带可去除标记的核苷酸及制备方法和用于基因测序的方法

摘要

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种带可去除标记的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。基因测序的方法包括：A.对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接带可去除标记的核苷酸；B.对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100％DNA的延伸；C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色；D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；E.去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对另一种核苷酸重复前述步骤A至E。本发明具有低成本、高通量的特点，并能测得较长的基因序列。

权利要求

1.一种基因测序方法，是利用带可去除标记的特定核苷酸，通过标记/去标记的方式按顺序读出碱基序列，其特征在于，包括以下步骤：A.对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸；

B.对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上

100％DNA的延伸；

C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色达到对标记信号的放大；

D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；

E.去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸中的另外一种重复前述步骤A至E，并循环。

2.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于，在所述步骤A之前还包括以下步骤：将一通用引物杂交到所有磁珠上的所有DNA模板。

3.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于，所述方法包括：步骤A中，每次延伸占据少量DNA模板，并在每次CCD读取延伸反应后将标记物彻底去除；步骤B中，则连接普通的无标记核苷酸；

前述步骤A、B重复多次，其有效读取长度由可接受的最终信噪比决定。

4.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征在于，所述对标记物进行去除的方法包括：若携带可去除标记的核苷酸中的可切除位点为双硫键，则通过DTT、β-巯基乙醇或TCEP-盐酸切除修饰物；

若携带可去除标记的核苷酸中的可切除位点为吡喃醇结构，则通过酸性试剂进行切除。

5.一种带可去除标记的核苷酸，结构通式如下：式中dNTP为核苷酸，其特征在于：R提可切除位点；

所述带可去除标记的核苷酸连接到DNA待测模板时，使DNA待测模板的延伸反应暂停，当从R处切除标记物后，DNA待测模板与另一带可去除标记的核苷酸进行延伸反应。

6.根据权利要求5所述的带可去除标记的核苷酸，其特征在于，所述可切除位点-R的结构由双硫键构成，即：-S-S-，可通过还原剂打开。

7.根据权利要求5所述的带可去除标记的核苷酸，其特征在于，所述可切除位点-R为吡喃醇结构，即：可在其6h位置的C-O键打开。

8.一种带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括：A.将氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上，生成携带氨基末端的核苷酸；

B.对标记物进行化学修饰，使其包含一可切除位点，并对标记物进行醛基修饰；

C.将步骤A中生成的携带氨基末端的核苷酸，与步骤B中生成的携带醛基末端的标记物进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。

9.根据权利要求8所述的带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述可切除位点的生成过程包括：对标记物进行化学修饰，生成双硫键-S-S-作为可切除位点。

10.根据权利要求8所述的带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述可切除位点的生成过程包括：对标记物进行化学修饰，生成吡喃醇结构作为可切除位点，即：

说明书

带可去除标记的核苷酸及制备方法和用于基因测序的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种带可去除标记的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。

背景技术

[0002] 在传统的基因测序技术中，采用的是双脱氧链终止法(Sanger)。加入核苷酸到反应体系中进行DNA合成反应，核苷酸上的碱基逐步结合到DNA待测模板的不同位点，在一次合成结束时，由于每个碱基停止的位置不同，导致生成的各段DNA双链长短不一，则利用电泳将其分开，然后标记ATCG，根据不同的停止位点测定各碱基。该测序技术成本较高，速度慢，不能进行大规模平行测序。

[0003] 目前采用的一种测序方法是：首先将模板与引物杂交；然后加入DNA聚合酶和修饰过的核苷酸，该核苷酸连接有荧光标记物(Fluorophore)，DNA聚合反应时该荧光标记物可使反应暂停；反应暂停时测定此处的碱基；最后去除该荧光标记物，使DNA聚合反应继续。由上可知，该方法采用将荧光标记物堵住核苷酸的3端-OH的方式来达到暂停的目的，但是在后续去除荧光标记物时必须切除-OH上的终止集团，每次反应之后在切除荧光标记物时都无法达到100％的效率，这样会导致反应无法继续进行，就不能测得更长的基因序列。另外一种连接测序方法，则测序长度较短，过程复杂，其应用有若干限制。

