叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球及制备方法及用途

摘要

本发明公开了叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球及制备方法及用途，其制备方法：将聚乳酸-羟基乙酸溶于二氯甲烷和丙酮中，制成油相；将聚乙二醇和羟乙基纤维素溶于长春新碱水溶液中，搅拌，制成内水相并滴加到油相中，形成水/油的初乳溶液；将含有羟乙基纤维素和连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液加至初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；搅拌，待有机溶剂挥发，得到固化的微球；固化的微球经离心，舍去分离出的大粒径的微球，再经离心，将分离出的微球固体，洗涤，干燥，即制得叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，本发明的靶向缓释纳米微球具有良好的作用，且局部药物浓度高、作用时间长、不良反应少。

权利要求

1.叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，其特征是用下述方法制成：(1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于4ml-6ml体积比为3-5∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

(2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为2％-3％的长春新碱水溶液；

(3)将10mg的质量比为1∶2-4的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

(4)在70-90瓦特，1-3分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到

5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

(5)在110-130瓦特、2-4分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

(6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

(7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经

13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤3～4次，冷冻干燥24h，即制得粒径为245.5～252.9nm、表面光滑、多分散系数为0.150～0.158、叶酸含量为1.15％～

1.33％、载药率为4％～5％、包封率62.3％～71.3％、累积释放曲线符合Higuchi释放动力学模型及释放时间为12-16d的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

2.叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球的制备方法，其特征是由下述步骤组成：(1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于4ml-6ml体积比为3-5∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

(2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为2％-3％的长春新碱水溶液；

(3)将10mg的质量比为1∶2-4的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

(4)在70-90瓦特，1-3分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到

5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

(5)在110-130瓦特、2-4分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

(6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

(7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经

13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤3～4次，冷冻干燥24h，即制得叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

说明书

叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球及制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种靶向缓释纳米微球及制备方法及用途。

背景技术

[0002] 眼眶腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是最常见的泪腺恶性上皮性[1]肿瘤，其恶性度高，预后不佳已被公认 。传统治疗方法为眶内容剜除术，但术后复发率仍高。近年来，包括放疗、化疗在内的综合治疗方法逐步应用于ACC，一定程度上降低了复发率，但患者的十年生存率仅为20％。此癌常发生于年轻人，严重损害了劳动力。同时，眶内容剜除术给患者带来的毁容之苦、放化疗引起的诸多并发症不仅使患者难于坚持治疗，而且严重降低了患者的生存质量。因而寻找一种安全有效的ACC治疗药物，具有重要的临床实用价值和良好的社会效益。

[0003] 研究证明，药物制剂的给药途径与方法对药物的作用至关重要。常规的全身性系统化疗往往无法在肿瘤组织中达到有效的药物浓度，一味加大用药剂量势必导致诸多并发症，使患者不能耐受。而瘤内注射化疗(intra-tumoral injection chemotherapy)是将化疗药物直接注入肿瘤内，使肿瘤细胞长时间与高浓度的抗肿瘤药物接触，提高治疗效果，而[2，3]且全身副作用少。国内、外已有多家报道 采用瘤内注射化疗药物治疗脑胶质瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、消化系统肿瘤、骨肿瘤等恶性实体性肿瘤，效果显著。目前治疗眼部肿瘤尚属空白。

[0004] 但是瘤内注射也存在局限性。常规化疗药物注射后易随组织间隙弥散和体内代谢，靶区内难形成持久的药物高浓度区，不能持久发挥抗癌效果。多次给药会增加局部损伤。并且，化疗药物多具有局部组织刺激性，药物渗漏必然导致周围组织损伤。

[0005] 综上，如何实现药物对ACC细胞特异性而持久的杀伤作用，提高化疗效果和安全性，成为ACC局部化疗的关键问题，因而具有重要的临床实用价值和意义。前期基础研究结[4]果 表明长春新碱(Vinscristine，VCR)为ACC-2细胞系特异敏感性药物，通过荷瘤裸鼠体内实验证实瘤内注射化疗效果优于全身给药，且全身副作用少。

[0006] 腺样囊性癌临床常用的治疗方法包括手术、放射治疗和化学药物治疗，其中化学药物治疗起着重要的作用。但是，化疗药物必须达到一定浓度才能有效的杀伤肿瘤细胞，加大给药剂量可以提高血药浓度，但其毒副作用也同时增加。如何在增加靶细胞药物浓度的同时不增加甚至降低正常组织的药物浓度，是肿瘤化疗急需攻克的难题。

