次血红素的纯化方法

摘要

本发明提供了一种纯化次血红素的方法，包含(1)将次血红素粗品溶解于一种或多种第一溶剂中，向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，并收集沉淀物，(2)将获得的沉淀物溶解于一种或多种第一溶剂中，并向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，再次收集沉淀物。本发明还提供了一种由本发明的纯化方法获得的次血红素。

权利要求

1.一种纯化次血红素的方法，包含：

(1)将次血红素粗品溶解于一种或多种第一溶剂中，向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，并收集沉淀物，和(2)将获得的沉淀物溶解于一种或多种第一溶剂中，向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，并再次收集沉淀物。

2.权利要求1的方法，其特征在于，所述步骤(2)进行至少2次，优选进行2-4次。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于，各步骤中使用的第一溶剂彼此之间相同或不同，各步骤中使用的第二溶剂在彼此之间相同或不同。

4.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述第一溶剂选自稀碱、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮和它们的合适混合物。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述第二溶剂选自稀酸、水、醚类、丙酮、六碳以下的醇类、酯类、卤代烃和它们的合适混合物。

6.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述第一溶剂为稀碱且所述第二溶剂为稀酸。

7.权利要求4的方法，其特征在于，所述稀碱的浓度范围为0.01％-35％；优选地，所述稀碱的浓度范围为0.05％-20％；再优选地，所述稀碱的浓度范围为0.1％-10％；更优选地，所述稀碱的浓度范围为0.1％-3％；再更优选地，所述稀碱的浓度范围为1％-3％。

8.权利要求5的方法，其特征在于，所述稀酸的浓度范围为3％-20％；优选地，所述稀酸的浓度范围为5％-10％。

9.一种由前述权利要求任一项的方法获得的次血红素。

10.权利要求9的次血红素，其特征在于，所述次血红素的纯度至少为90％。

说明书

次血红素的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种纯化次血红素的方法，还涉及由该方法纯化得到的次血红素。

背景技术

[0002] 次血红素(Deuterohemin)系血红素(Heme，Hame，Protoheme)的同系物。它具有与血红素相类似的生物学功能，可作为一些具有生物催化作用的酶类如过氧化氢酶、过氧化物酶和细胞色素酶等的辅基。在例如人工合成过氧化物酶模拟物时，由于血红素上的乙烯基很容易被过氧化物氧化，使得血红素自身对过氧化物不稳定。因此，在设计过氧化物酶的模拟物时必须消除血红素辅基的这种不稳定性。已有报道，利用间苯二酚通过C-烷基化反应可使H取代血红素上的乙烯基从而形成次血红素(刘亚丽等，亚血红素的合成和纯化方法的改进，吉林大学自然科学学报，2001年1月，第91-92页)。由于次血红素自身稳定，含该次血红素辅基的酶模拟物的应用消除了含血红素辅基的酶对过氧化物的不稳定性。

[0003] 次血红素是一种三价铁卟吩衍生物，其化学名称为3，7，12，17-四甲基-21H，23H-卟+ -吩-2，18-二丙酸氯化铁，分子式为[C30H28FeN4O4]Cl，分子量为599.88，结构式如下所示[0004]

[0005] 据报道，已有的次血红素分离纯化工艺通常采用柱层析技术，例如聚酰胺载体的柱层析、硅胶柱层析技术(刘亚丽等，见上文)。但将层析技术应用于次血红素的分离纯化时往往存在一些不足，例如，层析载体的使用量大，通常需使用有毒的洗脱溶剂，例如苯等。以刘亚丽等人(见上文)的硅胶柱层析纯化方法为例，每分离纯化1克次血红素粗品就需要载体硅胶2400克，可纯化出的纯品次血红素为0.4克，收率约为40％。按此比例计算，制备1000克次血红素纯品，就需要柱层析硅胶6000千克(6吨)。若层析载体与洗脱溶剂的用量比例按1∶10计算，制备上述产量的次血红素需要60吨洗脱溶剂。因此，以层析技术进行次血红素纯化的现有方法不适于大规模的低成本工业化生产。

[0006] 因此，仍需要寻求一种简便、快速且易于规模化生产的次血红素纯化方法。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种纯化次血红素的方法，所述方法包含：

[0008] (1)将次血红素粗品溶解于一种或多种第一溶剂中，向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，并收集沉淀物，和

