产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用

摘要

本发明提供一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用。利用分离得到的一株微生物产生的生物表面活性来处理含油污泥，实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害的目的。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2892。使用从该微生物中提取的生物表面活性剂洗脱含油污泥，油的回收率平均为87.7％，下层泥中残留的油含量为4.1％。而以水作为对照处理中，油的回收率平均为13.9％，下层泥中残留的油含量为80.6％。除此之外，经过表面活性剂处理后油泥颜色也明显变白。

权利要求

1.一株产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BZ6-1菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2892。

2.权利要求1所述菌株在油泥洗脱中的应用，其特征在于步骤包括：

a.微生物培养：将解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株接种到发酵培养基中培养，20～25℃下

150～300rpm培养15～20h；

b.生物表面活性剂的制备：上述发酵液4℃下离心去菌体，上清液调pH至2.0，出现絮状沉淀，4℃静置过夜，再离心收集沉淀，用pH 2.0的酸水洗涤一次，随后将沉淀溶于NaOH溶液，使终pH值为7.0，冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性剂粗品；

c.提纯：将粗品置CH2Cl2中抽提，后减压蒸干，NaOH溶液溶解，形成多泡液体，滤纸过滤，滤液再次加HCl调pH至2.0，将得到的沉淀离心，得米黄色沉淀物，真空干燥去除残留水分后即为生物表面活性剂纯品；

d.油泥洗脱：向油泥中加入占油泥质量1％的生物表面活性剂纯品和占油泥质量1～

2％的氯化钠振荡，静置分层，完成洗脱。

3.根据权利要求2所述的菌株在油泥洗脱中的应用，其特征在于所述发酵培养基配方为：柠檬酸钠10g，MgSO40.2g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，FeSO40.05g，CaCl20.02g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

说明书

产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油

泥洗脱中的应用

一、技术领域

[0001] 本发明属于污染土壤修复技术领域，尤其涉及一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用。二、背景技术

[0002] 生物表面活性剂是微生物合成的具有双亲性(分子结构中同时具有亲水性和亲油性基团)的一类化合物。微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类，如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂具有降低表面张力、稳定乳化液、无毒、能生物降解等特点。

[0003] 含油污泥(简称油泥)是在石油开采、运输、炼制及含油污水处理过程中产生的含油固体废物。油泥中一般含油率在10～50％，含水率在40～90％。我国石油化学行业中，平均每年约产生80万吨罐底泥、池底泥。油泥中含有数百种有毒有害化合物，其中的有些化合物具有致畸、致癌以及致突变效应。因此，美国环保署将其中的某些物质列为优先污染物，并且对这些物质的排放有严格的限制，我国也将油泥列入国家危险废物名录。因此对沉积于污泥中的原油进行回收并减少油泥危害具有重大的经济与社会价值。三、发明内容

[0004] 发明目的：本发明提供一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用。利用分离得到的一株微生物产生的生物表面活性来处理含油污泥，实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害的目的。

[0005] 技术方案：一株产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BZ6-1菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.2892。

[0006] 上述菌株在油泥洗脱中的应用，步骤包括：微生物培养：将解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株接种到发酵培养基中培养，20～25℃下150～300rpm培养15～20h；生物表面活性剂的制备：上述发酵液4℃下离心去菌体，上清液调pH至2.0，出现絮状沉淀，4℃静置过夜，再离心收集沉淀，用pH 2.0的酸水洗涤一次，随后将沉淀溶于NaOH溶液，使终pH值为7.0，冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性剂粗品；提纯：将粗品置CH2Cl2中抽提，后减压蒸干，NaOH溶液溶解，形成多泡液体，滤纸过滤，滤液再次加HCl调pH至2.0，将得到的沉淀离心，得米黄色沉淀物，真空干燥去除残留水分后即为表面活性剂纯品；油泥洗脱：向油泥中加入占油泥质量1％的表面活性剂和占油泥质量1～2％的氯化钠振荡，静置分层，完成洗脱。