[0007] 上世纪初，Enrich首先提出了“靶向治疗”的设想，即用对特定组织细胞有亲和力的载体定向，把效应剂如：毒素、化疗药物、放射性核素等携带到病灶部位发挥作用，减少对周围正常组织的损伤，称为主动靶向。载体可以是抗体、细胞因子、可溶性受体等。随着单克隆技术的建立，大量只识别特异性抗原决定簇的单克隆抗体(mono-clonal antibody，McAb)成为药物靶向部分的首选对象。但是药物与抗体等生物活性分子结合的稳定性差，结合后改变了二者的分子大小、表面电荷及受体结合部位的性质，这些都可能降低药效及靶向性。此外，McAb制备工艺复杂，产量少，依赖抗体靶向治疗需要较高的成本。抗体等载体的药物携带能力也较弱，每分子抗体仅携带约1～62分子的少量药物。要想获得携带药物多、高特异性、高稳定性McAb导向药物，需要引入新的载体。目前，PLGA(聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA))是FDA批准用于注射剂的可生物降解高分子聚合物，已广泛应用于药物载体中。

[0008] 配体靶向是指利用配体对病灶表面受体的特异性识别功能，将配体与载药纳米粒子结合，通过配体-受体介导达到对病灶(靶)部位的有效治疗。配体靶向主要包括叶酸、转铁蛋白、多肽、生长因子等。

[0009] 叶酸是一种小分子量的具有喋呤结构的维生素。叶酸受体是一种通过聚糖磷脂酞肌醇(GPI)锚在膜上的糖蛋白，它能在生理条件下通过吞噬作用将叶酸摄取入细胞内。叶酸对叶酸受体具有高度特异的亲合性，从而克服了其穿透性低的障碍。与抗体相比，叶酸对叶酸受体的亲和力比单克隆抗体对肿瘤细胞表面的受体的亲和力强100倍以上，且叶酸具有免疫原性低、易于修饰、体积小、易穿透肿瘤、化学和生物稳定性高、成本低、易贮存等优点。叶酸受体在绝大多数正常组织中几乎不表达，而主要在癌细胞上得到高水平的表达。

[0010] 参考文献：

[0011] [1]唐东润，宋国祥，孙丰源，等.眼眶泪腺腺样囊性癌手术联合放疗的疗效观察.眼科研究，2002；20：69-71.

[0012] [2]Engelhard HH.The role of interstitial BCNU chemotherapy in the treatment of malignantglioma.Surg Neurol.2000，53：458-64.

[0013] [3]Harper E，Dang W，Lapidus RG，et al.Enhanced efficacy of a novel controlled release paclitaxelformulation(PACLIMER delivery system)for local-regional therapy of lung cancer tumor nodulesin mice.Clin Cancer Res.1999，5：4242-4248.

发明内容

[0014] 本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

[0015] 本发明的第二个目的是提供一种叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球的制备方法。

[0016] 本发明的第三个目的是提供一种叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球在制备治疗眼眶腺样囊性癌的靶向药物的应用。

[0017] 本发明的技术方案概述如下：

[0018] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，是用下述方法制成：

[0019] (1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于4ml-6ml体积比为3-5∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

[0020] (2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为2％-3％的长春新碱水溶液；

[0021] (3)将10mg的质量比为1∶2-4的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

[0022] (4)在70-90瓦特，1-3分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

[0023] (5)在110-130瓦特、2-4分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

[0024] (6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

[0025] (7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤3～4次，冷冻干燥24h，即制得粒径为245.5～252.9nm、表面光滑、多分散系数为0.150～0.158、叶酸含量为1.15％～
1.33％、载药率为4％～5％、包封率62.3％～71.3％、累积释放曲线符合Higuchi释放动力学模型及释放时间为12-16d的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

[0026] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球的制备方法，是由下述步骤组成：

[0027] (1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于4ml-6ml体积比为3-5∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

[0028] (2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为2％-3％的长春新碱水溶液；

[0029] (3)将10mg的质量比为1∶2-4的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

[0030] (4)在70-90瓦特，1-3分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

[0031] (5)在110-130瓦特、2-4分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

[0032] (6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

[0033] (7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤3～4次，冷冻干燥24h，即制得叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

[0034] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球在制备治疗眼眶腺样囊性癌的靶向药物中的应用。

[0035] 本发明的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球(FA-PLGA(VCR)-NPs)，微球形态规则圆整，大小均匀；表面光滑，分散性好，无粘连现象；红外和核磁表征证明微球表面有叶酸存在；微球的累积释放曲线符合Higuchi释放动力学模型，释放时间达14d；第1d有明显的突释现象，占总释放量的44.3％，2～7d为稳定释放阶段，7d后释放速率减慢，维持6d，球内药物几乎完全释放。

[0036] FA-PLGA(VCR)-NPs能够特异性识别腺样囊性癌细胞表面的叶酸受体并与之结合，内化进入靶细胞，在细胞内药物缓慢释放，发挥抗癌作用。该靶向缓释给药系统具有良好的抑制腺样囊性癌增殖的作用，且局部药物浓度高、作用时间长、不良反应少，为眼部肿瘤的治疗开辟一种全新的理念和治疗方式，它不仅减少了恶性肿瘤扩大切除手术对患者带来的身心创伤，减轻药物化疗的副作用，而且为进一步研究靶向于眼肿瘤干细胞的治疗奠定基础。

