一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法

摘要

本发明公开了一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括：以提取的绵羊血液基因组DNA为模板，使用寡核苷酸作为引物，通过巢式PCR方式扩增外侧引物；稀释扩增产物，并以得到的扩增产物稀释物为模板，以所述序列A作为上游引物，使用序列C～序列L作为下游引物，通过ARMS-PCR扩增外侧引物，分别进行密码子136、154和171不同基因型突变位点的检测；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，记录扩增条带的有无，判断并确定基因型。本发明所述分型方法，可以克服现有技术中成本高、检测时间长和精确性差等缺陷，以实现成本低、检测时间短、并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性基因型(ARR/ARR)频率的优点。

权利要求

1.一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：a、提取绵羊血液基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，使用寡核苷酸作为引物，通过巢式PCR方式扩增外侧引物；

其中，所述寡核苷酸包括以下序列表：

序列A SHP-P1 5′GCATGTGGCAGGAGCTGCTG 3′；

序列B SHP-P2 5′AGTTTCGGTGAAGTTCTCCCCCTTG 3′；

b、稀释步骤a得到的扩增产物，获得扩增产物稀释物，以所述扩增产物稀释物为模板，以所述序列A作为上游引物，并使用序列C～序列L作为下游引物，通过ARMS-PCR扩增外侧引物，并分别进行密码子136、154和171不同基因型突变位点的检测；

其中，所述密码子136包括密码子136A、136V和136T，所述密码子154包括154R、154H和154L，所述密码子171包括171Q、171R、171K和171H；

所述序列C～序列L具体如下：

序列C 136A 5′TGTAGGCCTGCTCATAGC 3′；

序列D 136V 5′TAGCTAGGCCTGCTCAAGA 3′；

序列E 136T 5′GCTAGGCCTGCTCATTGT 3′；

序列F 154R 5′GCTCAACGGTACATGTTTTCAC 3′；

序列G 154H 5′CGCTAACGGTACATGTTTTGAT 3′；

序列H 154L 5′CCTCAACGGTACATGTTTTCAA 3′；

序列I 171Q 5′TGCGACGTCTGGTTACTATCCTG 3′；

序列J 171R 5′CTGCTACGTCTGGTTACTATGCC 3′；

序列K 171K 5′TGTTCGACGTCTGGTTACTATATTT 3′；

序列L 171H 5′CTGCGACGTCTGGTTACTGCAA 3′；

c、对步骤b得到的扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，记录特异性扩增条带的有无，并判断基因型；具体记录参见下表：d、当出现步骤c中Example 18～Example 22情况时，对步骤a得到的扩增产物进行TA克隆，以随机挑选的无色透明菌落为模板，进行菌落PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，在步骤a中，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；

所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq 12.5μL，基因组DNA

1.5μL，SHP-P1和SHP-P2引物各1.3μL，以及dd H2O 8.4μL；

将所述Ex Premix Taq、所述基因组DNA、所述SHP-P1和SHP-P2引物、以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变45s，60℃退火45s，72℃延伸

45s，共35个循环；72℃延伸8min。

3.根据权利要求2所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，在得到所述PCR扩增产物之后，还包括：使用15g/L的琼脂糖凝胶，对所述PCR扩增产物进行电泳检测。

4.根据权利要求1所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；

所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq 12.5μL，SHP-P1引物

1.3μL，136A引物1.3μL，136V引物1.3μL，136T引物1.3μL，154R引物1.3μL，154H引物1.3μL，154L引物1.3μL，171Q引物1.3μL，171R引物1.3μL，171K引物1.3μL，171H引物1.3μL，以及dd H2O 8.9μL；

将所述Ex Premix Taq、所述SHP-P1引物，所述136A引物，所述136V引物，所述136T引物，所述154R引物，所述154H引物，所述154L引物，所述171Q引物，所述171R引物，所述171K引物，所述171H引物，以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性

5min；94℃预变30s，序列C～序列E 63℃退火30s、序列F～序列L 65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min。

5.根据权利要求4所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于：所述136A引物、136V引物和136T引物扩增模板的稀释浓度为1/600；

所述154R引物、154H引物和154L引物扩增模板的稀释浓度为1/800；

所述171Q引物、171R引物、171K引物和171H引物扩增模板的稀释浓度为1/1000；

其中，各引物模板的体积均为1.0μL。

6.根据权利要求1所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；

所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq 12.5μL，SHP-P1引物和SHP-P2引物1.0μL，以及dd H2O的体积为10.5μL；

