] 图6为非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种诱导猪体抗CSFV强毒株致死攻毒的免疫保护效力：

[0023] (A).为CSFV石门强毒株攻毒感染后猪体血清特异性E2IgG抗体水平：由图可知，经本发明所构建的疫苗免疫接种猪在CSFV强毒攻击感染后，第3天出现特异性IgG抗体应答；从第3-21天特异性IgG水平逐渐升高；未进行疫苗免疫接种的对照猪无CSFV特异性抗体应答，直至实验猪死亡；

[0024] (B).为CSFV石门强毒株攻毒感染后猪体白细胞数量变化：由图可知，经本发明所构建的疫苗免疫接种猪在CSFV强毒攻击感染后白细胞数量保持在6-16×109/L水平以上；非免疫接种对照组猪体白细胞总数均显著低于疫苗免疫组，并持续降低，直至实验猪死亡；

[0025] (C).为疫苗接种猪和对照实验猪体CSFV强毒致死攻击后温变化曲线。由图可知，非免疫接种对照组猪攻毒感染后平均体温于第3天开始升高超过40℃，在第4天全部超过41℃，并持续到所有猪死亡。疫苗免疫接种猪平均体温只有2天轻微升高(40.3和40.1)，然后恢复正常，所有疫苗接种猪存活。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照Sambrook等《分子克隆，实验手册》第三版(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001，下同)中所述的条件。

[0027] 具体实施例描述的方法步骤，本领域的普通技术人员不需付出创造性劳动均能顺利实施。所涉及的细胞系、抗猪瘟和乙脑双价疫苗嵌合缺失突变体感染性cDNA克隆和双价疫苗病毒株都可提供给本发明实施者。

[0028] 实施例1非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗制备方法[0029] 1.引物的设计合成

[0030] 根据CSFV石门株全长基因组序列(Genbank No.AF092448)、JEV E蛋白编码序列(GenBank No.AB510530.1)、FMDV 2A编码序列(GenBank No.M95781.1)和泛素蛋白Ubi序列(GenBank No.XM_002344708.1)，设计合成各种RT-PCR或PCR扩增引物。各引物由Invitrogen公司合成。

[0031] 各引物序列和编号如下：

[0032] 1).E2上游片段(770-2440nt)PCR扩增引物

[0033] 上游引物P1(SEQ ID NO.1)：5′-GTGTGCATCGATGGTTGCATACTGC-3′[0034] 下游引物P2(SEQ ID NO.2)：

[0035] 5′-CCAATGGTAAGCCTTGTGCCCCAGTTACTAGTAGC-3′

[0036] (扩增产物5′端含有ClaI位点)

[0037] 2).E2下游片段(3560-4461nt)PCR扩增引物

[0038] 上游引物P3(SEQ ID NO.3)

[0039] 5′-GGCACAAGGCTTACCATTGGGCCAGGGTGAGGTAG-3′

[0040] (引物P2，P3含有重叠区域，见下划线序列)

[0041] 下游引物P 4(SEQ ID NO.4)：5′-GGCAACATGGTACCTGTTATTGAAC-3′[0042] (扩增产物3′端含有KpnI位点)

[0043] 3).5′非编码区及含Npro前63个核苷酸的PCR扩增引物

[0044] 上游引物P5(SEQ ID NO.5)

[0045] 5′-AAGTGCCACCTGACGTCGACAGATC-3′

[0046] 下游引物P6(SEQ ID NO.6)

[0047] 5′-GGTTGTGCCTTTCTCCACTCCCATTGG-3′

[0048] (扩增产物5′端含有SalI位点)

[0049] 4).JEV E蛋白抗原表位编码核苷酸(E蛋白第292-402氨基酸)(GenbankNo.AF092448)

[0050] 的PCR扩增引物

[0051] 上游引物P7(SEQ ID NO.7)

[0052] 5′-GTGGAGGACAAACTGGCTCTGAAAGGC-3′

[0053] 下游引物P8(SEQ ID NO.8)

[0054] 5′-CTTGAGAAGGTCAAAGCGTGCTTCCAGCTTTG-3′

[0055] 5).2AUbi片段的PCR扩增引物

[0056] 上游引物P9(SEQ ID NO.9)

[0057] 5′-CTTTGACCTTCTCAAGAACTTTGACCTTCTC-3′

[0058] 下游引物P10(SEQ ID NO.10)

