突变的人源成纤维生长因子及在治疗内分泌疾病中的用途

摘要

本发明公开了突变的人源成纤维生长因子及其在治疗内分泌疾病中的用途。本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，其编码基因序列为SEQ ID NO：1所示。本发明以人血细胞核酸为模板，依赖天然基因库大量克隆正常人体中FGF-21基因，建立天然人FGF-21样本库，通过高通量的筛选方法，筛选得到FGF-21的天然突变体。动物学试验结果表明，本发明突变的FGF-21能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变体在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。

权利要求

1.一种突变的人源成纤维细胞生长因子-21，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的突变的人源成纤维细胞生长因子-21的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

3.含有权利要求2所述突变的人源成纤维细胞生长因子-21基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.一种制备权利要求1所述的人源成纤维细胞生长因子-21的方法，包括：将编码该突变的人成纤维细胞生长因子-21的核苷酸序列与分子伴侣相融合，得到融合基因；将融合基因可操作的与表达载体相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达成纤维细胞生长因子-21，分离纯化成纤维细胞生长因子-21，利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括：将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经过洗涤、洗脱、脱盐。

8.一种治疗内分泌疾病的药物组合物，包括：治疗上有效量的权利要求1所述的突变的人源成纤维细胞生长因子-21和药学上可接受的载体或辅料。

9.权利要求1所述的突变的人源成纤维细胞生长因子-21在制备治疗内分泌疾病药物中的用途。

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的内分泌疾病包括糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱。

说明书

突变的人源成纤维生长因子及在治疗内分泌疾病中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及成纤维生长因子，尤其涉及突变的人源成纤维生长因子及其制备方法，本发明还涉及该突变的人源成纤维生长因子在制备治疗内分泌疾病药物中的用途，属于成纤维生长因子领域。

背景技术

[0002] 糖尿病是继心脑血管疾病和肿瘤之后的人类第三大杀手。随着生活模式、饮食结构的改变，全世界糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年世界糖尿病患病人数将增至3.66亿人，糖尿病将成为世界各个国家一个沉重的负担。

[0003] 对于2型糖尿病，绝大多数的患者不可避免的要用药物来治疗。其中，口服药物有三大类：第一类为黄脲类。如优降糖，糖适平，达美康，美吡达等。黄脲类药能够刺激胰岛分泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，这对低血糖患者而言是一个不可忽视的危险因素，而且部分药物具有较大副作用，如可引起肝功能损伤。第二类药是双胍类药。如降糖灵和二甲双胍；双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛素的利用，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂，如拜糖平等；这类药的作用是减少人体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，血糖升高也比较缓慢。但该药的主要副作用就是胃肠反应，服用后如发生低血糖反应，还要口服或静脉注射葡萄糖。

[0004] 目前注射药物主要是胰岛素，注射用的胰岛素在糖尿病的治疗中发挥着重要的作用。但也有其不足，主要为用药后心慌、表情异常、流汗等，重者产生胰岛素休克或低血糖性惊厥；注射胰岛素的患者，经一度停药再用药时，对胰岛素的需用量愈来愈大，使患者必须每天必须多次注射胰岛素，给患者带来很大痛苦，而且大剂量用药也加大了集体产生副作用的机制，其原因可能是机体产生了胰岛素抗体，抗体与胰岛素结合而减弱其作用。

[0005] 近年来，随着人基因组序列的破译，一批具有独立调节血糖，有望成为新型治疗糖尿病药物的蛋白被相继发现，成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)就是其中之一。已有大量实验证明FGF-21是除胰岛素外，生物体内又一个能够独立调节代谢水平的蛋白因子。在已完成的研究中发现，FGF-21能够独立促进小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取(不论胰岛素存在与否)，并以剂量依赖性的方式降低ob/ob和db/db小鼠以及ZDF大鼠餐后及空腹时血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在发挥作用的同时，FGF-21没有引起低血糖等其它糖尿病治疗药物常见的副作用。FGF-21的发现为糖尿病患者尤其是糖尿病晚期胰岛素抵抗严重的患者带来了新的希望。但是FGF-21在人体内代谢时间较短，同胰岛素一样需要多次注射才能稳定患者血糖。

[0006] 因此，将FGF-21进行适当改造，在不改变其原有活性的基础上增加其稳定性及活性，这对于将FGF-21应用于于临床具有非常重要的意义。在以往生物药物研究中，多采用人为突变的方法进行蛋白改造，由于突变的随机性及蛋白功能的复杂性，人为突变结果往往适得其反，浪费了大量人力和物力。