将所述Ex Premix Taq，所述SHP-P1引物，所述SHP-P2引物，以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共

35个循环；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物。

7.根据权利要求6所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，使用

15g/L琼脂糖凝胶，对所述PCR扩增产物进行电泳检测。

8.根据权利要求1所述的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，其特征在于，该方法还包括：根据步骤c得到的检测结果，确定基因型。

说明书

一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因的分型技术，具体地，涉及一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法。

背景技术

[0002] 朊病毒(Prion)是一种新型的蛋白质感染因子，可引起人和动物的一类传染性神经退行性疾病，即传染性海绵样脑病(TSEs)，其中以羊痒病(Scrapie)、牛海绵样脑病(BSE)和人克-雅氏病(CJD)研究较多。“惟蛋白”假说认为TSEs是人和动物常染色体上C Sc单拷贝基因所编码的细胞型朊蛋白(PrP)变构为痒病型朊蛋白(PrP )所致。由于朊病毒病(priondisease)的严重危害性及其致病机理和致病型朊蛋白形成机制的特殊性和不明确性，使朊病毒及朊病毒病成为生命科学研究关注的热点。研究主要集中在PrP和其基因[1] [2～4] Sc
结构 、PrP的遗传与调控及其生理功能和参与其他疾病的致病作用 、致病性PrP 的[5～7]
形成和其致病机理、朊病毒病传播的种间屏障以及TSEs的发病机制、遗传性和易感性等方面，尤其PrP三维结构与变异的关系、PrP构象改变机制、PrP生理功能及参与其他疾病Sc
的作用、PrP 增殖机制和其致病机理以及TSEs发生的遗传机制及其防治等已成为生命科学研究的一个重要前沿领域。

[0003] TSEs是一类人和动物共患的遗传性、传染性或散发性疾病，人与绵羊、牛等动物的TSEs与其PRNP(英文全称prion protein gene)基因的某些点突变或插入/缺失(indel)[8～11]突变相连锁 ，绵羊痒病的发生、发病率、易感性、潜伏期以及临床症状发展和存活期等[11～15]
决定于PRNP基因多态性，尤其与密码子136、154和171等位基因型密切关联 。依此
3个密码子，至少已确定22个PRNP等位基因型。在常见的PrPARQ、VRQ、ARH、ARR和AHQ等位基因中，PrPARR、AHQ与抗痒病有关，PrPVRQ、ARQ、ARH与痒病易感性相关。

[0004] 目前公认，ARR/ARR为痒病抗性基因型、VRQ/VRQ和ARQ/ARQ为高危基因型，ARR/VRQ为易感基因型、ARR/ARQ和ARR/ARH为半抗性基因型，但ARH、AHQ等位基因的抗性/易[11～15]感性与另一等位基因相关联 。因此，降低痒病易感性相关PRNP基因型频率，增加抗[11～13，15]
性相关PRNP基因型频率，是提高绵羊痒病抗性的一个可行选择 。据此，欧盟成员国及美国等西方国家已选择抗痒病ARR/ARR基因型绵羊个体，实施绵羊抗痒病育种计划并取[11～15]
得初步成效 。国内对绵羊PRNP等位基因型的初步研究显示，存在PrPARQ、ARH、AHQ、[16～19]
AHR和ARR等位基因，也表明我国绵羊以痒病易感等位基因型群体为主 。

[0005] 随着我国经济的快速增长，对TSEs等重大人兽共患病的危害性认识逐渐加深，绵羊痒病的重视程度日渐提高，国家农业部也在2009年“转基因生物新品种培育重大专项”中列出抗痒病绵羊新品种培育研究，然而转基因抗痒病育种技术难度大、风险高、需巨额资金，育成的抗痒病绵羊个体数量有限，难以在不同绵羊品种中推广应用。因此，选择ARR/ARR基因型绵羊培育抗痒病绵羊种群，具有技术难度小、风险低、费用少和易于推广应用的优势，应为我国目前绵羊抗痒病育种的首选方法。

[0006] 选择ARR/ARR基因型绵羊个体进行抗痒病绵羊培育，其核心技术就是绵羊PRNP密码子136、154和171等位基因分型技术。目前，国内外绵羊PRNP等位基因分型多采用变[20～22]性梯度凝胶电泳法(DGGE)、SSCP-PCR和荧光定量法等技术 ，这些技术均具有耗时、费力、费用高、技术难度大和实验条件要求高等缺点，成为制约绵羊抗痒病育种计划在我国实施和推广的瓶颈。

