一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌，为高亚铁氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特征在于：该菌命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心编号为：CGMCC NO.3549。本发明的基因工程菌较野生型的氧化亚铁硫杆菌在亚铁氧化活性方面有一定的提高，且性能稳定，在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理以及污泥中重金属的去除等领域具有很大的应用前景。

权利要求

1.一株高亚铁氧化活性的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)基因工程菌pTCYC1；其特征在于：该菌株保藏中心编号为CGMCC NO.3549，2009年12月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

2.权利要求1所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理以及污泥中重金属的去除中的应用。

说明书

一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株硫杆菌及其应用，尤其涉及一株具有较高亚铁氧化能力的基因工程菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其构建与应用。

背景技术

[0002] 嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是在细菌浸矿过程中2+ 2+
起关键作用的菌种之一。嗜酸氧化亚铁硫杆菌在Fe 基质中生长时，Fe 被快速氧化成
3+ 3+
Fe 提供电子进入细菌呼吸链，而Fe 作为一种强氧化剂在生物浸矿等过程中起着关键的
2+
作用。因此，嗜酸氧化亚铁硫杆菌氧化Fe 离子的能力是衡量其浸矿能力的一项重要指标。
2+
经检索目前还没有任何关于以转基因的方式来提高嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fe 离子氧化能力的报道。

发明内容

[0003] 针对现有技术中对嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fe2+离子氧化能力遗传改良方法的空白，本发明要解决的问题是通过转基因的方法将氧化亚铁电子传递链蛋白CYC1基因导入嗜酸2+
氧化亚铁硫杆菌提供一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌以提高其氧化Fe 离子的能力，使嗜酸氧化亚铁硫杆菌更高效地发挥生物冶金的功能。

[0004] 本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌为高亚铁氧化活性A.ferrooxidanspTCYC1，该菌命 名为嗜酸氧 化亚铁硫杆 菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，保藏中心编号为：CGMCC NO.3549。 [0005] 本发明的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)经鉴定，具有如下生物学特征：

[0006] 革兰氏阴性，有鞭毛，好氧，嗜酸，为化能自养细菌，短杆状，大小为(0.3～0.5)μm×(1～2)μm；能够以二价铁、元素硫或者还原态硫复合物作为能源，在含有硫酸亚铁和硫代硫酸钠的固体培养基上能生长；菌落形态不规则，凹陷，边缘呈锯齿状，酒红色，不透明；生长最适温度为25-30℃，生长最适pH为1.5～2.5。

[0007] 本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的构建及在亚铁培养基中的生长及应用，涉及的步骤顺序如下：

[0008] (1)菌 种选 择：嗜 酸 氧 化亚 铁 硫 杆菌 ATCC 19859(Acidithiobacillus ferrooxidansATCC19859)；大肠杆菌DH5α(Escherica coli DH5α)。

[0009] (2)氧化亚铁电子传递链蛋白CYC1高效表达载体的构建：CYC1蛋白编码基因克隆自嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859染色体DNA，所用引物为：

[0010] 上 游 引 物cyc1EU(GTACGAATTCAGGAGCCGATGCCATGACGACATACTT)，下 游 引 物cyc1XD(CCTCTCTAGATTA CAACGATGAAAGATAAGCCGCCACA)。

[0011] 上游引物引入EcoR I酶切位点，下游引物引入Xba I酶切位点以及6×His标签以方便检测cyc1基因在细胞内的表达情况。将扩增产物进行EcoR I和Xba I双酶切，回收744bp大小的片段；同时对可移动性的质粒载体pJRD215进行EcoRI和XbaI双酶切，回收约10kb的载体片段；用T4连接酶将这两个片段连接，以连接液转化大肠杆菌DH5α， 在含有100μg/ml链霉素(Sm)的LB固体平板上37℃静置培养，进行转化子的筛选，挑取转化子进行质粒提取、酶切验证，构建出中间质粒pCYC1。