[0059] 5′-ATGATTCAACTCCATTCCACCGCGGAG-3′

[0060] 6).CSFV Npro蛋白N端编码区(位于基因组第374-796nt)PCR扩增引物[0061] 上游引物P11(SEQ ID NO.11)：5′-GGAATGGAGTTGAATCATTTTGAAC-3′[0062] 下游引物P12(SEQ ID NO.12)：5′-CAGCAGTATGCAACCATCGATGC-3′[0063] (下游3′端引入ClaI位点便于cDNA克隆操作)

[0064] 2.JEV基因组RNA提取及cDNA合成

[0065] 取JEV感染的乳鼠脑组织，切成小块，低温条件下研磨，用总RNA提取试剂盒(一步法总RNA抽提试剂盒，BSC51S1，上海华舜生物工程有限公司产品)，按试剂盒操作说明书介绍的步骤提取总RNA(包括JEV基因组RNA)。将提取的RNA溶于17μl DEPC处理过的水中，加入1μl JEV E基因逆转录引物(即E基因片段下游PCR扩增引物，SEQ ID NO.8)，85℃，5min，迅速置冰浴5min，加入逆转录混合液：5×逆转录酶缓冲液(RT Buffer)5μl，dNTPs(10μM)0.5μl，RNsin 0.5μl，M-MLV 1μl。在PCR热循环仪上进行以下反应：
42℃60min，95℃变性5min，置冰浴，获得JEV cDNA模板，-70℃冻存备用。

[0066] 3.PCR扩增

[0067] 以CSFV石门株感染性cDNA克隆质粒pT7SM(病毒学报，2005，43-47)为模板，PCR分别扩增E2基因两端序列及含有重叠序列的目的片段，各目的片段的构成、扩增反应体系和具体反应条件如下：

[0068] 1).E2上游1671bp编码序列(位于CSFV基因组中770-2440nt)扩增：

[0069] CSFV cDNA模板(pT7SM) 1μl

[0070] P1(10μM) 2μl

[0071] P2(10μM) 2μl

[0072] dNTP(10μM) 2μl

[0073] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0074] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0075] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0076] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃120Sec进行30个循环。

[0077] 所用PCR试剂包括单核苷酸混合物dNTPs、10×PCR缓冲液和pfu DNA聚合酶，均为Songon生物工程有限公司产品，下同。

[0078] 2).E2下游902bp编码序列(位于CSFV基因组中位置第3560-4461nt)扩增：

[0079] cDNA模板(pT7SM) 1μl

[0080] P3(10μM) 2μl

[0081] P4(10μM) 2μl

[0082] dNTP(10μM) 2μl

[0083] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0084] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0085] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0086] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃60Sec进行30个循环。

[0087] 3).5′非编码区及含Npro前63个核苷酸序列的PCR扩增：

[0088] cDNA模板(pT7SM) 1μl

[0089] P5(10μM) 2μl

[0090] P6(10μM) 2μl

[0091] dNTP(10μM) 2μl

[0092] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0093] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0094] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0095] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃30Sec进行30个循环。

[0096] 4).JEV E蛋白抗原区(第292-402位氨基酸)编码核苷酸的PCR扩增[0097] cDNA模板(步骤2制备的cDNA)1μl

[0098] P7(10μM) 2μl

[0099] P8(10μM) 2μl

[0100] dNTP(10μM) 2μl

[0101] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0102] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0103] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0104] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃30Sec进行30个循环。

[0105] 5).2AUbi片段的PCR扩增

[0106] DNA模板(Invitrogen公司合成的2AUbiDNA) 1μl

[0107] P9(10μM) 2μl

[0108] P10(10μM) 2μl

[0109] dNTP(10μM) 2μl

[0110] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0111] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0112] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0113] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃30Sec进行30个循环。

[0114] 6).CSFV Npro蛋白N端编码区(位于基因组第374-796nt)PCR扩增[0115] cDNA模板(pT7SM) 1μl

[0116] P11(10μM) 2μl

[0117] P12(10μM) 2μl

[0118] dNTP(10μM) 2μl

[0119] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0120] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0121] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0122] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃60Sec进行30个循环。

[0123] 4.回收产物

[0124] 将步骤3扩增获得的各种PCR产物利用DNA纯化体系试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，W5211，上海华舜生物工程有限公司产品)回收纯化PCR产物；分别得到步骤3.1～6)的PCR产物1～6。

[0125] 5.重叠PCR

[0126] 1).缺失E2的E2上、下游相邻序列连接DNA片段的重叠PCR扩增

[0127] 扩增体系和反应条件如下：

[0128] 步骤4回收纯化E2上游序列PCR产物 2μl

[0129] 步骤4回收纯化E2下游序列PCR产物 2μl

[0130] dNTP(10μM) 2μl

[0131] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0132] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0133] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0134] 94℃变性5min，然后94℃30Sec，55℃30Sec，72℃30Sec进行10个循环扩增，然后向反应体系中加入引物P1、P4各2μl，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃120Sec进行30个循环，产物即为缺失E2基因的两侧相邻序列连接DNA融合片段。