[0007] 可见，需要建立一种绵羊PRNP等位基因密码子136、154和171简便、快速、价廉和高通量的分型技术，以满足我国实施和推广绵羊抗痒病育种计划的先决条件，并可为大量进行绵羊PRNP等位基因型频度分析、痒病风险性评估以及绵羊抗痒病育种计划实施和抗痒病群体监测提供可靠的技术平台。

[0008] 在现有技术中，用于绵羊PRNP等位基因多态性和分型研究的技术主要包括以下几种：

[0009] 1、直接测序法在绵羊基因多态性研究中应用比较广泛。对于绵羊PRNP，这种方法可以检测到PRNP外显子3编码的136、154和171密码子区域，是最准确的方法，它能够检出已知的和未知的多态性。该法虽能直接检出基因中的未知突变，但其测序耗时费力，对于大量筛选来说并不适用；

[0010] 2、PCR-等位基因特异性杂交(PCR-allele specific oligonucleotide，PCR-ASO)法，即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可确定是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子。PCR-ASO法耗时耗力，而且需要使用放射性探针，实验成本很高，并需要有与此相关的仪器设备；

[0011] 3、PCR-RFLP分析法在绵羊PRNP单倍型的分析中较多使用，可以检出未知突变。由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性。限制性片段长度多态性分析要经历长片段的限制性消化，在此过程中极有可能产生错误消化而产生不正确的分析结果，且不能用于等位基因的分型研究，有很大缺陷；

[0012] 4、变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，简称DGGE)法分析PCR产物，具有很高的灵敏度，甚至其检出率可达100％，检测片段最大不超过1kb，最适围为100～500bp。由于本法是利用温度和梯度凝胶中的PCR产物迁移率来分析，需要一套专用的电泳装置。在DGGE的基础上，又发展了用温度梯度代替化学变性剂的温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，简称TGGE)法。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。但此法对操作技术有较高要求，需要具有专业经验的人员操作，人为的影响因素较多；

[0013] 5、引物延伸法(Primer extension assay)以测序原理为基础，具有测序反应的高准确性，较直接测序法简单、快速，结果判定简单、快速且自动化，需要专门为PRNP基因分型研究开发的计算机软件。但这也恰恰给一部分研究者造成了困难，加之测序成本高，只能检出已知位点突变，使其在绵羊PRNP等位基因多态性及基因分型研究中应用受到限制；

[0014] 6、PCR-单链构象多态性(PCR-single strand conformationalpolymorphism，简称PCR-SSCP)分析是将PCR和SSCP技术相结合的一种基于单链DNA构象差异来检测点突变的方法。PCR产物经热或化学变性后形成单链DNA后，在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于由DNA单链自身折叠所形成的构象。相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，因而电泳迁移率不同。靶DNA中发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，从而揭示该片段有基因变异存在。用PCR-SSCP法对绵羊PRNP等位基因进行分析时，杂合子会呈现出三条或四条带，纯合子只出现两条带，而且不同等位基因型在同条件下条带出现的位置会有所差异；出现突变位点时会因为碱基的置换或颠换而引起单链构象的改变，最终引起条带迁移率的差异而区别不同突变位点。此方法可检测未知突变且操作简单、不需昂贵的仪器设备，故在绵羊PRNP等位基因多态性检测中可被广泛应用；

[0015] 7、在绵羊PRNP等位基因多态性分析及其突变位点检测中，还有一些技术方法在特定研究却较多使用。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，是一种具有高通量的基因分型法；等位基因专一性扩增法，这种方法要预测一个样品的多个PCR反应，试验步骤繁琐，要根据不同的基因型设计不同的引物；双重探针法，这种方法要设计用放射性同位素标记或非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等标记的寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定，由于需要相应的检测设备，并合成价格不菲的探针，许多人不采用本法。

[0016] 综上所述，在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中至少存在以下缺陷：

[0017] (1)成本高：PCR-ASO法需要使用放射性探针和与此相关的仪器设备，实验成本较高；引物延伸法的测序成本较高；双重探针法，需合成价格不菲的探针及相应的检测设备，许多人不采用本法；

[0018] (2)检测时间长：直接测序法测序耗时费力，对于大量筛选来说并不适用；PCR-ASO法也需要花费较长的时间和精力；等位基因专一性扩增法，试验步骤繁琐；
PCR-SSCP的检测时间长，检测通量低；