[0007] 上述发酵培养基配方为：柠檬酸钠10g，MgSO40.2g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，FeSO40.05g，CaCl20.02g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

[0008] 有益效果：使用从该微生物中提取的生物表面活性剂洗脱含油污泥，油的回收率平均为87.7％，下层泥中残留的油含量为4.1％。而以水作为对照处理中，油的回收率平均为13.9％，下层泥中残留的油含量为80.6％。除此之外，经过表面活性剂处理后油泥颜色也明显变白。四、附图说明

[0009] 图1BZ6-1菌株革兰氏染色的显微照片(×1000)；

[0010] 图2BZ6-1菌株透射电镜；

[0011] 图3m/z 1034离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；

[0012] 图4m/z 1048离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；

[0013] 图5m/z 1468离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；

[0014] 图6m/z 1482离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；

[0015] 图7m/z 1509.96离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图。五、具体实施方式

[0016] 以下结合实例对本发明作进一步的描述：

[0017] 实施例1：

[0018] 1.菌株

[0019] 产生物表面活性剂菌株BZ6-1为本实验室分离得到(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2892)。实验室保存于VGPA固体培养基斜面。

[0020] 2.BZ6-1菌株的鉴定

[0021] 培养特征及菌体形态观察：革兰氏阳性(G+)(图1)，短杆状，大小为(0.6-0.7)μm×(2.0-2.5)μm(图2)，产芽孢。

[0022] 16S rDNA基因序列测定与分析：以BZ6-1菌株基因组DNA为模板，用细菌的通用引物进行PCR扩增，扩增产物经上海博亚测序，测得16S rDNA扩增片段长度为1458bp(具体序列见下文)，这与PCR的产物的大小基本一致。在National Center Biotechnology Information(NCBI)使用BLASTN程序进行比对和对16S rDNA基因序列相似性进一步分析，表明BZ6-1菌株与Bacillus spp.聚为一类，且与登陆号为NC009725的Bacillus amyloliquefaciens菌株亲缘关系最近，同源性超过99％。

[0023] 结合BZ6-1菌株的形态特征，将BZ6-1菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

[0024] CGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCAC[0025] CGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA[0026] ACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGA[0027] GTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTT[0028] TCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGA[0029] TGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCC[0030] AACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT[0031] CTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA[0032] CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTT[0033] CGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAG[0034] TCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGC[0035] GGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATC[0036] CTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTC[0037] GCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTC[0038] CTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTT[0039] CACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGC[0040] TTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGG[0041] TACCGtCAaGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTAC[0042] GATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGG[0043] AAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGC[0044] CGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACT[0045] AGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAAC[0046] CATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTA[0047] CAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCC[0048] CATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATAGC

[0049] 3.培养基

[0050] VGPA固体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

[0051] 发酵培养基：柠檬酸钠10g，MgSO40.2g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NH4NO31.0g，FeSO40.05g，CaCl20.02g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

[0052] 以上培养基均在121℃灭菌20min。

[0053] 4.生物表面活性剂的发酵生产

[0054] 从一支保存解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的斜面试管挑取一环接种到发酵培养基，100mL/250mL三角瓶，22℃下200rpm培养18h。此时的发酵液即含有生物表面活性剂。

[0055] 5.生物表面活性剂的提取、纯化与鉴定

[0056] 发酵液4℃下10000r min-1离心10min去菌体，上清液用浓HCl调pH至2.0，出现-1絮状沉淀，4℃静置过夜，10000r min 离心10min收集沉淀，用pH 2.0的酸水洗涤一次、随后将沉淀溶于NaOH溶液，使终pH值为7.0，冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性剂粗品。

[0057] 纯化时，将粗品置CH2Cl2中抽提，后减压蒸干，稀NaOH溶液溶解，形成多泡液体，用WhatmanNo.4滤纸过滤，滤液再次加HCl调pH至2.0，将得到的沉淀离心，得米黄色沉淀物，真空干燥去除残留水分后即为表面活性剂纯品。该物质经过HPLC-MS鉴定包含表面活性素(surfactin)和芬荠素(fengycin)的脂肽类物质。