[0004] 这里，我们提出一种新的大规模、平行测序方法，可以解决现有高通量测序技术中存在的若干问题，通过标记后信号放大，降低成本。

发明内容

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种带可去除标记的核苷酸，旨在解决现有高通量测序技术中存在的测序长度较短、信号低、成本高等问题。

[0006] 为了实现发明目的，提供了一种新的基因测序方法，是利用带可去除标记的特定核苷酸，通过标记/去标记的方式按顺序读出碱基序列，包括以下步骤：A.对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸；B.对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100％DNA的延伸；C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色，从而达到对磁珠上信号的足够放大；D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；E.去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸中的另外一种重复前述步骤A至E，并不断循环，以读取每个磁珠上DNA模板的碱基序列。持续A，T，C，G四个碱基的，(A-E)的循环，直至所需的长度为止。

[0007] 本发明还提供了一种带可去除标记的核苷酸，结构通式如下：

[0008]

[0009] 式中dNTP为核苷酸，其中：R是可切除位点；所述带可去除标记的核苷酸连接到DNA待测模板时，使DNA待测模板的延伸反应暂停，当从R处切除标记物后，DNA待测模板与另一带可去除标记的核苷酸进行延伸反应。

[0010] 本发明还提供了一种带可去除标记的核苷酸的制备方法，所述方法包括：A.将氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上，生成携带氨基末端的核苷酸；B.对标记物进行化学修饰，使其包含一可切除位点，并对标记物进行醛基修饰；C.将步骤A中生成的携带氨基末端的核苷酸，与步骤B中生成的携带醛基末端的标记物进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。

[0011] 由上可知，利用本发明提供的带可去除标记的核苷酸进行基因测序，相比于现有的高通量基因测序技术相比，可以测得更长的基因序列，还可放大信号，降低成本。

附图说明

[0012] 图1是本发明带可去除标记的核苷酸的第一实施例的分子结构示意图；

[0013] 图2是本发明带可去除标记的核苷酸的第二实施例的分子结构示意图；

[0014] 图3是本发明中带可去除标记的核苷酸的制备方法流程图；

[0015] 图4是本发明带可去除标记的核苷酸的制备方法的第一实施例的流程图；

[0016] 图5是本发明带可去除标记的核苷酸的制备方法的第二实施例的流程图；

[0017] 图6是本发明利用带可去除标记的核苷酸进行基因测序的方法流程图；

[0018] 图7是图6所示步骤S601在一个实施例中的流程图；

[0019] 图8是图6所述步骤S604对信号进行读取的方法流程图。

具体实施方式

[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

[0021] 本发明中带可去除标记的核苷酸的结构通式为：

[0022]

[0023] 式中dNTP为核苷酸，R是可切除位点。

[0024] 其中：

[0025] (1)核苷酸dNTP包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP四种，均由一分子含氮碱基、一分子脱氧核糖、一分子磷酸组成。例如，其中一种核苷酸dATP的分子结构式如下：

[0026]

[0027] 对于dUTP，也可以采用dTTP代替，本发明的实施例均以dUTP进行说明，仅为简明阐述的目的，而非加以限制。由于核苷酸dNTP的内容为本技术领域的公知常识，此处不再赘述。

[0028] (2)关于可切除位点-R的类型：在一个实施例中，可切除位点-R21的结构由双硫键构成，即：-S-S-，可通过还原剂打开。在另一实施例中，可切除位点-R21为吡喃醇(2-ethyl-6-methoxy-tetrahydro-2H-pyran，2-乙基-6-甲氧基-四氢-2H-吡喃)结构，即：

[0029] 可在其6h位置的C-O键打开。

[0030] 图1示出了本发明带可去除标记的核苷酸在第一实施例中的分子结构。分子结构式可表达为：

[0031]