[0019] (3)精确性差：PCR-RFLP分析法，可以检出未知突变，但极有可能产生错误消化而产生不正确的分析结果，且不能用于等位基因的分型研究；变性梯度凝胶电泳法分析可以PCR产物，但对操作技术有较高要求，人为影响因素较多。

发明内容

[0020] 本发明的目的是针对现有技术中成本高、检测时间长和精确性差的缺陷，提出一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，以实现成本低、检测时间短的优点，并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率。

[0021] 为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括以下步骤：

[0022] a、提取绵羊血液基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，使用寡核苷酸作为引物，通过巢式PCR方式扩增外侧引物；其中，所述寡核苷酸包括以下序列表：

[0023] 序列A SHP-P 15′GCATGTGGCAGGAGCTGCTG 3′；

[0024] 序列B SHP-P25′AGTTTCGGTGAAGTTCTCCCCCTTG 3′；

[0025] b、稀释步骤a得到的扩增产物，得到扩增产物稀释物，以所述扩增产物稀释物为模板，以所述序列A作为上游引物，并使用序列C～序列L作为下游引物，通过ARMS-PCR扩增外侧引物，并分别进行密码子136、154和171不同基因型突变位点的检测；其中，所述密码子136包括密码子136A、136V和136T，所述密码子154包括154R、154H和154L，所述密码子171包括171Q、171R、171K和171H；

[0026] 所述序列C～序列L具体如下：

[0027] 序列C 136A 5′TGTAGGCCTGCTCATAGC 3′；

[0028] 序列D 136V 5′TAGCTAGGCCTGCTCAAGA 3′；

[0029] 序列E 136T 5′GCTAGGCCTGCTCATTGT 3′；

[0030] 序列F 154R 5′GCTCAACGGTACATGTTTTCAC 3′；

[0031] 序列G 154H 5′CGCTAACGGTACATGTTTTGAT 3′；

[0032] 序列H 154L 5′CCTCAACGGTACATGTTTTCAA 3′；

[0033] 序列I 171Q 5′TGCGACGTCTGGTTACTATCCTG 3′；

[0034] 序列J 171R 5′CTGCTACGTCTGGTTACTATGCC 3′；

[0035] 序列K 171K 5′TGTTCGACGTCTGGTTACTATATTT 3′；

[0036] 序列L 171H 5′CTGCGACGTCTGGTTACTGCAA 3′；

[0037] c、对步骤b得到的扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，记录扩增条带的有无，并判断基因型；具体记录参见下表：

[0038]

[0039]

[0040] d、当出现步骤c中Example 18～Example 22情况时，对步骤a得到的扩增产物进行TA克隆，以随机挑选的无色透明菌落为模板，进行菌落PCR扩增。

[0041] 进一步地，在步骤a中，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq12.5μL，基因组DNA 1.5μL，SHP-P1和SHP-P2引物各1.3μL，以及dd H2O8.4μL；将所述Ex Premix Taq、所述基因组DNA、所述SHP-P 1和SHP-P2引物、以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸8min。

[0042] 进一步地，在得到所述PCR扩增产物之后，还包括：使用15g/L的琼脂糖凝胶，对所述PCR扩增产物进行电泳检测。

[0043] 进一步地，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq 12.5μL，SHP-P1引物1.3μL，136A引物1.3μL，136V引物1.3μL，136T引物1.3μL，154R引物1.3μL，154H引物1.3μL，154L引物1.3μL，171Q引物1.3μL，171R引物1.3μL，171K引物1.3μL，171H引物1.3μL，以及dd H2O 8.9μL；将所述Ex Premix Taq、所述SHP-P1引物，所述136A引物，所述136V引物，所述136T引物，所述154R引物，所述154H引物，所述154L引物，所述171Q引物，所述171R引物，所述171K引物，所述171H引物，以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min。

[0044] 进一步地，所述136A引物、136V引物和136T引物扩增模板的稀释浓度为1/600；所述154R引物、154H引物和154L引物扩增模板的稀释浓度为1/800；所述171Q引物、171R引物、171K引物和171H引物扩增模板的稀释浓度为1/1000；其中，各引物模板的体积均为
1.0μL。

[0045] 进一步地，所述扩增体系包括总体积为25μL的PCR反应体系；所述PCR反应体系进一步包括：TaKaRa公司Ex Premix Taq 12.5μL，SHP-P1引物和SHP-P2引物1.0μL，以及dd H2O的体积为10.5μL；将所述Ex PremixTaq，所述SHP-P1引物，所述SHP-P2引物，以及所述dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物。

