一株用于发酵的克雷伯氏菌Klebsiellasp.A-08及其应用

摘要

本发明涉及一种产酸且能够利用还原糖产乙醇的新菌种克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，保藏号为CCTCC M 209219，是从造纸厂污泥中分离的一株细菌，结合16S rRNA基因序列分析和菌株形态、生理特性分析，确定该菌株为克雷伯氏菌。利用该菌能够降解葡萄糖生成酸性物质，还能对葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇，且相对稳定、高产。

权利要求

1.一株用于发酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，其特征在于，所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的保藏号为CCTCC NO M209219。

2.权利要求1所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的应用，其特征在于，所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08对葡萄糖进行发酵产乙醇。

说明书

一株用于发酵的克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08及其应

用

技术领域

[0001] 本发明属于应用微生物领域，涉及一株用于发酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08及其应用。

背景技术

[0002] 随着社会的发展，传统利用生物质能的比例将越来越少，而现代发酵工业系利用微生物的代谢活动经生物转化大规模制造产品的一门工业。则这可以进一步说明现代发酵工业体系将在今后几十年内在以后能源体系的重要地位。现代发酵微生物实验技术微生物是发酵工业的根本，优良菌株是高效发酵结果的前提，生产过程中不断强化菌种的性能是保持技术经济优势的必需。而现代发酵产酒精主要是工业是以纯种菌种的培养为基础，所以采用各种不同的筛选手段来进行菌种选育，进一步选出产量高、符合生产的各种条件的纯种，这是发酵产酒精的关键一步。野生菌种很适应于培养条件，并逐渐显示出它的生长优势，这种优势的发展，促使它优良的生产性能表露。进行类似新种筛选分离，达到获得新的优良生产菌种的目的。由于克雷伯氏菌为自然界中筛选的野生菌种，是自然界长期演化的结果，因而相当的稳定，并且能够适应环境，一般采用克雷伯氏菌产氢，本发明采用了利用克雷伯氏菌分别对葡萄糖、木糖、蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇，通过实验，得到了一个相对稳定、高产的产乙醇菌株。

发明内容

[0003] 本发明在于提供一种能够高产酒精的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，并提供该菌种的分离纯化方法及对葡萄糖降解产酸和对葡萄糖或蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇的应用。

[0004] 本发明的目的是通过以下方式实现的。

[0005] 一株用于发酵的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08，其保藏号为CCTCC M209219。

[0006] 所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的形态学特征如下：菌落呈白色，圆形，表面光滑、湿润、隆起，边缘整齐、粘液状，菌落相互融合；细胞呈杆状，(0.3～1.5)×(0.6～6.0)微米，呈短链状排列。

[0007] 所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的生理生化特征如下：在葡萄糖培养基和LB培养基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培养基中可发酵葡萄糖；在溴麝香草酚蓝培养基中，以柠檬酸钠作为碳源，产生酸性物质，菌落成蓝色，且产生吲哚。

[0008] 所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的应用在于其能使葡萄糖降解产生酸性物质。

[0009] 所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的应用在于其能对葡萄糖进行发酵产乙醇。

[0010] 所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的应用在于其能对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇。

[0011] 所述的克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的应用在于其能分别与酿酒酵母CICC编号：1517、大肠埃希氏菌CICC编号：10308混合对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇。

[0012] 将菌培养12小时，用试剂盒抽提总DNA，凝胶电泳，用纯化试剂盒纯化，再将纯化产物进行PCR扩增，所得PCR产物进行测序。由南京金思特生物公司测序结果及在GenBank数据库中的BLAST结果可知此菌为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp)，该菌株的登录号为AY363386，16sDNA的序列为：