[0012] 以质粒pMMB24DNA为模板，设计引物Ptac-1(5’-GTACAAGCTTATCGACTGCACGGTGCACC-3’)和Ptac-2(5’-GTACGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3’)扩增不含调控区域的Tac启动子，命名为Ptac。扩增产物经HindIII和EcoR I双酶切，连接至pCYC1质粒中cyc1基因上游HindIII-EcoR I位点，连接液转化大肠杆菌DH5α。在含有Sm(100μg/ml)的LB固体平板上37℃静置培养，进行转化子的筛选，挑取转化子进行质粒提取、酶切验证，同时对所插入的外源基因Ptac以及cyc1基因进行测序验证，构建了可转移质粒pTCYC1。从经测序验证准确无误的转化子中提取质粒pTCYC1，转化至含RP4质粒的大肠杆菌DH5α，命名为大肠杆菌DH5α(RP4/pTCYC1)，为下一步的接合转移实验作准备。

[0013] (3)嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的制备：以大肠杆菌DH5α(RP4/pTCYC1)作为供体菌，嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859作为受体菌在滤膜上进行接合转移。供体菌和受体菌分别离心收集菌体，洗涤液洗涤至少三次，用洗涤液分别悬浮供体菌和受体菌至相同密度，然后按一定比例混合后取适量的菌悬液(0.1～0.3ml)加到无菌硝酸纤维素滤膜上，滤膜置于接合平板上30～35℃培养24～72h，使之接合。取滤膜用1ml无机盐洗涤0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7
液洗下菌体，稀释成一系列不同浓度：10、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 ，分别取100μl涂布含相应抗生素的2∶2选择平板及相应的不含抗生素的对照平板。同时在选择性平板上分别涂布供体菌和受体菌作为对照。放置25～30℃温箱中培养7～10d，直至板上形成明显菌落。

[0014] (4)接合子的种子培养：挑取步骤(3)中选择性平板上形成的接合子菌落，在无菌条件下用接种环接于30mL 9K-FeSO4培养基(Sm 300μg/ml)中，25-30℃条件下，160rpm震荡培养3～5d，制得种子液；

[0015] (5)接合转移子扩大培养：以5％体积比的接种量，将种子液接种于200mL9K-FeSO4培养基(Sm 300μg/ml))中，25-30℃条件下，160rpm振荡培养3～5d； [0016] (6)接合转移子的质粒提取验证：将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液中的高铁沉淀；离心收集菌体，用9K无机盐溶液洗涤至少3次直至菌泥中没有可见的高铁沉淀，再用PBS缓冲液洗菌体2次，然后按照常规的碱裂解法进行质粒抽提。 [0017] 质粒提取验证结果：阳性的接合子命名为A.ferrooxidans pTCYC1； [0018] (7)A.ferrooxidans pTCYC1中重组质粒所携带cyc1基因在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的表达：将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液中的高铁沉淀；离心收集菌体，用9K无机盐溶液洗涤至少3次直至菌泥中没有可见的高铁沉淀，收集足够量的A.ferrooxidans pTCYC1菌体，洗涤后重悬于裂解缓冲液，超声破碎细胞。经Bradford法测定样品中的蛋白浓度后，取等量蛋白与等体积的2×Laemmli缓冲液混合，煮沸5min后进行Western blotting检测，验证质粒pTCYC1上所携带cyc1基因是否能在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中正常表达；

[0019] (8)基因工程菌A.ferrooxidans pTCYC1亚铁离子氧化活性测定：将步骤(5)所得的培养液真空抽滤出去培养液中的高铁沉淀；离心收集菌体，用TE缓冲液洗菌体三次后将重悬于TE缓冲液中。取细菌悬浮液加入反应缓冲液中，30℃振荡培养，在培养的不同时2+
间取培养液以邻菲啰啉法测定培养液中剩余Fe 的浓度；

[0020] (9)重组质粒pTCYC1在A.ferrooxidans ATCC19859的稳定性检测：在固体平板上 挑取A.ferrooxidans阳性接合转移子菌落一个，接种到不含有筛选标记的9K-FeSO4液体培养基中，在没有选择压力条件下30℃振荡培养5d，然后按照1∶1000的比例转接，如此连续转接5次(＞50代)，稀释后分别涂布含有抗生素的2∶2选择平板以及不含抗生素的2∶2固体平板，25-35℃培养10d。通过计算抗生素抗性菌落占总菌落的比例，测出重组质粒在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的稳定性。