[0046] 进一步地，使用15g/L琼脂糖凝胶，对所述PCR扩增产物进行电泳检测。

[0047] 进一步地，该方法还包括：根据步骤c得到的检测结果，确定基因型。

[0048] 本发明各实施例的绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括以下关键步骤：提取绵羊血液基因组DNA；设计巢式外侧引物，进行大片段扩增；稀释大片段扩增的产物，进行不同基因型特异性引物扩增；琼脂糖凝胶电泳检测，并在表格中记录基因型判定结果。本实施例的方法适用于绵羊PRNP等位基因密码子136、154和171的分型，适宜于普通实验室操作，每样基因型的判定费用大约为18元人民币，可以大大降低研究成本；可以采用试剂盒法提取基因组，包含试剂盒法提取基因组在内，实验周期不超过7小时，可以大大缩短检测周期；并且，本实施例易于推广，可以作为绵羊抗痒病育种中提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率的关键技术，可以克服现有技术中成本高、检测时间长和精确性差的缺陷，以实现成本低、检测时间短、并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率的优点；从而可以克服现有技术中成本高、检测时间长和精确性差的缺陷，以实现成本低、检测时间短、并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率的优点。

[0049] 本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书和权利要求书中所特别指出的结构来实现和获得。

具体实施方式

[0050] 下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

[0051] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

[0052] 本发明的基本思想：考虑到引物3′末端碱基对扩增有着重要影响，根据阻滞扩增原理，在3′末端的倒数第2、或倒数第3个碱基处人为引入错配，可以增加3′末端的不稳定性，明显提高分辨率；并且，在区分不同基因的引物序列时，引入的碱基类型不同。本发明是基于扩增受阻突变体系(Amplification refractory mutation system，简称ARMS)的原理，结合绵羊PRNP等位基因型各核苷酸突变位点建立。

[0053] 实施例一

[0054] 本实施例适用于步骤103表2中Example 1～Example 17的情形。

[0055] 基于本发明的基本思想，在本实施例中，提供了一种绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括以下步骤：

[0056] 步骤101：提取绵羊血液基因组脱氧核糖核酸(即DNA)，以该血液基因组DNA为模板，使用下列寡核苷酸作为引物，进行大片段聚合酶链式反应扩增，即通过巢式PCR方式扩增外侧引物。

[0057] 这里，提取绵羊全血基因组DNA，提取方法无特殊要求，最好是选择离心柱型全血基因组DNA提取试剂盒(国产、进口均可，为降低成本，可选择国产试剂盒或手工提取法)。

[0058] 其中，寡核苷酸作为一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸，包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸；寡核苷酸可以很容易地与其互补对链接，可以用来作为探针，确定DNA或RNA的结构，也经常用于基因芯片、电泳和荧光原位杂交等过程中；进一步的，寡核苷酸合成的DNA可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有DNA的片段，在链聚合反应的过程中，寡核苷酸可以作为引物，和DNA中对应的互补片段结合，得到DNA的复制品。

[0059] 在步骤101中，寡核苷酸包括序列A和序列B，序列A和序列B的具体如下：

[0060] 序列A SHP-P1 5′AGCTGGAGCAGTGGTAGGG 3′；

[0061] 序列B SHP-P2 5′CATTATCTTGATGTCAGTTTCG 3′；

[0062] 在步骤101中，巢式PCR反应的总体积为25μL，其中，TaKaRa公司Ex Premix Taq的体积为12.5μL，基因组DNA的体积为1.5μL(即50pmol/L)，SHP-P1和SHP-P2引物的体积分别为1.3μL(即10pmol/L)，dd H2O的体积为8.4μL。将Ex Premix Taq、基因组DNA、SHP-P1引物、SHP-P2引物和dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变；45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物；之后将该PCR扩增产物经15g/L的琼脂糖凝胶电泳进行检测；

[0063] 步骤102：稀释步骤101得到的扩增产物，将稀释后的扩增产物作为扩增模板，使用“序列C～序列L”作为下游引物，以“序列A”作为上游引物，分别进行密码子136(即136A、136V和136T)、154(即154R、154H和154L)和171(即171Q、171R、171K和171H)不同基因型突变位点的检测。

[0064] 在步骤102中，巢式PCR反应的总体积为25μL，其中，TaKaRa公司Ex Premix Taq的体积为12.5μL，dd H2O的体积为8.9μL。将Ex Premix Taq和dd H2O离心混匀后，置于PCR扩增仪中，94℃预变性5min；94℃预变30s，63℃或65℃退火30s(序列C～序列E的退火温度为63℃，序列F～序列L的退火温度为65℃)，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min。