[0009] (2)将获得的沉淀物溶解于一种或多种第一溶剂中，向该溶液中加入一种或多种第二溶剂以产生沉淀，并再次收集沉淀物。

[0010] 本发明的一个方面，在所述方法中，步骤(2)至少进行2次；优选地，所述步骤(2)进行2-4次。

[0011] 本发明还提供一种由本发明的方法纯化获得的次血红素。本发明的次血红素的纯度可达90％以上，优选地可达95％以上。

[0012] 本发明的纯化工艺简便，无需特别设备和层析载体(例如聚酰胺、硅胶等)，也避免使用大量有毒溶剂，对环境不会造成污染。本发明的工艺使得纯化周期大幅缩短，产品纯度可达90％以上，收率可达85％以上，即使在普通实验室也可实现公斤级的次血红素的制备。由此可见，本发明工艺的纯化效率较现有的层析纯化方法有显著提高。

[0013] 因此，本发明为次血红素的生产纯化提供了一种成本低、易于工业化生产的优良工艺。

具体实施方式

[0014] 本申请所公开的化合物、组合物、方法、试剂不限于文中具体所列，它们也可以有多种变化形式。对于本申请具体实施方案、尤其是实施例的描述，旨在帮助对于本发明的理解，而非对本发明范围的限制。

[0015] 本发明所述的次血红素粗品通常为纯度在25％以下的次血红素。所述次血红素粗品可以是化学法制备后未经分离纯化的混合产物。优选地，所述次血红素粗品由化学合成反应制得；更优选地，所述次血红素粗品由血红素与间苯二酚的化学反应制备。

[0016] 本发明所述的第一溶剂是指对次血红素有良好溶解特性的溶剂，其可用的实例包括但不限于：稀碱、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、甲酸、乙酸、丁酸和它们的合适混合物。

[0017] 本发明所述的第二溶剂是指可将溶解于所述第一溶剂中的次血红素沉淀的溶剂。例如，所述第二溶剂可通过改变次血红素所处的溶剂环境的极性或pH值等因素使溶解于第一溶剂中的次血红素发生沉淀。其可用的实例包括但不限于稀酸、水、醚类(例如乙醚、甲基叔丁基醚)、丙酮、六碳以下的醇类(例如甲醇、乙醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、卤代烃和它们的合适混合物。

[0018] 本发明所述的稀碱的浓度通常为0.01％-35％；优选地，所述稀碱的浓度为0.05％-20％；再优选地，所述稀碱的浓度范围为0.1％-10％；更优选地，所述稀碱浓度为
0.1％-3％；再更优选地，所述稀碱浓度为1％-3％。本发明中可以使用的稀碱例如为氨水、六碳以下脂肪胺的水溶液、金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)、碳酸盐的水溶液(例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等)和它们的合适混合物。

[0019] 本发明所述的稀酸的浓度通常为3％-20％；优选地，所述稀酸的浓度为5％-10％。本发明中可以使用的稀酸例如有稀盐酸、稀硫酸、稀硝酸、六碳以下脂肪酸的水溶液(例如稀甲酸、稀乙酸)和它们的合适混合物。

[0020] 在本发明的一个实施方案中，所述方法包含的各步骤所使用的第一溶剂彼此之间可以相同或不同，各步骤所使用第二溶剂彼此之间亦可以相同或不同。例如，步骤(1)和步骤(2)所使用的第一溶剂相同，所使用的第二溶剂亦相同；或者步骤(1)和步骤(2)使用的第一溶剂相同，但所使用的第二溶剂不同；或者步骤(1)和步骤(2)使用的第一溶剂不同，但所使用的第二溶剂相同；又或者步骤(1)和步骤(2)使用的第一溶剂和第二溶剂均不相同。上述例举的溶剂使用情形亦适用于包含多次进行步骤(2)的实施方案中，也就是说，各次进行的步骤(2)中所使用的第一溶剂彼此可以相同，也可以不同，所使用的第二溶剂彼此之间亦可相同或不同。例如，在步骤(1)中使用吡啶作为第一溶剂，水作为第二溶剂；在步骤(2)中仍可以使用吡啶作为第一溶剂，水作为第二溶剂，或者也可以使用其他第一溶剂例如二甲基甲酰胺等，其他第二溶剂例如乙醇等；在进一步进行的步骤(2)中，亦可使用吡啶作为第一溶剂，水作第二溶剂，或者使用其他的第一溶剂例如N-甲基吡咯烷酮等，其他的第二溶剂例如乙醇等。

[0021] 在本发明方法的一个实施方案中，所述步骤(1)和/或(2)中所述第一溶剂为稀碱且所述第二溶剂为稀酸。在本发明方法的另一个实施方案中，步骤(1)和/或(2)中所述第一溶剂不为稀碱，且所述第二溶剂不为稀酸。在本发明方法的又一个实施方案中，所述步骤(1)中所述第一溶剂为稀碱且所述第二溶剂为稀酸，并且所述步骤(2)中所述第一溶剂不为稀酸且所述第二溶剂不为稀碱。在本发明方法的另一个实施方案中，所述步骤(1)的第一溶剂不为稀碱且第二溶剂不为稀酸，并且所述步骤(2)的第一溶剂为稀碱且第二溶剂为稀酸。