[0135] 2).含Npro前63个核苷酸的CSFV 5′端、JEV E蛋白抗原表位、2AUbi基因和NproN端编码区的重叠大片段PCR扩增

[0136] 扩增体系和反应条件如下：

[0137] 步骤4回收纯化的PCR产物3 1μl

[0138] 步骤4回收纯化的PCR产物4 1μl

[0139] 步骤4回收纯化的PCR产物5 1μl

[0140] 步骤4回收纯化的PCR产物6 1μl

[0141] dNTP(10μM) 2μl

[0142] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0143] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0144] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0145] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性5min，然后94℃30Sec，55℃30Sec，72℃30Sec进行10个循环扩增，然后向反应体系中加入引物P5、P12各2μl，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，pro
72℃240Sec进行30个循环，产物即为由CSFV 5′非编码区及含N 前63个核苷酸、乙脑pro
E蛋白部分核苷酸、2AUbi和N 蛋白N端编码区融合构成的DNA片段。

[0146] 6.CSFV E2基因缺失的感染性cDNA克隆质粒p7SMdelE2的构建

[0147] 1).用限制性核酸内切酶ClaI和Kpn1双酶消化步骤5.1)制备的E2基因两侧序列融合片段，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒(W5211，上海华舜生物工程有限公司产品)回收DNA片段(按试剂盒说明书操作)；

[0148] 2).用ClaI和Kpn1双酶消化的CSFV全长感染性cDNA克隆质粒pT7SM，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作)；

[0149] 3).将上述步骤1)和2)回收片段按4∶1摩尔比例混合，取混合物5μl，加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸水至总体积10μl，混合，
4℃连接过夜；

[0150] 4).连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α，挑选阳性重组子克隆，提取质粒DNA，经酶切分析和核苷酸序列测定验证，获得重组质粒p7SMdelE2；

[0151] 7.表达JEV E蛋白抗原表位的CSFV E2基因缺失感染性cDNA克隆重组质粒p7SMdelE2/JEV-ΔE的构建

[0152] 1).将E2基因缺失的重组质粒p7SMdelE2用限制性核酸内切酶SalI和ClaI双酶消化，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作)；

[0153] 2).用SalI和ClaI双酶消化上述步骤5.2)制备的融合DNA片段，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作)；

[0154] 3).将步骤7.1)和7.2)制备的两种经Sal I和Cla I双酶切目的DNA片段和E2缺失的重组质粒p7SMdelE2片段按4∶1比例混合，取混合物5μl，加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸水至总体积10μl，混均，4℃连接过夜；

[0155] 4).连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素抗性的琼脂平板培养，挑选阳性重组子接种LB中培养，DNA抽提纯化试剂盒(Omega公司产品，下同)提取质粒DNA，经酶切分析和核苷酸序列测定验证，获得CSFV E2缺失并嵌合JEV E蛋白抗原表位编码区的感染性cDNA克隆重组质粒p7SMdelE2/JEV-ΔE。

[0156] 8.基因工程双价标记疫苗病毒的拯救

[0157] 1).将感染性cDNA克隆重组质粒p7SM delE2/JEV-ΔE用限制性核酸内切酶SrfI线性化，琼脂糖凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒回收纯化线性化重组质粒DNA(按试剂盒说明书操作)；

[0158] 2).以线性化重组质粒DNA为模板，RNA体外转录试剂盒(Ambion公司产品)体外转录制备RNA(按照试剂盒说明操作)，具体地，按试剂盒说明书操作步骤转录RNA，LiCl沉淀、回收，用无RNase的灭菌双蒸水溶解RNA沉淀，取1μl RNA溶液稀释100倍于紫外分光光度计定量测定RNA，变性琼脂糖凝胶电泳步检测RNA分子完整性，-70℃冻存备用。

[0159] 3).取生长80 ％单层 的PK15/E2p7细胞(见实 施例2)，采 用脂质 体Lipofectamine2000，转染步骤8.2)制备的病毒基因组RNA至PK15/E2p7细胞中(按脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒说明书操作)，转染所用培养液为Opti-MEM(Invitrogen公司产品)。转染6h后，换用含2％胎牛血清的DMEM(DMEM和胎牛血清为Hyclone公司产品，下同)，继续培养72h后，冻融细胞培养物，收集上清病毒液。