[0065] 在步骤102中，其它的扩增参数包括：

[0066] (1)以基因组扩增产物为模板进行ARMS-PCR扩增时，引物不同适宜的模板浓度有所差异，其扩增的退火温度为63℃或65℃(序列C～序列E的退火温度为63℃，序列F～序列L的退火温度为65℃)。

[0067] (2)引物136A、136V和136T扩增模板的稀释浓度为1/600；引物154R、154H和154L扩增模板的稀释浓度为1/800；引物171Q、171R、171K和171H扩增模板的稀释浓度为
1/1000；各引物模板的体积均为1.0μL。

[0068] (3)扩增时上游引物和下游引物的体积分别为1.3μL(10pmol/L)，其中，序列C～序列L具体如下：

[0069] 序列C 136A 5′TGTAGGCCTGCTCATAGC 3′；

[0070] 序列D 136V 5′TAGCTAGGCCTGCTCAAGA 3′；

[0071] 序列E 136T 5′GCTAGGCCTGCTCATTGT 3′；

[0072] 序列F 154R 5′GCTCAACGGTACATGTTTTCAC 3′；

[0073] 序列G 154H 5′CGCTAACGGTACATGTTTTGAT 3′；

[0074] 序列H 154L 5′CCTCAACGGTACATGTTTTCAA 3′；

[0075] 序列I 171Q 5′TGCGACGTCTGGTTACTATCCTG 3′；

[0076] 序列J 171R 5′CTGCTACGTCTGGTTACTATGCC 3′；

[0077] 序列K 171K 5′TGTTCGACGTCTGGTTACTATATTT 3′；

[0078] 序列L 171H 5′CTGCGACGTCTGGTTACTGCAA 3′；

[0079] 在步骤102中，绵羊PRNP等位基因分型引物具体参见表1。

[0080] 表1：绵羊PRNP等位基因分型引物

[0081] (Table 1：Primers used for ovine PRNP allele typing)

[0082]

[0083] 具体的，在步骤102中，根据序列A，序列B合成引物(引物合成无特殊要求，普通合成就可)。按照扩增反应体系1进行加样，按照扩增程序1进行扩增。(此处序列A，序列B在步骤101中)

[0084] 扩增反应体系1

[0085]扩增反应物 反应物要求 反应物量
模板 绵羊血液基因组DNA 1.5μL(约50pmol/L)
酶 Ex Premix Taq(TaKaRa公司) 12.5μL
引物 序列A，序列B 各1.3μL(10pmol/L)
H2O 去离子水 8.4μL
扩增体系 25.0μL

[0086] 扩增程序1

[0087]

[0088] 进一步地，在步骤102中，以序列A为上游引物，分别以序列C～序列L为下游引物，以步骤102中的扩增产物的稀释物为扩增模板(引物136A、136V和136T扩增模板的稀释浓度为1/600；引物154R、154H和154L扩增模板的稀释浓度为1/800；引物171Q、171R、171K和171H扩增模板的稀释浓度为1/1000)，按照扩增体系2加样，按照扩增程序2进行扩增，并在表2中记录基因型，其中，判型方法见不同情况的举例说明。

[0089] 扩增反应体系2

[0090]扩增反应物 反应物要求 反应物量
模板 步骤102中各扩增产物稀释物 1.0μL
酶 Ex Premix Taq(TaKaRa公司) 12.5μL
上游引物 序列A 各1.3μL(10pmol/L)
下游引物 序列C～序列L 各1.3μL(10pmol/L)
H2O 去离子水 8.9μL
扩增体系 25.0μL

[0091]

[0092] 扩增程序2

[0093]

[0094] 步骤103：记录检测结果，并判定基因型，即：将步骤102得到的扩增产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳检测，在表2中记录扩增条带的有无，并判断基因型。

[0095] 表2：绵羊PRNP等位基因判定表

[0096]

[0097]

[0098]

[0099] 在判型时，包含了迄今所有的绵羊PRNP等位基因型，即表中的Example 1～Example 22。其中，Example 1～Example 17的判型方法相同。