[0021] 其中，步骤(3)中所述的菌体接合培养时间优选是48h，接合培养温度优选30℃；固体培养温度优选是30℃，培养时间是7d；

[0022] 其中，步骤(4)、(5)中所述的菌体培养温度优选是30℃；

[0023] 上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 19859(Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859)购自美国标准生物品收藏中心；大肠杆菌DH5α(Escherica coli DH5α)购自原平皓(天津)生物技术有限公司。

[0024] 上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的制备中，pJRD215质粒构建见Davison J，Heusterspreute M，Chevalier N，Ha-Thi V，Brunel F.Vectors with restriction site banks.V.pJRD215，a wide-host-range cosmid vector with multiple cloning sites.Gene.1987，51(2-3)：275-80；pMMB24质粒构建见Miroslawa M.Bagdasarian，Egon Amann，RudolfLurz，Beate Ruckert and Michael Bagdasarian.Activity of the hybrid trp-lac(tac)promoter ofEscherichia coli in Pseudomonas putida.Construction of broad-host-range，controlled-expression vectors，1983，Gene，26：273-282；RP4质粒构建见Datta，N.，R.W.Hedges，E.J.Shaw，R.B.Sykes and M.H.Richmond.Properties of an R factor fromPseudomonas aeruginosa，1971，J.Bacteriol，108：1244-1249。 [0025] 上述质粒的构建中，培养大肠杆菌DH5α使用的LB液体培养基，配方为： [0026] 每1000ml蒸馏水中添加：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用2N NaOH溶液调pH2
至7.0～7.5，15磅/寸 高压蒸汽灭菌20min，37℃培养。

[0027] 上述LB固体培养基为上述LB液体培养基中加入1.8％琼脂粉，pH 7.0～7.5。 [0028] 在上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌培养使用的液体9K-FeSO4无机盐培养基，配方为： [0029] 每1000ml蒸馏水中添加：(NH4)2SO43g，K2HPO40.5g，KCl 0.1g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)20.01g，用浓H2SO4调pH 2.0，121℃条件下灭菌20min；配置44.8％的FeSO4.7H2O浓溶液，过滤除菌，使用前按按1∶9的比例与9K无机盐培养液混合。

[0030] 上述2∶2固体培养基配方为：

[0031] A：2g Na2S2O3·5H2O溶解于10ml蒸馏水中；

[0032] B：2g FeSO4.7H2O溶解于10mlpH值预调为2.0的酸性水中；

[0033] C：4.5g(NH4)2SO4，0.15g KCl，0.75g MgSO4·7H2O溶解于500ml蒸馏水中； [0034] D：6g琼脂溶于480ml蒸馏水；

[0035] 其中，组分A与B过滤除菌，C与D 121℃条件下灭菌20min，待C与D组分冷却至45℃左右时，将四种组分混合，倾倒平板备用。

[0036] 上述2∶2接合培养基为上述2∶2固体培养基中加入0.1％的酵母粉，pH 4.8～5.0。

[0037] 其中，步骤(3)中所述的菌体洗涤液为上述2∶2培养基C组分中加入等体积的蒸馏水作为菌体洗涤液。

[0038] 上述步骤(6)中的PBS缓冲液配方为：

[0039] 每1000ml蒸馏水中添加：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g， 用HCl2
调pH值至7.4，加H2O定容至1L，15磅/cm，灭菌20min。

[0040] 上述步骤(7)中的裂解液配方为：

[0041] 每1000毫升蒸馏水各成分含量为：50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，150mmol/L NaCl，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。

[0042] 上述步骤(7)中2×Laemmli缓冲液配方为：

[0043] 4％SDS，29％甘油，10％β-巯基乙醇，0.04％溴酚蓝；0.125M Tris-HCl； [0044] 上述步骤(8)中的TE缓冲液配方为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA。

[0045] 本发明所述嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理以及污泥中重金属的去除中的应用。