发明内容

[0007] 本发明的目的之一是提供突变的人源成纤维细胞生长因子-21及其编码基因；

[0008] 本发明目的之二是提供含有突变的人源成纤维细胞生长因子-21基因的表达载体或质粒以及含有该表达载体的宿主细胞。

[0009] 本发明目的之三是将该突变的人源成纤维细胞生长因子-21应用于制备成治疗糖尿病的药物或药物组合物。

[0010] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

[0011] 一种突变的人源成纤维细胞生长因子-21(hmFGF-21)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；编码该突变的人源成纤维细胞生长因子-21的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

[0012] 本发明以人血细胞核酸为模板，依赖天然基因库大量克隆正常人体中FGF-21基因，建立一个天然人FGF-21样本库。通过SSCP，RFLP等高通量的筛选方法，筛选FGF-21的天然突变体，由于该突变体存在于正常人体内，其基因编码的突变蛋白避免了人为突变蛋白可能的副作用如活性缺失、致癌、免疫耐受等等，节省了大量后续工作。有利于加快该蛋白的药用开发。

[0013] 作为参考，一种筛选本发明所述突变的人源成纤维细胞生长因子-21的方法，包括如下步骤：以从正常人血液中提取的RNA为模版，并以此为模板克隆编码FGF-21的基因，利用SSCP、RFLP等技术从得到的基因库中筛选FGF-21突变体，将所获得的突变基因连接到构建好的表达载体中；将所述表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达，活性检测。

[0014] 含有该突变的人源成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的的包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将突变的人源成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；

[0015] 本发明还提供了一种生产突变人FGF-21的方法，包括：将突变的人成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21，分离纯化FGF-21，利用蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。

[0016] 优选的，所述的表达载体可以是pET-30a(+)，所述的宿主细胞可以是Transetta(DE3)；所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；

[0017] 其中，所述的纯化包括：将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐。

[0018] 动物学试验结果表明，本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21相比于野生型成纤维细胞生长因子-21，能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。

附图说明

[0019] 图1 hmFGF-21基因构建设计图。

[0020] 图2 hmFGF-21和hFGF-21调节细胞葡萄糖代谢的试验结果；*P＜0.05为差异显著，**P＜0.001为差异极显著。

[0021] 图3不同蛋白处理3T3-L1脂肪细胞影响GLUT1的表达含量结果。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0023] 说明：本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0024] 实施例1 hFGF-21基因的克隆

[0025] 根据hFGF-21基因去除信号肽的氨基酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的人FGF-21基因。利用在线软件Primer5.0设计hFGF-21引物。

[0026] 以提取的正常人肝总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物，参照M-MLV反转录酶M-MLVRT说明书进行cDNA第一条链合成，反应体系和具体操作分别如下：

[0027] Oligo(dT)15 1.0μl

[0028] 模板 5.0μl

[0029] DEPC-H2O 7.0μl

[0030] 70℃水浴5min，冰上放置5min，依次加入：

[0031] RNasin 1.0μl

[0032] 5×M-MLVRT buffer 5.0μl

[0033] dNTPs 5.0μl

[0034] M-MLVRT 1.0μl

[0035] 37℃水浴2h，70℃水浴15min，取2μl用于PCR扩增反应。采用常规PCR方法扩增mFGF-21成熟多肽cDNA，PCR反应(50μl体系)如下：

[0036] 10×PCR butfer 5.0μl

[0037] dNTPs 4.0μl

[0038] 模板 2.0μl(10ng)

[0039] P1 1.0μl(10pmol)

[0040] P2 1.0μl(10pmol)

[0041] rTaq酶 0.5μl

[0042] ddH2O 36.5μl

[0043] 其中，引物P1和P2的具体序列如下：

[0044] P1 ccgctcgagaaaagacaccccatccctgactccagt；

[0045] P2 gaagatcttcaggaagcgtagctggggcttcgg

[0046] 混匀后进行PCR扩增。循环参数为：94℃预变性5min，94℃ 1min，56℃ 1min，72℃1min的顺序，25个循环后，72℃再延伸10min。最终得到全长的hFGF-21基因。

[0047] 实施例2 hmFGF-21基因的克隆

[0048] 1.hmFGF-21基因的构建设计

[0049] 设计六条引物，运用重叠PCR方法构建hmFGF-21蛋白基因(如图3-1)。六条引物设计如下：

[0050] Primer262：5′GGTCTCCGAGGTCACCCCATCCCTGACTCCAGT 3′

[0051] Bsa I

[0052] Primer355：5 TCAGACTGGTACACATTGTAA 3′

[0053] 与mFGF-21配对区 与hFGF-21配对区

[0054] Primer356：5 TTACAATGTGTACCAGTCTGA 3′

[0055] 与hFGF-21配对区 与mFGF-21配对区

[0056] Primer357：5′ GCTCAGGGGGTCAGAGGAGCC 3′

[0057] 与hFGF-21配对区 与mFGF-21配对区

[0058] Primer369：5′

[0059] 与FGF-21配对区

[0060] CCATGCTCAGGGGGTCAGAGG 3′

[0061] 与FGF-21配对区

[0062] Primer263：5′CGCGGATCCTTAGGAAGCGTAGCTGGGGCTTCGG 3′

[0063] BamH I

[0064] hmFGF-21第一段扩增：

[0065] 运用PCR的方法从实施例1所扩增得到的hFGF-21基因获得hmFGF-21基因第一段。扩增体系(25μl)如下：

[0066] 5×PCR缓冲液 5.0μl

[0067] dNTPs 2.5μl

[0068] hFGF-21模板 2.0μl(30ng)