[0100] 实施例二

[0101] 本实施例中基于上述实施例，适用于上述步骤103表2中Example18～Example22的情形。

[0102] 在本实施例中，具体包括以下步骤：

[0103] 步骤201：按照实施例一中步骤101～步骤103的方法进行操作，可参见实施例一中的相关说明，在此不再赘述；

[0104] 步骤202：纯化回收实施例一中步骤102的扩增产物，并连接于T载体，转化于感受态细胞；

[0105] 步骤203：挑选无色透明菌落，按照扩增反应体系3进行加样，按照扩增程序3进行扩增。

[0106] 扩增反应体系3

[0107]扩增反应物 反应物要求 反应物量
模板 无色透明菌落 -
酶 Ex Premix Taq(TaKaRa公司) 12.5μL
引物 序列A，序列B 各1.0μL(10pmol/L)
H2O 去离子水 10.5μL
扩增体系 25.0μL

[0108] 扩增程序3

[0109]

[0110] 步骤204：以序列A为上游引物，分别以序列C～序列L为下游引物，以步骤203中的扩增产物的稀释物为扩增模板(引物136A、136V和136T扩增模板的稀释浓度为1/600；引物154R、154H和154L扩增模板的稀释浓度为1/800；引物171Q、171R、171K和171H扩增模板的稀释浓度为1/1000)，按照扩增体系4加样，按照实施例1中扩增程序2进行扩增，并在表2中记录基因型，其中，判型方法见不同情况的举例说明。

[0111] 扩增反应体系4

[0112]扩增反应物 反应物要求 反应物量
模板 步骤203中各扩增产物稀释物 1.0
酶 Ex Premix Taq(TaKaRa公司) 12.5μL
上游引物 序列A 1.3μL(10pmol/L)
下游引物 序列C～序列L 各1.3μL(10pmol/L)
H2O 去离子水 8.9μL
扩增体系 25.0μL

[0113] 对于Example 18～Example 22的已知基因型各情况，根据本实验室的研究数据以及国内外研究数据的二次统计，其发生的几率总和应小于1％。

[0114] 实施例三

[0115] 在本实施例中，具体包括以下步骤：

[0116] 步骤301：按照实施例一中步骤101～步骤103的方法进行操作，可参见实施例一中的相关说明，在此不再赘述；

[0117] 步骤302：按照实施例二中步骤201～步骤204的方法进行操作，可参见实施例二中的相关说明，在此不再赘述；

[0118] 步骤303：在上述步骤均未扩出条带者，改用PCR-SSCP法[参照文献1、文献2]测定其PRNP等位基因型。

[0119] 文献1：赵春林.滩寒杂交羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究[D].兰州：甘肃农业大学，2008.

[0120] 文献2：赵春林，王川，吴润，等.绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化.中国兽医科学，2008，38(8)：721-727.

[0121] 本实施例发生的几率极小或是为零，仅在理论上有出现的可能，PCR-SSCP分析仅作为本发明的补充，并不影响ARMS-PCR快速分型法对绵羊PRNP等位基因密码子136、154和171的基因分型。

[0122] 本发明各实施例绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，包括以下关键步骤：提取绵羊血液基因组DNA；设计巢式外侧引物，进行大片段扩增；稀释大片段扩增的产物，进行不同基因型特异性引物扩增；琼脂糖凝胶电泳检测，并在表格中记录基因型判定结果。本实施例的方法适用于绵羊PRNP等位基因密码子136、154和171的分型，适宜于普通实验室操作，每样基因型的判定费用少于20元人民币，可以大大降低研究成本；可以采用试剂盒法提取基因组，包含试剂盒法提取基因组在内，实验周期不超过7小时，可以大大缩短检测周期；并且，本实施例易于推广，可以作为绵羊抗痒病育种中，提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率的关键技术，可以克服现有技术中成本高、检测时间长和精确性差的缺陷，以实现成本低、检测时间短、并有利于提高绵羊PRNP痒病抗性的基因型(ARR/ARR)频率的优点。

[0123] 本发明绵羊PRNP等位基因密码子的分型方法，可检测迄今出现的22种绵羊PRNP密码子136、154和171等位基因型，并且在理论上，在针对基因型的10对引物之内，任何未知基因型也可被检测；对于其他未知基因型，基本不可能出现，或是出现的概率极小，并不影响本发明对绵羊PRNP等位基因的分型准确性。

[0124] 综上所述，本发明各实施例中，PCR-SSCP分析法原理简单，无需合成任何探针，不需高昂仪器，可在普通实验室操作，但因相对成本较大(相对于本发明)，其应用受到限制，不能作为基层进行PRNP基因型普查的推广技术，也不适用于绵羊抗抗病育种的选育工作；与PCR-SSCP分析法相比，本发明显然具有成本低、检测速度快等优势，不需要特殊仪器，仅需PCR及其相关试剂就可进行绵羊PRNP等位基因基因型检测，即具有以下有益效果：