[0160] 4).将步骤8.3)收获的病毒液在PK15/E2p7细胞系中传代扩增病毒，获得非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗种毒，分装，-70℃冻存备用。将病毒液按系列倍比稀释接种PK15/E2p7细胞，采用抗-NS3多克隆抗体为一抗，间接免疫荧光染色测定病毒TCID50。

[0161] 实施例2表达CSFV E2p7蛋白的PK15互补细胞系(PK15/E2p7)的构建[0162] 1.表达CSFV E2的真核重组质粒pcDNA3.1/E2p7的构建

[0163] 1).引物设计：根据CSFV石门株全基因组序列(Genbank No.AF092448)，设计一对扩增E2p7基因引物，引物由Invitrogen公司合成。

[0164] 上游引物P13(SEQ ID NO.13)：

[0165] 5′-CGGGATCCAGAAATGGCCGCATCAACCACGGCATTC-3′(引入BamHI酶切位点)[0166] 下游引物P14(SEQ ID NO.14)：

[0167] 5′-CGGAATTCCCTAAACCATGAGCAATGCCACTGT-3′(引入EcoRI酶切位点)[0168] 2).以CSFV石门株感染性cDNA克隆质粒pT7SM为模板，PCR扩增E2p7基因序列片段，扩增体系和反应条件如下：

[0169] E2p7(CSFV基因组中第2341-3751nt)编码序列扩增：

[0170] cDNA模板(pT7SM) 1μl

[0171] P13(10μM) 2μl

[0172] 10

[0173] P14(10μM) 2μl

[0174] dNTP(10μM) 2μl

[0175] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0176] pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

[0177] 灭菌双蒸水 9.5μl

[0178] 用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行扩增反应：94℃变性3min，再94℃30Sec，55℃30Sec，72℃120Sec进行30个循环。

[0179] 3).取步骤2)扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒(W5211，上海华舜生物工程有限公司产品)回收E2p7基因cDNA片段(按试剂盒说明书操作)。

[0180] 4).取真核表达载体质粒pcDNA3.1+(Invotrigen公司产品)，用BamHI和EcoRI双酶消化，琼脂糖凝胶电泳分离，DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作)；

[0181] 5).构建表达E2p7的真核重组质粒，将回收的E2p7基因酶切片段和pcDNA3.1+载体酶切片段按4∶1比例混合，取混合物5μl，加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸水至总体积10μl，混合，4℃连接过夜；

[0182] 6).将步骤5)的连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α，涂布含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上培养，挑取插入E2p7基因的阳性重组子克隆于LB中培养，DNA抽提纯化试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定和核苷酸测序验证，获得真核表达质粒pcDNA3.1/E2p7。

[0183] 2.表达E2p7的PK15细胞系PK15/E2p7的构建

[0184] 1).将PK15细胞传至6孔细胞培养板(Corning公司产品，下同)，置于5％CO237℃培养，待细胞生长至80％单层时，采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000，将pcDNA3.1/E2p7转染PK15细胞(按Lipofectamine2000说明书操作)，所用培养液为Opti-MEM。转染6h后，换成含2％胎牛血清的DMEM，5％CO237℃继续培养。

[0185] 2).pcDNA3.1/E2p7转染PK15细胞后，2％胎牛血清的DMEM培养36h，换成含G418(700μg/ml)和5％胎牛血清的新鲜DMEM继续培养。每4-5天更换一次含G418和胎牛血清的新鲜DMEM直到形成细胞克隆。

[0186] 3).待细胞克隆形成后，0.25％胰酶消化，挑取数个细胞克隆接种在24孔细胞板(Corning公司产品，下同)培养，形成细胞单层后，采用有限稀释法将细胞传至96孔板各孔中，继续用含G418(700μg/ml)和5％胎牛血清的新鲜DMEM培养，待长满单层之后逐渐扩大培养。

[0187] 3.PK15/E2p7胞系的鉴定

[0188] 1).待G418筛选的细胞培养扩大后，传代至6孔板中培养至胞形成单层，用CSFVE2单克隆抗体(F48-3-10 Tubingen，Germany)为一抗免疫荧光染色，倒置荧光显微镜下观察结果表明，在PK15/E2p7细胞系中可见E2p7蛋白的表达(图2A、B)。

[0189] 2).CSFV E2单克隆抗体(F48-3-10)为一抗Western blot检测分析，结果表明，在PK15/E2p7细胞系中能观察到E2p7蛋白的表达(图2C)。

[0190] 3).用不含G418的5％胎牛血清新鲜DMEM培养基传代培养PK15/E2p7细胞，取各代次细胞免疫荧光染色和Western blot检测，评价PK15/E2p7细胞系的稳定性。