[0013] agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc[0014] ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga[0015] aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca[0016] agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat gccatcagat gtgcccagat gggattagct[0017] agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca[0018] gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg[0019] cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt[0020] aaagtacttt cagcgaggag gaaggcgtta aggttaataa ccttggcgat tgacgttact[0021] cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga ggtgcaagcg[0022] ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca gatgtgaaat[0023] ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttga aactggcaag cttgagtctt gtagaggggg[0024] gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag[0025] gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta[0026] gataccctgg tagtccacgc tgtaaacgat gtcgacttgg aggttgttcc cttgaggagt[0027] ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac[0028] tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac[0029] gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca gagaacttag cagagatgct ttggtgcctt[0030] cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt[0031] taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcgattcggt cgggaactca[0032] aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc[0033] ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcatataca aagagaagcg acctcgcgag[0034] agcaagcgga cctcataaag tatgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat[0035] gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt tcccgggcct[0036] tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt agcttaacct[0037] tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa caaggtaacc[0038] gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct t

[0039] 发明的效果或特点

[0040] 由于克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08保藏号：CCTCC M 209219，为自然界中筛选的野生菌种，是自然界长期演化的结果，因而相当的稳定，并且能够适应环境，本发明利用克雷伯氏菌在葡萄糖培养基中产生酸性物质，分别对葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇，以及与酿酒酵母、大肠埃希氏菌混合对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产乙醇，足以证明克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08是一个相对稳定、高产的产乙醇菌株。把Klebsiella sp.A-08与其他菌如大肠埃希氏菌、酿酒酵母混合发酵可以更好提高乙醇的产率，而且相较于其它策略(如代谢工程)更为简单和经济，有利于提高资源利用率和生物乙醇的市场竞争力，具有很好的应用前景，与其他产乙醇菌相比，克雷伯氏菌为自然界中筛选的野生菌种，更加能够适应环境，可以抵制酶解液中的各种不利因素的影响，若能经过改造，能够更加提高利用率。

[0041] 克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08

[0042] 保藏日期：2009年10月9日

[0043] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心

[0044] 保藏单位简称：CCTCC

[0045] 保藏号：CCTCC NO：M 209219

附图说明

[0046] 图1为克雷伯氏菌在显微镜下观察的形状；

[0047] 图2为克雷伯氏菌落在显微镜下观察的形状；

[0048] 图3为克雷伯氏菌生长pH曲线图。具体实施方案

[0049] 以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。

[0050] 实施例1

[0051] 克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08的分离筛选。

[0052] 1、菌种来源

[0053] 长沙污水处理厂的废水中的污泥。

[0054] 2、培养基及初步筛选原理、方法

[0055] 克雷伯氏菌能利用柠檬酸钠作为碳源，而大肠杆菌不能，克雷伯氏菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸氨后，产生碱性化合物使pH值升高，在有溴麝香草酚蓝指示剂的情况下，培养基由绿色变为深蓝色，溴麝香草酚蓝指示范围为：pH小于6时呈黄色，pH为6.0-7.6时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。分别取20g污泥，稀释后接种于LB培养基，1天后，挑取菌落接种于溴麝香草酚蓝琼脂培养基上，37℃培养72h，每天观察，培养基由绿色变为蓝色，挑取蓝色菌落，稀释，纯化。将纯化后的菌种用普通LB培养基保存，完成初步筛选。
再将培养24h的菌液2ml置于5ml离心管中，再加入1ml乙醚，充分振荡，使吲哚溶于乙醚，静置片刻，乙醚层浮与菌液上层然后沿离心管壁加入10滴5％的对二甲基氨基甲醛溶液，如果有吲哚产生，则乙醚层呈现玫瑰红色。(克雷伯氏菌属于肠杆菌科，能够氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚无色，可与对二甲基氨基甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚。加入对二甲基氨基甲醛后切勿摇动，否则红色不明显)。根据以上原理和方法，对初步筛选的
88株菌进行吲哚实验，结果有22株菌呈现玫瑰红，然后用10％的葡萄糖液体培养基对以上
22株菌进行发酵实验，淘汰产乙醇含量极低的菌，筛出1株编号为A08的菌株。其发酵能力远远大于其他菌株，将其选为发酵所需菌种。