[0046] 实验证实：本发明所述的嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌(A.ferrooxidans pTCYC1)与野生型嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans ATCC19859)相比较，其氧化亚铁离子的能力提高了13％，这对嗜酸氧化亚铁硫杆菌在生物浸出中的应用有着重要的意义。此外，因嗜酸氧化亚铁硫杆菌在除生物浸出以外其它方面的应用，如烟气脱硫、酸性矿井水的处理以及污泥中重金属的去除等，也是基于嗜酸氧化亚铁硫杆菌氧化二价铁离子的能力，因此该发明具有广泛的应用前景。

具体实施方式

[0047] 实施例1：重组质粒pTCYC1的构建及鉴定。

[0048] (1)将含有cyc1基因以及6×His标签编码基因与穿梭性质粒pJRD215连接后，转化大肠杆菌DH5α，在含有Km的LB固体平板筛选得到含有Km抗性质粒的大肠杆菌DH5α，经提取质粒酶切验证，转化子中携带的质粒确实含有插入片段。

[0049] (2)将Ptac基因片段与中间载体pCYC1连接后，转化大肠杆菌DH5α，在含有Km的LB固体平板筛选得到含有Km抗性质粒的大肠杆菌DH5α，经提取质粒酶切验证，转化子中携带的质粒确实含有插入片段。将验证过的阳性克隆进行测序，选取测序正确的克隆，提取质粒，转化至大肠杆菌DH5α(RP4)在含有Sm的LB固体平板上筛选得到接合转移所用的供体菌大肠杆菌DH5α(RP4/pTCYC1)。

[0050] 上述LB筛选培养基中，卡那霉素(Km)或链霉素(Sm)的筛选浓度为100μg/ml。 [0051] 实施例2：嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的构建及鉴定。

[0052] (1)分别收集指数生长中期的大肠杆菌DH5α(RP4/pTCYC1)作为供体菌，指数生长中期的嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859作为受体菌，无机盐洗涤液洗涤3次，按相同菌体浓度悬浮于洗涤液中备用。

[0053] (2)按供体菌与受体菌的体积比为1∶1，将悬浮液进行混合，取200μl放于孔径为0.45μm的硝酸纤维素滤膜(光面朝上)上，30℃于接合平板上培养48h；1ml洗涤液将-1 -2 -3 -4滤膜上的菌体洗下，稀释为10 、10 、10 、10 ，分别取100μl涂布2∶2筛选平板，30℃静置培养10d。筛选平板中抗生素Km浓度为200μg/ml。

[0054] (3)挑取筛选平板上的抗性菌落，接种于30ml9K-FeSO4培养基(Km 300μg/ml)中，30℃条件下，160rpm震荡培养5d.，制得种子液；以5％体积比的接种量，将种子液接种于200mL 9K-FeSO4培养基(Km 300μg/ml))中，30℃条件下，160rpm震荡培养4d后收集菌液进行质粒提取验证。

[0055] (4)经质粒提取验证，从筛选平板上挑取的接合子能够提取出分子量大小正确的质粒，而从作为对照的A.ferrooxidans ATCC19859中则未能提取出质粒。

[0056] 结果表明，重组质粒通过滤膜接合的方式成功地从大肠杆菌DH5α(RP4/pTCYC1)转移至了嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC19859中，提示已成功获得了嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌A.ferrooxidans pTCYC1。

[0057] 实施例3：重组质粒pTCYC1所携带cyc1基因在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中的表达 [0058] (1)菌种选择：A.ferrooxidans pTCYC1，A.ferrooxidans ATCC19859； [0059] (2)种子培养：将A.ferrooxidans pTCYC 1及A.ferrooxidans ATCC19859在无菌条件下用接种环接一环于30mL 9K-FeSO4液体培养基中，30℃条件下，振荡培养至稳定期，制得种子液；

[0060] (3)扩大培养：以5％的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于200mL9K-FeSO4液体培养基中，30℃条件下，振荡培养至稳定期(约4d)；

[0061] (4)嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白SDS-PAGE电泳：将步骤(3)中得到的培养液抽滤去除高铁沉淀，离心收集菌体，将菌体重悬于裂解缓冲液中，超声破碎细胞，待样品中完整细胞的数目不超过细胞总数的10％时(镜检确定)，停止超声，13000rpm离心10min去除细胞碎片。Bradford法测定A.ferrooxidans pTCYC1及A.ferrooxidansATCC19859样品中蛋白浓度后，取相同量的蛋白以15％的变性聚丙烯酰胺凝胶分离；