[0191] 4).将能稳定表达E2p7的PK15细胞克隆扩大培养，冻存于液氮中备用。

[0192] 实施例3非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗的功能检测[0193] 1.间接免疫荧光检测PK15/E2p7细胞中重组病毒的增殖特性

[0194] 取基因工程双价疫苗重组病毒接种PK15/E2p7细胞，5％CO237℃培养72h，细胞用预冷的甲醛丙酮(1∶1)-20℃固定处理1h，PBS洗涤3-5次，加入抗-NS3兔血清(一抗，由本实验室制备与保存，1∶1000稀释)，37℃孵育1h，PBS洗涤3-5次，加入FITC标记的羊抗兔IgG(Pierce公司产品，1∶500稀释)，室温避光孵育1h，PBS洗涤，置于倒置荧光显微镜下观察。结果显示：重组病毒接种的PK15/E2p7细胞与抗-NS3多克隆抗体反应，呈绿色荧光(图3A)。未接种重组病毒的PK15/E2p7细胞不与抗-NS3多克隆抗体反应，无荧光(图3B)。

[0195] 2.Western blot检测双价疫苗重组病毒在PK15/E2p7细胞中表达CSFV NS3蛋白和JEV E抗原蛋白

[0196] 取基因工程双价疫苗重组病毒接种PK15/E2p7细胞，5％CO237℃培养72h，分别收获细胞培养上清和细胞裂解物，以抗-NS3兔血清(或抗-E兔血清)为一抗，HRP标记羊抗兔IgG为二抗，Western blot分析NS3蛋白(或JEV E蛋白)的表达。如图4所示，重组病毒在PK15/E2p7细胞系上增殖，能有效表达CSFVNS3蛋白(4B)和JEVE蛋白(4C)。

[0197] Western blot检测双价疫苗重组病毒在PK15/E2p7细胞中表达CSFV NS3蛋白和JEV E抗原蛋白的具体步骤如下：

[0198] (1)样品处理 取双价疫苗重组病毒接种80％单层PK15/E2p7细胞(T25细胞瓶)，加入2％胎牛血清的DMEM，5％CO237℃培养72h，分别收获细胞培养上清(5ml)和细胞，上清液真空冻干，加入200μl PBS溶解。用细胞刮收集细胞，200μl PBS重悬细胞。取上述200μl细胞重悬液和200μl上清冻干粉溶解液，分别加入等体积样品缓冲液(Loading buffer)混匀，水浴煮沸5min，冷却备用。

[0199] (2)制胶 按下列各组分依次混合，配制分离胶和浓缩胶

[0200] 分离胶(10％)

[0201] 1.5mol/L Tris(pH8.0) 1.3ml

[0202] 30％丙烯酰胺 2ml

[0203] ddH2O 1.6ml

[0204] 10％AP 0.05ml

[0205] 10％SDS 0.05ml

[0206] TEMED 2μl

[0207] 浓缩胶(5％)

[0208] 1.5mol/L Tris(pH6.8) 0.25ml

[0209] 30％丙烯酰胺 0.33ml

[0210] ddH2O 1.4ml

[0211] 10％AP 0.02ml

[0212] 10％SDS 0.02ml

[0213] TEMED 2μl

[0214] 将配制的分离胶溶液灌入电泳槽平板中，胶面至平板顶端距离保留约1.5cm，缓缓加入1ml双蒸水压封胶层表面，室温静置待胶体凝固，吸出双蒸水，灌入浓缩胶(灌注前新鲜配制)，室温静置待胶体凝固备用。

[0215] (3)上样 将处理好的蛋白样品，根据预先测定蛋白的浓度取30μl样品加入浓缩胶样品槽中，确保各样品槽中蛋白质加样量相等。

[0216] (4)电泳 50V电泳30min，调电压至100V继续电泳至溴酚蓝距底线0.5cm处，关掉电源，取出凝胶，双蒸水洗涤。

[0217] (5)转膜 取NC膜和滤纸置入转膜缓冲液(transfer buffer)中浸泡5min，按“阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极”顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，调电压至88V，低温(4℃)条件下电转膜3h。

[0218] (6)封闭 将NC膜用1×PBST洗涤3-5次，加入含5％脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液(blocking buffer)，37℃，孵育2h。

[0219] (7)与一抗反应用PBST洗涤NC膜3次，每次5min。加入一抗(兔抗CSFVNS3多克隆抗体或兔抗JEVE蛋白多克隆抗体，PBST进行1∶1000稀释)，37℃孵育1h。