[0058] 鉴定材料

[0059] Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由β-羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的β-羟基缩合形成环状结构(Peypoux等，1994)。根据文献(孙力军，2006)研究表明肽链上7位氨基酸为Leu时，CID谱图中有+m/z707的特征碎片离子峰，它可以解释为[LeuLeuValAspLeuLeu+H2O+Na]，可以以此判定surfactin[7Leu]同系物的特征离子峰。本研究中m/z1034(图3)和1048(图4)，与脂肽类物质Surfactin较相似，通过MS/CID谱进行分析，在二级质谱中，两种物质均存在m/z 707特征碎片离子峰。除此之外，还有m/z 463和m/z 594特征碎片离子峰，由此可以推断1034和1048为肽链上7位氨基酸为Leu的Surfactin。

[0060]

[0061] Surfactin A的结构

[0062]

[0063] Surfactin B的结构

[0064] 脂肽fengycin线性结构分析

[0065] 刘慧敏等(2000)和陈晶等(2002)研究认为抗菌脂肽的合成是由于多个肽合成酶组成的巨大复合物NRPS(non-ribosomal peptide synthetases)，通过一种称为“多载体硫模板机制(Multiple Carrier Thiotemplate Mechanism)”的方式来合成的。孙力军(2006)利用此原理推测出Fengycin A的中间体，线性结构脂肽。本研究中在m/z 1468，1482，1509.96中均有1098和984等y型特征离子碎片(图5～7)，它们分别可以解释为分子结构中从N末端丢失了脂肪酸和相邻的Glu，以及Glu-Orn。同时1468，1482，1509.96之间相差14，表明脂肪酸链中相差-CH2-。由此可以推断，此三种物质为15C、16C和18C脂肪酸的线性结构脂肽。

[0066] 线性脂肽分子结构CID分析：

[0067]

[0068] 6.油泥的采集与油含量的测定

[0069] 供试油泥来源于胜利油田。采用重量法测定油泥中的含油量。具体方法是：将5g风干过2mm筛的油泥与等体积的无水Na2SO4混匀，然后用称重的茄型瓶装入70mL三氯甲烷，75℃下经索氏提取24h。然后将抽提液在减压旋转蒸发仪上减压蒸干，重新称量茄型瓶计算出总油含量。

[0070] 7.油泥的洗脱实验

[0071] 取新鲜油泥20g(油泥性质见表1)，加入表面活性剂粗品0.2g，2wt％氯化钠溶液150mL放入250mL三角瓶，35℃200rpm振荡72h，然后静置1h。此时发现摇瓶中的泥、油、液体界面分离明显，出现清晰的上(油)、中(水)、下(泥)三层大量的浸出油漂浮在液面上，回收漂浮在液面的原油，同时将下层泥取出风干测定其中油含量，洗脱效果见表2。经过该方法洗脱含油污泥，油的回收率平均为87.7％，下层泥中残留的油含量为4.1％。而以水作为对照处理中，油的回收率平均为13.9％，下层泥中残留的油含量为80.6％。除此之外，经过表面活性剂处理后油泥颜色也明显变白。

[0072] 表面活性剂与氯化钠的加入减少了泥砂对油的粘附力与静电力作用，使油与泥砂等颗粒分离，从而实现提高原油回收率和减少油泥污染的目的。

[0073] 表1实验所用油泥性质

[0074]新鲜油泥 湿重(g) 干重(g) 含油量(g) 含油率(％)
1 20 11.58 3.59 31.0
2 20 11.62 4.60 39.5
3 20 11.42 3.53 30.9
平均值 20 11.54 3.91 33.9

[0075] 表2不同处理对油泥的洗脱效果

[0076]

[0077] 回收率＝上层油重量/实验用油泥总含油量×100％

[0078] 残油率＝下层油泥含油量/下层油泥干重×100％