[0062] (5)嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白的Western-blotting检测：将步骤(4)中在聚丙烯酰胺凝胶中得到有效分离的嗜酸氧化亚铁硫杆菌总蛋白转印至PVDF膜上，分别进行一抗(Anti-His Antibody)及二抗(Poly Rabbit Anti-mouse immunoglobulins/HRP)孵育后，进行ECL发光检测；

[0063] (6)经Western-blotting检测验证，质粒pTCYC1上所携带的cyc1基因在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中得到了有效的表达。

[0064] 实施例4：嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌的菌种鉴定及保藏信息。 [0065] 本发明构建的高亚铁氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1菌株已于2009年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，中国北京)，保藏中心编号为：CGMCC NO.3549。

[0066] 上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌，经鉴定，具有如下生物学特征：

[0067] 革兰氏阴性，有鞭毛，好氧，嗜酸，为化能自养细菌，短杆状，大小为(0.3～0.5)μm×(1～2)μm；能够以二价铁、元素硫或者还原态硫复合物作为能源，在含有硫酸亚铁和硫代硫酸钠的固体培养基上能生长；菌落形态不规则，凹陷，边缘呈锯齿状，酒红色，不透明；生长最适温度为25-30℃，生长最适pH为1.5～2.5。

[0068] 实施例5：A.ferrooxidans pTCYC1亚铁离子氧化活性的测定

[0069] (1)菌种选择：A.ferrooxidans pTCYC1，A.ferrooxidans ATCC19859； [0070] (2)种子培养：将A.ferrooxidans pTCYC1及A.ferrooxidans ATCC19859在无菌条件下用接种环接一环于30mL 9K-FeSO4液体培养基中，30℃条件下，振荡培养至稳定期，制得种子液；

[0071] (3)扩大培养：以5％的体积比的接种量，将两株菌的种子液接种于200mL9K-FeSO4液体培养基中，30℃条件下，振荡培养至稳定期(约4d)；

[0072] (4)嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚铁氧化活性的测定：将步骤(3)中得到的培养液抽滤去除高铁沉淀，离心收集菌体，用TE缓冲液悬浮至相同浓度，取一定量的细胞悬液抽提细胞总蛋白，以bradford法进行蛋白定量。取相同体积悬浮接入3ml反应缓冲液中， 在反应2+
不同时间从反应体系中取出0.2ml反应液，12000g离心2min后，确定反应液中剩余的Fe
2+
浓度，根据Fe 浓度的变化确定嗜酸氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化酶活性；

[0073] (5)本 实验 所 构 建的 基 因 工程 菌A.ferrooxidans pTCYC1较 野 生 型A.ferrooxidansATCC19859，亚铁氧化能力得到了一定的提高：实验所测得的基因工程菌2+
A.ferrooxidansATCC19859亚铁氧化活性为5.3μmol Fe oxidized/mg Protein/min，而
2+
基因工程菌亚铁氧化活性为6.0μmol Fe oxidized/mg Protein/min，相对于野生型，本实验所构建的基因工程菌亚铁氧化活性提高了13％。

[0074] 上述A.ferrooxidans pTCYC1在进行种子培养及扩大培养时，培养基中加入浓度为300μg/ml的卡那霉素(Km)。

[0075] 序列表

[0076] <110>山东大学

[0077] <120>一株嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因工程菌及其应用

[0078] <141>2010-2-4

[0079] <160>4

[0080] <210>1

[0081] <211>37

[0082] <212>DNA

[0083] <213>cyclEU

[0084] <400>1

[0085] gtacgaattc aggagccgat gccatgacga catactt 37

[0086] <210>2

[0087] <211>56

[0088] <212>DNA

[0089] <213>cyclXD

[0090] <400>2

[0091] cctctctaga ttagtggtgg tggtggtggt gcaacgatga aagataagcc gccaca 56 [0092] <210>3

[0093] <211>29

[0094] <212>DNA

[0095] <213>Ptac-1