[0069] 引物262 1.0μl(10pmol)

[0070] 引物355 1.0μl(10pmol)

[0071] Primer Star DNA polymerase 0.3μl

[0072] ddH2O 13.2μl

[0073] 循环参数：95℃预变性：5min，95℃变性：30sec，50℃退火：1min，72℃延伸：1min，cycle＝15，72℃终延伸10min。

[0074] hmFGF-21基因第二段扩增：

[0075] 运用PCR的方法从mFGF-21基因(SEQ ID NO.3)获得hmFGF-21基因第二段。扩增体系(25μl)如下：

[0076] 5×PCR buffer 5.0μl

[0077] dNTPs 2.5μl

[0078] mFGF-21 templete 2.0μl(10ng)

[0079] 引物356 1.0μl(10pmol)

[0080] 引物357 1.0μl(10pmol)

[0081] Primer Star DNA polymerase 0.3μl

[0082] ddH2O 13.2μl

[0083] 循环参数：95℃预变性：5min，95℃变性：30sec，48℃退火：1min，72℃延伸：1min，cycle＝15，72℃终延伸10min。扩增结束后，取3μl混合物通过2％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

[0084] hmFGF-21基因第三段通过DNA合成公司，合成单链DNA序列。由Invitrogen公司合成DNA。

[0085] 2.全长hmFGF-21基因的扩增

[0086] 运用重叠PCR方法扩增全长hmFGF-21，扩增体系(25μl)如下：

[0087] 10×PCR缓冲液 2.5μl

[0088] dNTPs 2.5μl

[0089] hmFGF-21第一段 1.0μl(10ng)

[0090] hmFGF-21第二段 1.0μl(10ng)

[0091] hmFGF-21第三段 1.0μl(10ng)

[0092] 引物262 1.0μl(10pmol)

[0093] 引物263 1.0μl(10pmol)

[0094] rTaq酶 0.5μl

[0095] ddH2O 14.5μl

[0096] 循环参数：95℃预变性：5min，95℃变性：30sec，46℃退火：1min，72℃延伸：1min，cycle＝15，72℃终延伸10min。

[0097] 试验例1 突变的人源成纤维细胞生长因子-21的表达及活性检测

[0098] 1、突变hmFGF-21基因表达载体的构建

[0099] 将实施例2回收后的hmFGF-21目的片段与原核表达载体pET30a(+)连接，连接反应体系(10μl)如下：

[0100] pET30a(+)载体 1.0μl(10ng)

[0101] 纯化的FGF-21双酶切产物 1.0μl(20ng)

[0102] 10×T4Ligation Buffer 1.0μl

[0103] T4 DNA Ligase 1.0μl

[0104] ddH2O 6.0μl

[0105] 共10μl体系，混匀，4℃连接过夜。经过酶切鉴定后，构建得到重组质粒pET-30a-FGF-21；

[0106] 2、hmFGF-21突变蛋白的获得

[0107] (1)、诱导表达

[0108] 将含有正确序列的重组质粒pET-30a-FGF-21转化至表达菌株Transetta(DE3)(北京全式金生物技术有限公司，目录号：CD801)。转化后的单菌落分别接种至5mL LB培养基中，37℃培养10h，以1∶100接种于500mL含霉素(50mg/mL)的LB培养基中，37℃培养2h，A600＝0.3-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导3h后分收获菌体进行超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行12％SDS-PAGE电泳分析。菌体经超声破碎后离心，可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的90％以上。

[0109] (2)、蛋白质纯化

[0110] 按照上述的融合蛋白表达的最优条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，破碎后离心收集上清，先进行DEAE.Sepharose FF纯化，用25mmol/L Tris-HCI+0.25mol/L NaCl pH8.0进行洗脱。收集吸脱峰组分，进行Ni.NTA树脂亲和层析，用缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，10m mol/L咪唑 平衡Ni.NTA树脂，将裂解液引流到平衡好的树脂柱中，上样完毕后用缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，40m mol/L咪唑进行洗涤。最后，以缓冲液50m mol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，250m mol/L咪唑进行目的蛋白的洗脱。收集各洗脱峰，并进行SDS-PAGE检测。