[0220] (8)与二抗反应PBST洗涤NC膜3次，每次5min。加入HRP标记羊抗兔第二抗抗体(31460，Pierce公司产品，用PBST进行1∶2500稀释)，37℃孵育1h。

[0221] (9)显色PBST洗涤NC膜3次，每次5min。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)，室温避光显色5-10min，双蒸水洗涤NC膜，观察结果(见图3)。

[0222] 实施例4小鼠模型检测非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗抗JEV的保护效力

[0223] 1.小鼠免疫接种

[0224] 取6-8周龄健康一致雌性BALB/c小鼠45只，随机分成三组，每组15只，分别为双价疫苗接种实验组、乙型脑炎疫苗接种阳性对照组和非疫苗接种阴性对照组。

[0225] 采用腹膜内注射方法免疫小鼠。免疫剂量如下：

[0226] 双价疫苗接种实验组：接种剂量为1×105TCID50的双价疫苗病毒液150μl；乙型脑炎疫苗接种阳性对照组：接种剂量为按说明书介绍的1∶50稀释的兽用乙脑灭活疫苗接种150μl；非疫苗接种阴性对照组：腹膜内注射相同体积(150μl)灭菌PBS。

[0227] 各组小鼠均免疫三次，每次间隔两周。

[0228] 2.小鼠攻毒试验

[0229] 最后一次免疫14天后，小鼠尾静脉取血，分离血清，用于血清IgG及中和抗体效价6
检测。然后，小鼠用3×10PFU(50LD50)剂量的JEV北京强毒株(P3株)(即乙型脑炎京卫研P3株，来自中国药品和生物制品检定所)采用腹膜接种途径进行攻毒感染，攻毒后每天测量记录小鼠体重变化和观察小鼠病死情况。

[0230] 3.疫苗诱导小鼠体液免疫应答的检测

[0231] 1).间接ELISA检测小鼠血清抗JEV抗体效价

[0232] (1)包被：取感染JEV的BHK-21细胞裂解病毒液，加终浓度至0.05％甲醛灭活，7
用包被缓冲液(0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至病毒滴度为1×10PFU，加到96孔ELISA板(Corning公司产品，下同)各孔中(100μl)，4℃包被过夜；

[0233] (2)封闭：包被病毒抗原的ELISA酶标板用PBST洗涤3-5次，吸水纸吸干。加含3％BSA的PBST至ELISA板各孔中(300μl/孔)，37℃孵育60min，PBST洗涤3-5次。

[0234] (3)加待检血清：待检小鼠血清用含1％BSA的PBST作1∶100稀释，稀释血清加入ELISA板各孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h，PBST充分洗涤5-6次。

[0235] (4)加酶标二抗：酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG抗体(31432，Pierce公司产品)，用含1％BSA的PBST作1∶5000稀释，加入ELISA板各孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h，PBST充分洗涤5-6次。

[0236] (5)加底物溶液：向ELISA酶标板每孔加入100μl底物显色液，37℃避光反应10min，用2M的H2SO4终止反应，20min内测定OD492值。

[0237] (6)OD492值的测定：用自动酶标测定仪在波长492nm处，测定每孔内光密度吸收值(OD492值)。每份样品平行做2孔，计算平均值。

[0238] 结果如图5A所示，用非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种，能诱导小鼠产生高效价抗JEV特异性IgG抗体。

[0239] 2).中和抗体检测方法

[0240] (1)取2×106细胞/ml浓度的BHK-21细胞悬液，接种到96孔平底微量细胞培养板各孔中(100μl/孔)；加入含2％胎牛血清的DMEM，5％CO237℃培养至形成70％-80％细胞单层；

[0241] (2)将待检测血清56℃灭活30min，用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释；将稀释后的血清样品与含100PFU/0.1mL的乙脑病毒(P3株)悬液等体积混合，置37℃孵育1-2h；

[0242] (3)用无血清DMEM培养液洗涤BHK-21细胞单层，加入血清/病毒混合液(100μl/孔)，37℃孵育1h，吸出血清/病毒混合液，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，37℃继续培养48-72h；

[0243] (4)吸弃细胞培养上清，PBS洗涤细胞3-5次，用预冷的甲醛丙酮(1∶1)(100μl/孔)，-20℃固定1h，PBS洗涤3-5次，加入1％结晶紫，室温(25℃)染色1h，双蒸水冲洗，加入中性红复染30min；冲洗、晾干后计数空斑；

[0244] (5)血清中和抗体效价判定：将能中和JEV感染的血清最高稀释倍数判定为血清中和效价。

[0245] 结果如图5B所示，用非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种，能诱导小鼠产生针对JEV的特异性中和抗体。