[0032] 该实施例附图列出的四种分子结构式，其结构特点在于：(1)氨基修饰物由长度为3的碳链结合氨基末端组成，即-C3H4-NH-，其连接在核苷酸中的碱基上。(2)标记物携带一个可切除位点，该可切除位点由双硫键构成。(3)携带氨基末端的核苷酸与携带可切除位点的双硫键通过酯键结合。

[0033] 图2示出了本发明带可去除标记的核苷酸dNTP-R在第二实施例中的分子结构。分子结构式可表达为：

[0034]

[0035] 该实施例附图列出的四种分子结构式，分别为dATP-R、dGTP-R、dCTP-R、dUTP-R。其结构特点在于：

[0036] 该实施例附图列出的四种分子结构式，其结构特点在于：(1)氨基修饰物由长度为3的碳链结合氨基末端组成，即-C3H4-NH-，其连接在核苷酸中的碱基上。(2)标记物携带一个可切除位点，该可切除位点由吡喃醇构成。(3)携带氨基末端的核苷酸与携带可切除位点的双硫键通过酯键结合。由上可知，该实施例与第一实施例的区别在于可切除位点的种类。

[0037] 图3示出了本发明中带可去除标记的核苷酸的制备方法。具体过程如下：

[0038] 在步骤S301中，将氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上，生成携带氨基末端的核苷酸；

[0039] 在步骤S302中，对标记物进行化学修饰，使其包含一可切除位点，并对标记物进行醛基修饰；

[0040] 在步骤S303中，将步骤S301中生成的携带氨基末端的核苷酸，与步骤S302中生成的携带醛基末端的标记物进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。

[0041] 图4示出了本发明带可去除标记的核苷酸的制备方法的第一实施例。具体过程如下：

[0042] 在步骤S401中，将携带氨基末端的修饰物连接到核苷酸中，在本发明中，是将结构为-C3H6-NH2的氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上。

[0043] 在步骤S402中，对标记物进行修饰，修饰过程如下：(1)对标记物进行化学修饰，使其包含一可切除位点，该可切除位点是双硫键，或者吡喃醇结构。(2)对标记物的末端进行醛基修饰。

[0044] 在步骤S403中，将携带氨基末端的核苷酸，与携带醛基末端的标记物进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。

[0045] 图5示出了本发明带可去除标记的核苷酸的制备方法的第二实施例的流程。该实施例中，是生成双硫键-S-S-作为可切除位点，具体过程如下：

[0046] 在步骤S501中，将结构为-C3H6-NH2的氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上。

[0047] 在步骤S502中，对标记物进行化学修饰，生成双硫键-S-S-作为可切除位点。

[0048] 在步骤S503中，对标记物进行醛基修饰，生成携带醛基末端的第二修饰物-R2。

[0049] 在步骤S504中，将携带氨基末端的核苷酸与携带醛基末端的第二修饰物-R2进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。

[0050] 在实际操作中，携带氨基末端的核苷酸、带有双硫键及醛基末端的第二修饰物-R2是可以直接购买的试剂，因此合成过程往往只需一步反应。具体化学反应式为：

[0051]

[0052] 在另一实施例中，是生成吡喃醇结构作为可切除位点，则对标记物进行化学修饰的过程如下：

[0053]

[0054] 图6示出了本发明利用带可去除标记的核苷酸进行基因测序的方法流程。该带可去除标记的核苷酸中，氨基修饰物连接在核苷酸中的碱基上，其包含一个可切除位点、一个标记物。该基因测序的方法包括以下步骤：

[0055] 在所有步骤之前，先将一通用引物杂交到所有磁珠上的所有DNA模板。其中，模板是经过单分子放大的，而且每个磁珠上的DNA是相同的序列。

[0056] 在步骤S601中，对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸。

[0057] 在步骤S602中，对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100％DNA的延伸。

[0058] 在步骤S603中，通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色，从而达到对磁珠上信号的足够放大。