[0056] 所述的溴麝香草酚蓝培养基成分为：NaCl25g、MgSO4·7H2O0.2g、(NH4)H2PO41g、K2H2PO41g、柠檬酸钠5g、琼脂12g、蒸馏水1000ml、0.2％溴麝香草酚蓝溶液40ml、肌醇、pH6.8。121℃高压灭菌20min。其中0.2％溴麝香草酚蓝溶液用过滤灭菌。

[0057] 所述的普通LB培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl25g、琼脂粉10g、蒸馏水1000ml，自然pH值。

[0058] 所述克雷伯氏菌株A-08的形态学特征总结如下：菌落呈白色，圆形，表面光滑、湿润、隆起，边缘整齐、粘液状，菌落相互融合；细胞呈杆状，(0.3～1.5)×(0.6～6.0)微米，呈短链状排列。

[0059] 所述克雷伯氏菌株Klebsiella sp.A-08的生理生化总结特征如下：在葡萄糖培养基和LB培养基中均可分解蛋白胨、酵母膏；在葡萄糖培养基中可发酵葡萄糖；在溴麝香草酚蓝培养基中，以柠檬酸钠作为碳源，产生酸性物质，菌落成蓝色，且产生吲哚。

[0060] 3、克雷伯氏菌A-08生长条件

[0061] A：克雷伯氏菌A-08生长pH值(图3)

[0062] 用pH梯度为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、10、11、12的LB液体培养基对克雷伯氏菌进行培养，温度37℃，转速120r/min，培养3d。选出最佳生长pH值为7.0。

[0063] B：克雷伯氏菌A-08生长pH值的变化

[0064] 将菌接入pH值在3-8之间的LB液体培养基中，菌的生长会产生碱性物质，致使pH上升，在8-12之间会产生酸性物质，致使pH值减小，pH在8时，基本保持不变，见表1。

[0065] 表1克雷伯氏菌A-08在LB液体培养基不同pH值条件下生长时pH值的变化[0066]

[0067] 将菌接入pH值在3-8之间的葡萄糖液体培养基中，菌的生长会将葡萄糖降解为酸性物质，致使pH值减小，pH小于4时生长受到限制，pH值基本保持不变，见表2。

[0068] 表2克雷伯氏菌A-08在葡萄糖液体培养基不同pH值条件下生长时pH值的变化[0069]

[0070] 实施例2

[0071] 克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08的发酵试验

[0072] 1、发酵方法

[0073] A：纯种接种于LB平板培养基中，37℃培养3天；

[0074] B：挑取菌接种于种子液体培养基中，于37℃以150r/min转速培养24小时；(种子培养基成分为：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl22g、MgSO40.25g、KH2PO42.5g、CaCl20.25g、葡萄糖15g，蒸馏水1000ml，pH为7.0～7.2。)

[0075] C：根据以下葡萄糖、爆破材料单菌发酵、爆破材料混菌发酵的不同情况进行发酵；

[0076] D：发酵菌种：大肠埃希氏菌Escherichia coli ko11，CICC编号：10308(ATCC55124)，能够发酵五碳糖，六碳糖。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，CICC编号：
1517，能够发酵六碳糖。

[0077] 1)葡萄糖发酵实验

[0078] 将里氏木酶酶液酶解液用氢氧化钠调pH值至7.0，然后将A08菌菌液离心，加入酶解液中使其OD值达到0.5，温度37℃，转速200r/min，发酵3天，测定酒精含量。发酵液中乙醇含量32.5622g/L，远高于其他菌，则选择A08为产乙醇的优势菌。

[0079] 葡萄糖发酵培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl25g、葡萄糖100g、蒸馏水1000ml，pH为7.0。