[0246] 4.非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗诱导小鼠抗JEV强毒(P3株)致死感染的保护

[0247] JEV强毒株攻毒感染结果显示，实验组小鼠在8天内全部死亡，乙脑灭活疫苗阳性对照组和阴性对照组的小鼠均有约80％的存活，表明表达JEV E蛋白抗原的重组双价减毒活疫苗接种，能诱导与乙脑全病毒灭活疫苗相似的抵抗乙型脑炎强毒株致死攻击感染的保护效力(图5C)。

[0248] 实施例5非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种诱导猪体抗CSFV的免疫效力检测

[0249] 1.猪体免疫接种

[0250] 选取未接种猪瘟和乙脑疫苗、经ELISA检测CSFV和JEV血清抗体阴性的健康2月龄仔猪，随机分成两组，分别用于双价疫苗接种实验组和非疫苗接种阴性对照组。

[0251] 具体地，取新生未接种猪瘟和乙脑疫苗的4周龄健康仔猪，前腔静脉采血，分离血清，ELISA检测CSFV E2抗体和JEV E抗体。选取两种病毒抗体阴性仔猪8头随机分成两组，分栏饲养，至8周龄再次采血检测血清抗体，抗体阴性的健康仔猪用于实验研究。

[0252] 疫苗接种实验组：经皮下多点注射和口鼻滴注联合途径免疫接种，皮下接种剂6 6
量为2×10TCID50/2ml，每点约200μL；口鼻滴注剂量为8×10TCID50/10m，总免疫量约
7
1×10TCID50/12ml。

[0253] 非疫苗接种阴性对照组：采用与实验组相同途径和剂量的PBS接种猪体。

[0254] 疫苗接种后，每天测量疫苗接种组和非疫苗接种对照组猪体温，并观察实验猪的临床症状。

[0255] 2.猪体攻毒试验

[0256] 猪体免疫接种23天后，以1×105.5TCID50的CSFV石门强毒株病毒液，采用滴鼻途径攻毒感染，于攻毒感染后每天测量各头猪体温变化、记录猪发病临床症状和死亡数；分别于攻毒后第0、3、7、16和21天前腔静脉采血，一部分血液加入到含有EDTA抗凝剂的血液收集管中，用于白细胞和血小板计数(血细胞自动计数仪：SysmexKX-21N，日本)；一部分血液置于不加抗凝剂无菌试管中分离血清，用于检测血清抗CSFV E2IgG抗体以及CSFV中和抗体效价。

[0257] 1).间接ELISA检测猪血清IgG抗体效价

[0258] 实验操作与实施例4中步骤1.2)相同，只是待检测血清为猪血清；二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体(BSE0305R，北京博奥森生物技术有限公司产品)。实验结果与图6A所示，CSFV攻毒感染后第3天开始，猪血清特异性IgG持续升高。

[0259] 2).中和抗体检测

[0260] (1)按2×106细胞/ml浓度接种PK15细胞悬液于平底微量96孔培养板中(100μl/孔)；5％CO237℃培养至形成70％～80％细胞单层；

[0261] (2)将待检测猪血清于56℃灭活30min，用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释；将稀释的待检血清与含100TCID50/0.1mL的CSFV病毒液等体积混合，置37℃孵育1-2h；

[0262] (3)用无血清DMEM洗涤PK15单层细胞，加入血清/病毒混合液(100μl/孔)，37℃孵育1h，吸去血清/病毒混合液，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，5％CO2、37℃继续培养48-72h；

[0263] (4)取出细胞培养板，按实施2步骤3所述的间接免疫荧光法检测血清的病毒中和效价(每份血清样品重复2次实验)。具体地，将接种血清/病毒混合液后培养48-72h的PK15细胞，用PBS洗涤3次，预冷的甲醛丙酮(1∶1)-20℃固定1h，依次以兔抗CSFV NS3为一抗(1∶1000稀释)、羊抗兔IgG-FITC为二抗(1∶200稀释)免疫荧光染色，在Olympus倒置荧光显微镜下观察结果。

[0264] (5)中和抗体效价判定：以能中和CSFV感染性的血清最高稀释倍数(无荧光染色反应)作为血清的中和效价。

[0265] 结果如表1所示，CSFV强毒株攻毒感染后第3天开始，疫苗接种猪CSFV中和抗体效价持续升高，非疫苗接种阴性对照组猪均检测不到中和抗体产生。

[0266] 表1非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗

[0267] 接种猪和对照实验猪体CSFV强毒致死攻击后血清中和抗体效价

[0268]