[0059] 在步骤S604中，利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号.在一个实施例中，如图8所示，荧光信号的采集方法包括：(1)步骤S6041，利用激发光源照射荧光标记物，产生荧光信号，例如可以用普通功率的汞短弧光灯作为光源；(2)步骤S6042，通过图像采集方式方式对荧光信号进行采集。需要说明的是，对于连续的相同碱基，读取是有困难的，但在此前的步骤中对信号强度增加，也有一定的反应，因此能够完全解决对连续相同碱基进行读取的问题。

[0060] 在步骤S605中，去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸中的另外一种重复前述步骤S601至S604，以读取每个磁珠上DNA模板的碱基序列。持续A，T，C，G四个碱基的，(A-E)的循环，直至所需的长度为止。

[0061] 在一个实施例中，每次延伸占据少量DNA模板(如5％)，并在每次延伸反应后对标记物进行彻底去除，则连接普通的无标记核苷酸。该步骤重复多次，有效读取长度由信噪比决定，从而达到超长测序。

[0062] 需要说明的是，此处少量延伸有两个关键点：(1)降低昂贵试剂的用量。在一个实施例中采用的是0.5uM的量级，大大低于常用的几十或上百uM的量级。(2)带标记的碱基进入DNA链之后，即使去除了标记，仍然有残存的部分，可以影响其它带标记的碱基的延伸。通常，如要100％的带标记碱基延伸，延伸长度大为限制，而对普通碱基影响较小。因此，可以获得更长的读出。因只有少量DNA有延伸，为避免下面序列读取的错误，必须把这一位点“填满”。此处使用高浓度的普通核酸，非常便宜。另外，即使是有标记的碱基造成100％的延伸停止，如一次仅占5％，也可至少读到20位。但是，因每次延伸只有少量标记，如直接用碱基上的荧光标记读取则信号太弱，因此信号必须先行放大，所以需要进行转染的步骤。

[0063] 图7示出了图6所示步骤S601在一个实施例中的流程。本发明中所利用的带可去除标记的核苷酸包括A，T，C，G四种：对于DNA待测模板上的任一待测位点，采用上述4种不同的核苷酸逐次进行延伸反应，并采集每次反应结束后该待测位点对应的荧光信号。具体包括：

[0064] 在步骤S6011中，利用带可去除标记与不带可去除标记的核苷酸dATP在DNA待测模板上的第N个待测位点进行延伸反应，并采集荧光信号，然后去除标记。

[0065] 在步骤S6012中，利用带可去除标记与不带可去除标记的核苷酸dGTP在DNA待测模板上的第N个待测位点进行延伸反应，并采集荧光信号，然后去除标记。

[0066] 在步骤S6013中，利用带可去除标记与不带可去除标记的核苷酸dCTP在DNA待测模板上的第N个待测位点进行延伸反应，并采集荧光信号，然后去除标记。

[0067] 在步骤S6014中，利用带可去除标记与不带可去除标记的核苷酸dUTP在DNA待测模板上的第N个待测位点进行延伸反应，并采集荧光信号，然后去除标记。

[0068] 对标记物进行彻底去除的方法包括多种，具体如下：

[0069] 若可切除位点的结构由双硫键构成，即：-S-S-，则通过DTT、β-巯基乙醇或TCEP-盐酸切除修饰物。若可切除位点为吡喃醇结构，则通过酸性试剂打开吡喃醇结构上6h位置的C-O键。该酸性试剂例如盐酸、硫酸、硝酸等。应当说明的是，本发明并不限于上述的切除方式，其他类似的处理方式均应包含在本发明的保护范围内。

[0070] 最后需要说明的是，采用本发明的方法，能够极大的降低成本，主要是试剂成本。例如，对于0.5uM的反应体系，如果采用200uL的反应体积，如果每个磁珠标记6000个DNA，那么理论上这些试剂可标记100亿磁珠。而用于标记核苷酸的试剂用量是100皮摩尔。因此，如通量在1千万磁珠的量级，试剂使用是非常少的，这就直接降低了成本。

[0071] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。