[0111] 3、重组蛋白活性检测

[0112] (1)3T3-L1脂肪细胞(购自ATCC，货号：CL-173TM)饥饿12h，用细胞培养基稀释纯化好的成熟FGF-21蛋白，使其终浓度为0.002、0.02、0.2、2、20mg/L，以每孔1ml的量将不同浓度的稀释液加入到已分化成熟的脂肪细胞中。每个浓度至少设3个重复孔。

[0113] 葡萄糖浓度的检测：上述两种处理分别孵育细胞24h后，取上清培养基2μl放入200μl的葡萄糖检测液中测定葡萄糖的含量。每个浓度至少重复3次，37℃反应5～10分钟后，在500nm波长下测OD值。细胞的葡萄糖消耗率计算方法如下，并运用统计学分析实验结果。

[0114] 葡萄糖浓度的检测：胰岛素处理的脂肪细胞培养24h后，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(Accorsi PA，2005)检测培养基中残留的葡萄糖含量。取培养基上清液2μl加入到200μl葡萄糖检测液中，每孔葡萄糖至少重复检测3次，37℃反应5～10分钟后，在500nm波长下测OD值。

[0115] 计算培养液中残留的葡萄糖浓度，公式为：

[0116] 葡萄糖浓度(mmol/L)＝OD样品/OD标准×5.55mmol/L

[0117] 计算细胞对葡萄糖的消耗率，公式为：

[0118] 细胞葡萄糖消耗率(％)＝[(C空白葡萄糖-C给药葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100％。

[0119] 用不同浓度的hFGF-21(SEQ ID NO.4)和hmFGF-21蛋白处理脂肪细胞细胞24h后，经微量化的GOD-POD法葡萄糖检测试剂盒检测培养基中葡萄糖含量，统计学分析结果显示，用hFGF-21和hmFGF-21蛋白处理的细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加，与未经任何处理的对照组相比，残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少。本实验未经处理的脂肪细胞葡萄糖消耗率只有21.3％，而经蛋白作用的脂肪细胞葡萄糖消耗率显著增加，并且随着蛋白浓度的增加，细胞葡萄糖消耗率显著增加，呈剂量依赖关系。说明hmFGF-21同hFGF-21一样具有调节细胞葡萄糖代谢的作用。在不同浓度时经hmFGF-21蛋白刺激的HepG2细胞葡萄糖吸收都高于hFGF-21蛋白刺激的HepG2细胞葡萄糖吸收，并且在浓度为0.2、2mg/L时显著高于hFGF-21蛋白刺激的脂肪细胞葡萄糖吸收，高出4％。说明改造的hmFGF-21蛋白活性优于hFGF-21蛋白(图2)。

[0120] (2)取分化成熟的3T3-L1脂肪细胞，无血清培养基培养12h后，分别加入含有1000nmol/L野生型(hFGF-21，即WT蛋白)和突变型hmFGF-21的培养基处理细胞，以不加处理的细胞为对照，在培养6h后分别收获脂肪细胞，提取细胞总RNA。以提取的脂肪细胞总RNA为模板，Oligo(dT)15为引物，参照M-MLV反转录酶M-MLVRT说明书进行cDNA第-条链合成。用Quant SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应。

[0121] GLUT1

[0122] 上游引物：5’-CCATCCACCACACTCACCAC-3’，

[0123] 下游引物：5’-GCCCAGGATCAGCATCTCAA-3’。

[0124] 内参β-actin

[0125] 上游引物：5’-GAGACCTTCAACACCCC-3’。

[0126] 下游引物：5’-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3’。

[0127] 注：GLUT1是FGF-21的糖效应分子，它表达的高低能够反映蛋白的活性。

[0128] 试验结果见图3。结果说明：采用突变型hmFGF-21的培养基处理脂肪细胞，其脂肪细胞内GLUT1的表达含量相比于用野生型hFGF-21的培养基处理脂肪细胞有显著提升。

[0129] 试验例1 本发明hmFGF-21突变蛋白的体内活性试验

[0130] 自发性2型糖尿病db/db模型小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK(沪))随机分为3组，每组5只。通过皮下给药方式，阴性对照组注射生理盐水；野生组(hFGF-21)与突变组(hmFGF-21)以0.25mg/kg剂量注射蛋白。实验开始于上午8点(此时模型动物血糖为一天内较高值)，实验过程中自由饮食。检测模型动物经不同处理后的血糖变化情况，所得实验数据进行统计学分析。表一为不同蛋白组连续注射蛋白7日后停药血糖变化情况，表二为不同蛋白组每两天注射一次蛋白后停药血糖变化情况.

[0131] 具体试验结果见表1和表2。

[0132] 表1

[0133]

[0134] 表2

[0135]