[0022] 本申请中提及的“合适混合物”可由本领域技术人员根据其掌握的常规技术知识容易地确定。例如，可以使用二甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合物作为第一溶剂用于溶解次血红素。

[0023] 此外，本申请中述及的浓度百分比均为重量/体积百分比浓度。

[0024] 本发明的方法中通常在沉淀步骤之后还可包含离心所得沉淀的步骤。优选地，在每次沉淀步骤之后都进行离心所得沉淀的步骤。在所述离心步骤之后，还可包含洗涤离心所得沉淀物的步骤，通常可用合适的醚(例如乙醚)、醇、酯、丙酮或水等洗涤。

[0025] 本发明的方法通常还可包含将最后一次沉淀步骤所得的产物进行干燥的步骤。所述干燥可在60℃-110℃的温度下进行。

[0026] 根据本发明的方法纯化获得的次血红素具有较高纯度，例如达到90％以上，甚至95％以上的纯度。所述纯度的分析方法为本领域技术人员熟知，例如可以采用RP-HPLC方法对纯化的次血红素样品的纯度进行分析。该方法例如可应用如下色谱分离条件进行：

[0027] 检测波长：390nm；色谱柱：C1825μm柱(150mm×4.4mmI.D)；流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸(35∶65∶0.1)；流速：1mL/min。用峰面积归一化法计算次血红素的纯度。

[0028] 下面结合具体的实施例，以示例的方式对本发明进行进一步详细描述。以下实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。

[0029] 实施例

[0030] 次血红素粗品的制备：

[0031] 将100g血红素(购自天津市生命科学应用研究所)与300g间苯二酚置于带有空气冷凝管和搅拌装置的1000ml三口烧瓶中，充分混合后，在油浴中加热至140～150℃，并在该温度下维持约30min，再以约2℃/min的速度梯度升温至180～190℃并在该温度下维持15min。撤去油浴，自然冷却至约100℃制得次血红素粗品混合物(即含所有反应物的混合物)。

[0032] 次血红素的纯化：

[0033] 将制得的400克次血红素粗品混合物加入10～30L 0.1％～10％的稀碱溶液中，经10～20分钟充分搅拌温热使其溶解。再向稀碱溶液中加入3％～10％的稀酸，将溶液的pH值调至中性。水溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降、倾出大部分上清液后，将下层离心，除去母液。沉淀物用乙醚洗涤(1000ml×4)至乙醚洗涤液无色。再将沉淀用500～1000ml吡啶溶解。向吡啶溶液中加入1000ml乙醇，充分搅拌下再向溶液中加入20～30L 70-90℃蒸馏水使次血红素慢慢从溶液中析出，静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀并收集沉淀物，干燥沉淀获得纯度达90％以上的次血红素。根据需要可对上述收集的沉淀物进一步进行溶解、沉淀、离心并收集沉淀的操作步骤，以获得更高纯度的次血红素。

[0034] 将制得的400克次血红素粗品混合物加入1～3L的吡啶中，经10～20分钟充分搅拌温热使其溶解。再向吡啶溶液中加入20～30L 70-90℃蒸馏水。溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降、倾出大部分上清液后，将下层离心，除去母液。沉淀物用乙醚洗涤(1000ml×4)至乙醚洗涤液无色。再用10～20L 0.1％～10％的稀碱溶液溶解沉淀物。向溶液中加入1000ml乙醇，充分搅拌下再向溶液中加入3％～10％的稀盐酸，将溶液的pH值调至中性。
水溶液出现沉淀。静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀并收集沉淀物，干燥沉淀获得纯度达90％以上的次血红素。根据需要可对上述收集的沉淀物进一步进行溶解、沉淀、离心并收集沉淀的操作步骤，以获得更高纯度的次血红素。

[0035] 将制得的400克次血红素粗品混合物加入1～3L的吡啶中，经10～20分钟充分搅拌温热使其溶解。再向吡啶溶液中加入20～30L 70-90℃蒸馏水。溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降、倾出大部分上清液后，将下层离心除去母液。沉淀物用蒸馏水洗涤(10L×4)至洗涤液无色。再用1L的吡啶溶解沉淀物。充分搅拌下再向溶液中加入20～30L 70-90℃蒸馏水，溶液出现沉淀。静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀并收集沉淀物，干燥沉淀获得纯度达90％以上的次血红素。根据需要可对上述沉淀物进一步进行溶解、沉淀、离心并收集沉淀的操作步骤，以获得更高纯度的次血红素。