[0125] (1)可大大降低检测成本：本发明中的ARMS-PCR仅需要提取基因组DNA、引物合成、扩增、Ex Premix Taq以及少量耗材，计入合理重复试验，其成本可控制在20元人民币以内；而PCR-SSCP除上述试剂盒耗材外，还需进行TA克隆、DNA序列测定(每个杂合子测2条序列，每个纯合子需测1条序列)、丙烯酰胺凝胶电泳、阳性克隆菌的培养等费用，其成本远远高出本发明，可达100元人民币。

[0126] (2)可大大提高检测速度和检测通量：本发明较PCR-SSCP分析法的96小时/单次的检测速度缩短为7小时/单次，大大提高了检测速度；本发明中使用1台96孔PCR仪，1个人操作，每天可检测36个样品，其检测通量为36份/单人次·天；使用1台PCR仪，1台电泳仪，1台双面垂直电泳槽(单面25个加样空孔)，经合理统筹后用PCR-SSCP法可达
4份/单人次·天的检测通量。本发明在检测速度和检测通量方面，均具极大优势。

[0127] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0128] 参考文献：

[0129] [1]Wickner R B，Shewmaker F，Kryndushkin D，et al.Protein inheritance(prions)based on parallel in-register beta-sheet amyloid structures[J].Bioessays，2008，30(10)：955-64.

[0130] [2]Pan Y，Zhao L，Liang J，et al.Cellular prion protein promotes invasion andmetastasis of gastric cancer[J].FASEB J，2006，20(11)：1886-1888.[0131] [3]Thackray A M，Bujdoso R.Elevated PrPC expression predisposes toincreased HSV-1pathogenicity[J].Antivir Chem Chemother，2006，17(1)：41-52.[0132] [4]Linden R，Martins V R，Prado M A，et al.Physiology of the prionprotein[J].Physiol Rev，2008，88(2)：673-728.

[0133] [5]Unterberger U， T.The pathogenic mechanisms ofpriondiseases[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2007，6(6)：424-55.[0134] [6]Béringue V，Vilotte J L，Laude H.Prion agent diversity and speciesbarrier[J].Vet Res，2008，39(4)：47.

[0135] [7]Fontaine S N，Brown D R.Mechanisms of prion protein aggregation[J].Protein Pept Lett，2009，16(1)：14-26.

[0136] [8]Goldmann W.PrP genetics in ruminant transmissiblespongiformencephalopathies[J].Vet Res，2008，39(4)：30.

[0137] [9]Kerber A R，Hepp D，Passos D T，et al.Polymorphisms of Two Indels atthe PRNP Gene in Thtee Beef Cattle Herds[J].Biochem Genet，2008，46(1-2)：1-7.[0138] [10]Mead S，Poulter M，Uphill J，et al.Genetic risk factors for variantCreutzfeldt-Jakob disease：a genome-wide association study[J].LancetNeurol，2009，8(1)：57-66.

[0139] [11]Goldmann W，Baylis M，Chihota C，et al.Frequencies of PrP genehaplotypes in British sheep flocks and the implications forbreedingprogrammes[J].J Appl Microbiol，2005，98(6)：1294-1302.

[0140] [12]Roden J A，NieuwhofG J，Bishop S C，et al.Breeding programmes forTSE resistance in British sheep.I.Assessing the impact on prion protein(PrP)genotyPe frequencies[J].Prev Vet Med，2006，73(1)：1-16.

[0141] [13]Gubbins S，Roden J A.Breeding programmes for TSE resistance inBritish sheep.II.Assessing the impact on the prevalence and incidence ofscrapie[J].Prev Vet Med，2006，73(1)：17-31.

[0142] [14]Luhken G.Epidemiological and genetical differences between classicaland atypical scrapie cases[J].Vet Res，2007，38(1)：65-80.[0143] [15]Guan F，Pan L，Shi G Q.et al.Research progress on genetic diversity ofsheep PRNP and resistance breeding[J].Yi Chuan，2009，31(2)：137-41.[0144] [16]Li Y M，Tian B.Chinese little-fat-tail sheep prion protein gene belongs toPrPARH genotype[J].Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li XueBao(Shanghai)，2002，34(1)：62-66.