[0080] 2)爆破材料单菌发酵实验

[0081] 蒸汽爆破后的杨树木浆，用实验室所产的里氏木酶酶液进行酶解，脱毒处理，浓缩之后含糖量达到10％，分装6个摇瓶，均放入酶解液100ml，将酶解液用氢氧化钠调pH值至7.0，然后将A08菌菌液离心，加入酶解液中使其OD值达到0.5，温度37℃，转速200r/min，发酵3天，测定酒精含量为28.6624g/L。

[0082] 3)爆破材料混菌发酵实验

[0083] 蒸汽爆破后的杨树木浆，用实验室所产的里氏木酶进行酶解，再用氢氧化钙进行脱毒处理，浓缩之后含糖量达到10％，分装为6个摇瓶，均放入酶解液100ml，将酶解液用氢氧化钠调pH值至7.0，然后各取等量A08和酿酒酵母、A08和大肠埃希氏菌Ko11菌菌液离心，加入酶解液中使其OD值达到0.5，温度32℃，转速200r/min，发酵3天，测定酒精含量分别为33.1175g/L和36.4264g/L，比单菌种发酵产酒精效率更高。

[0084] 2、测定方法

[0085] A：还原糖质量浓度的测定采用DNS法

[0086] 首先配置得到0.5mg/ml浓度的葡萄糖标准液。再取6支试管，配制0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L的葡萄糖溶液，100℃水浴5min，在λ＝540nm下测定吸光值，绘制出标准曲线。对照标准曲线，测出还原糖浓度。

[0087] B：乙醇质量浓度及含量的测定采用气相色谱法

[0088] 气相色谱仪：PerkinElmer Clarus 500；色谱柱：HP-INNOWAX；载气：高纯氮气；载气流速：11psi；检测器：FID，检测器温度：250℃；H2流速：45mL/min；空气流速：450mL/min；进样口温度：200℃；进样方式：分流，分流比：50∶1；进样量：0.5μl；炉温：程序升温，初始温度50℃，10℃/min升至120℃，20℃/min升至180℃，共10min。样品的制备：发酵液10000×g，离心10分钟，取0.9ml上清液，加入0.1ml 0.8g/l的正丙醇作为内标物，用
1ml正丁醇萃取10分钟。

[0089] 序列表

[0090] <110>中南林业科技大学

[0091] <120>一株用于发酵的克雷伯氏菌Klebsiella sp.A-08及其应用

[0092] <130>GenBank

[0093] <160>1

[0094] <170>PatentIn version 3.3

[0095] <210>1

[0096] <211>1531

[0097] <212>DNA

[0098] <213>Klebsiella sp.

[0099] <400>1

[0100] agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60[0101] ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagcggcgga cgggtgagta atgtctggga 120[0102] aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taacgtcgca 180[0103] agaccaaagt gggggacctt cgggcctcat gccatcagat gtgcccagat gggattagct 240[0104] agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca 300[0105] gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360[0106] cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt 420[0107] aaagtacttt cagcgaggag gaaggcgtta aggttaataa ccttggcgat tgacgttact 480[0108] cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga ggtgcaagcg 540[0109] ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtt tgttaagtca gatgtgaaat 600[0110] ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttga aactggcaag cttgagtctt gtagaggggg 660[0111] gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc ggtggcgaag 720[0112] gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 780[0113] gataccctgg tagtccacgc tgtaaacgat gtcgacttgg aggttgttcc cttgaggagt 840[0114] ggcttccgga gctaacgcgt taagtcgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac 900[0115] tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgatgcaac 960[0116] gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca gagaacttag cagagatgct ttggtgcctt 1020[0117] cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga aatgttgggt 1080[0118] taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcgattcggt cgggaactca 1140[0119] aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc 1200[0120] ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcatataca aagagaagcg acctcgcgag 1260[0121] agcaagcgga cctcataaag tatgtcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1320[0122] gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt tcccgggcct 1380[0123] tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt agcttaacct 1440[0124] tcgggagggc gcttaccact ttgtgattca tgactggggt gaagtcgtaa caaggtaacc 1500[0125] gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct t 1531