[0269] 3).疫苗接种诱导猪体抗CSFV强毒致死攻击的免疫保护

[0270] 实验猪用CSFV强毒攻击感染后观察结果显示(表2和图6C)，非疫苗接种阴性对照组实验猪攻毒后，平均体温于第3天开始升高超过40℃，第4天全部4头猪体温超过41℃，并持续到所有猪死亡。本发明所述的疫苗免疫接种猪平均体温只有2天轻微升高(40.3和40.1)，然后恢复正常，所有疫苗接种猪存活。

[0271] 表2非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗

[0272] 接种猪和对照实验猪体CSFV强毒致死攻击后体温升高和存活情况[0273]

[0274] 作为猪瘟临床病理特征的指标之一是白血病减少。白细胞计数结果如图6B所示，本发明所述的疫苗免疫接种猪在CSFV强毒攻击感染后白细胞数量保持在6-16×109/L水平以上。非免疫接种对照猪白细胞总数在每次计数时均显著低于疫苗免疫猪，并持续降低，直至实验猪死亡。

[0275] 实施例6血清CSFV E2抗体检测ELISA方法建立及其应用

[0276] 1.CSFV E2蛋白包被抗原制备

[0277] 1).原核表达质粒pMAL-p2X-E2(本实验室构建保存)转化CaCl2制备的大肠杆菌E coli BL21-codonplus(DE3)-RIL感受态细胞，挑取阳性克隆接种到氨苄青霉素和氯霉素的LB中，37℃、200rpm振摇过夜培养；

[0278] 2).取过夜培养物0.1ml接种于10ml(1∶100比例)含氨苄青霉素和氯霉素的LB中，37℃、200rpm振摇培养至OD600为0.6-0.8，加入1mmol/L IPTG诱导5h；

[0279] 3).取IPTG诱导培养物，离心分离菌体，SDS-PAGE电泳分析目的蛋白质表达；按照Sambrook等《分子克隆，实验手册》介绍的步骤操作。

[0280] 4).可溶性表达的MBP-E2蛋白，采用Amylose介质(New England公司产品)进行亲和层析柱层析纯化。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

[0281] 5).SDS-PAGE和Western blot分析MBP-E2蛋白的纯度和特异性；

[0282] 6).参照Bradford方法测定蛋白浓度，以BSA为标准蛋白绘制标准曲线，对MBP-E2蛋白进行定量测定后，分装保存-70℃备用。

[0283] 2.ELISA检测方法建立

[0284] 1).试剂的配制：

[0285] (1)ELISA包被缓冲液(0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液)

[0286] Na2CO3 1.59g

[0287] NaHCO3 2.93g

[0288] 加水至1L，调pH值至9.6，4℃冰箱保存

[0289] (2)ELISA洗涤液(PBST)：

[0290] NaCl 8g

[0291] Na2HPO4 1.44g

[0292] KCl 0.2g

[0293] KH2PO4 0.24g

[0294] 加水至1L，使用时加Tween-20终浓度0.05％。

[0295] (3)磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0，1L)

[0296] Na2HPO4.12H2O 71.6g

[0297] 柠檬酸 21g

[0298] 加水定容至1L，4℃冰箱保存

[0299] (4)显色液(100ml)

[0300] 邻苯二胺 40mg

[0301] 30％H2O2 150μl

[0302] 磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0) 100ml

[0303] 新鲜配制。

[0304] 2).血清E2抗体的ELISA检测方法

[0305] (1)包被：用ELISA包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的E2蛋白抗原至终浓度5μg/ml，加到ELISA酶标板的各孔中(100μl/孔)，4℃包被过夜；

[0306] (2)封闭：取出包被了E2抗原的ELISA酶标板，用PBST洗涤3-5次，吸水纸吸干。加3％BSA封闭液至各孔中(300μl/孔)，37℃孵育60min，用PBST洗涤3-5次，吸水纸吸干。

[0307] (3)加待检血清：取待检测猪血清用含1％BSA的PBST按1∶200稀释，加到ELISA酶标板各孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h，PBST洗涤5-6次。

[0308] (4)加酶标二抗：用含1％BSA的PBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG抗体(BSE0305R，北京博奥森生物技术有限公司产品，1∶3000稀释)，加到ELISA酶标板各孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h，PBST洗涤5-6次。

[0309] (5)加底物显色溶液：向ELISA酶标板每孔中加入100μl底物显色液，37℃避光显色10min，用2M的H2SO4终止反应，20min内测定OD492值。

[0310] (6)OD492值测定：用自动酶标测定仪在波长492nm处，测定每孔内光密度吸收值(OD492值)。每份样品平行做2孔，计算平均值。