[0036] 实施例1

[0037] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克，将其加至20L0.5％的氢氧化钠溶液中，充分搅拌10分钟温热使其溶解。再向该氢氧化钠溶液中加入3％稀盐酸，将溶液的pH值调至中性，并放置自然冷却。溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层溶液除去母液。沉淀物用乙醚洗涤(1000ml×4)至乙醚洗涤液无色。再将沉淀用500ml吡啶溶解。向吡啶溶液中加入1000ml乙醇，充分搅拌下再向溶液中加入30L 60-80℃蒸馏水使次血红素慢慢从溶液中析出，静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀并收集沉淀物。如上所述，将所得沉淀物进一步用500ml吡啶溶液充分溶解，并向吡啶溶液中加入1L乙醇使次血红素充分沉淀，并收集沉淀物。最后将所得沉淀在90℃干燥得到次血红素纯品77.98克。产品收率(即以次血红素的化学反应转化率按
100％计算的次血红素的化学制备和纯化两步的总收率)为85％，纯度为95％。

[0038] 实施例2

[0039] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克，将其加至15L2％的氨水中，充分搅拌10分钟温热使其溶解。再向该氨水溶液中加入5％稀盐酸，将溶液的pH值调至中性。水溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层溶液除去母液。沉淀用水洗，离心后再将沉淀用500ml吡啶溶解。充分搅拌下向溶液中加入30L 50-70℃蒸馏水使次血红素慢慢从溶液中析出，静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀收集沉淀物。如上所述，将所得沉淀进一步用500ml吡啶充分溶解、向溶液中加入
20L 50-70℃蒸馏水使次血红素充分沉淀，最后将所得沉淀在90℃干燥得到次血红素纯品
79.82克。产品收率为87％，纯度为94.5％。

[0040] 实施例3

[0041] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克。将其用1L二甲基甲酰胺在充分搅拌温热条件下溶解。向该溶液中加入乙醇1000ml，在充分搅拌的条件下加入40-60℃蒸馏水20L。放置使其自然冷却，溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层溶液除去母液。沉淀物用乙醚洗涤(1000ml×4)至乙醚洗涤液无色。再将沉淀用15L 3％的碳酸钠溶液温热溶解，向溶液中加入5％稀盐酸，将溶液的PH值调至中性。放置溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层并收集沉淀物。将所得沉淀物用500ml吡啶充分溶解。向该溶液中加入1000ml乙醇，充分搅拌下再向溶液中加入
20L70-90℃蒸馏水使次血红素慢慢从溶液中析出，静置使沉淀自然沉降，倾出大部分上清液后，离心下层沉淀并收集沉淀物。最后将所得沉淀在105℃干燥得到次血红素纯品82.57克。产品收率为90％，纯度为95％。

[0042] 实施例4

[0043] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克。用1L吡啶在充分搅拌温热条件下将其溶解。在充分搅拌的条件下加入50-70℃蒸馏水20L。放置自然冷却，溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层溶液除去母液。沉淀物用乙醚洗涤(1000ml×4)至乙醚洗涤液无色。再将沉淀用15L 1％的氢氧化钾溶液温热溶解，向溶液中加入2％稀硫酸，将溶液的pH值调至中性。放置溶液，出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层并收集沉淀物。如上所述，将沉淀进一步进行用1L吡啶溶解、充分搅拌下加入50-70℃蒸馏水20L使次血红素充分沉淀并离心收集沉淀的操作步骤2次，最后将所得沉淀在95℃干燥得到次血红素纯品83.49克。产品收率为91％，纯度为95.2％。

[0044] 实施例5

[0045] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克，将其倒入15L7％的氢氧化钠溶液中，充分搅拌10分钟温热使其溶解。再向该氢氧化钠溶液中加入10％稀盐酸，将溶液的pH值调至中性。放置溶液使其自然冷却。水溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层溶液除去母液。沉淀用1L的二甲基甲酰胺温热溶解，强烈搅拌下向溶液中加入30-50℃蒸馏水20L，放置自然冷却，溶液出现沉淀。静置使沉淀沉降，倾出大部分上清液后，离心下层除去母液。沉淀用蒸馏水洗。重复上述用二甲基甲酰胺溶解、加入蒸馏水使次血红素沉淀、离心并收集沉淀的操作步骤2次，最后将所得沉淀在105℃干燥得到纯品80.73克。产品收率为88％，纯度为94.2％。

[0046] 实施例6

[0047] 取上述化学反应制备的次血红素粗品混合物400克，其中加入1L的二甲基甲酰