附图说明

[0037] 图1为本发明制备的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球的结构示意图。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

[0039] 实施例1

[0040] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，是用下述方法制成：

[0041] (1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于5ml体积比为4∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

[0042] (2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为3％的长春新碱水溶液；

[0043] (3)将10mg的质量比为1∶3的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

[0044] (4)在80瓦特，2分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

[0045] (5)在120瓦特、3分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相溶液逐滴加入至所述步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

[0046] (6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

[0047] (7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤4次，冷冻干燥24h，即制得平均粒径为249.2nm、表面光滑、分散性好、多分散系数为0.154、叶酸含量为1.24％、载药率为4.53％、包封率主66.8％、累积释放曲线符合Higuchi释放动力学模型及释放时间为14天的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。见图1。

[0048] 图中：1为长春新碱；2为内水相乳化剂；3为聚乳酸-羟基乙酸；4为外水相乳化剂；5为FA-OQCMC。

[0049] 采用聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA)制备的纳米微球作为药物超微载体，同时利用叶酸受体(folate receptor，FR)介导(研究证实，FR在腺样囊性癌2表面呈高表达)，复乳法制备连接有叶酸(Folic acid，FA)的VCR纳米微球(nanopaticles，NPs)，简称为叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球(FA-PLGA(VCR)-NPs)[0050] 连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐(FA-OQCMC)，制备方法我们已经发表了相关文章，制备过程如下：将2.5g叶酸溶于50mlDMSO溶液中，向其加入1.5ml三乙胺，将1.3g NHS(n-羟基丁二酰胺)用一定量的DMSO溶解后加入到上述反应体系中避光反应12h以上。将产物过滤，得到黄色固体NHS-FA活性脂。取1.0克的NHS-FA活性脂溶于25mlDMSO中，加入一定量的OQCMC。用Na2HPO4与NaOH缓冲溶液调节反应体系的pH＝10，反应1h。将最后产物透析24h，冻干即得FA-OQCMC。通过红外光谱检测FA的连接。

[0051] 实施例2

[0052] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，用下述方法制成：

[0053] (1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于4ml体积比为5∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

[0054] (2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为2％的长春新碱水溶液；

[0055] (3)将10mg的质量比为1∶4的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

[0056] (4)在70瓦特，3分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

[0057] (5)在110瓦特、4分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

[0058] (6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

[0059] (7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥24h，即制得叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

[0060] 实施例3

[0061] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球，用下述方法制成：

[0062] (1)将100mg的聚乳酸-羟基乙酸溶于6ml体积比为3∶1的二氯甲烷和丙酮中，制成油相备用；

[0063] (2)以去离子水做溶剂，配制成质量浓度为3％的长春新碱水溶液；

[0064] (3)将10mg的质量比为1∶2的聚乙二醇4000和羟乙基纤维素作乳化剂溶于2.5ml所述长春新碱水溶液中，避光搅拌至乳化剂完全溶解，制成内水相备用；

[0065] (4)在90瓦特，1分钟的超声分散条件下将所述步骤(3)制备的内水相滴加到5ml的所述步骤(1)制备的油相中，形成水/油的初乳溶液；

[0066] (5)在130瓦特、2分钟的超声分散条件下，将25ml的含有15mg的羟乙基纤维素和15mg的连接叶酸的O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐的水溶液为外水相逐滴加入至步骤(4)制备的初乳溶液中，形成水/油/水复合体系；

[0067] (6)电磁搅拌，使水/油/水复合体系中的有机溶剂缓慢挥发完全，得到固化的微球；

[0068] (7)将所述固化的微球经2000r/min离心5min，舍去分离出的大粒径的微球，再经13000r/min离心5min，将分离出的微球固体，用去离子水洗涤4次，冷冻干燥24h，即制得叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球。

[0069] 实验例1

[0070] 叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球在制备治疗眼眶腺样囊性癌的靶向药物的应用。

[0071] 将浓度为5×103个/ml的眼眶腺样囊性癌2单细胞悬液接种于96孔培养板，100μl/孔。长春新碱、长春新碱纳米微球、叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球(实施例1制备)三种药物，浓度分别选取0.05μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、
10μg/ml、30μg/ml(以长春新碱的含量计算)，100μl/孔，每种药物每一浓度设4个复孔；
以与最高浓度30μg/ml相当的空载微球PLGA-NPs为细胞毒性组；对照组为空白培养液；
药物作用时间为1d、2d、3d、4d、5d；酶标仪测定490nm处各孔吸光度(OD值)，计算细胞生长抑制率。

[0072]

[0073] 结果显示，叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球对眼眶腺样囊性癌2细胞增殖具有抑制作用，呈时间和剂量依赖性。在给药后第三天起，同等有效剂量的叶酸-长春新碱靶向缓释纳米微球对眼眶腺样囊性癌肿瘤细胞的抑制率明显高于长春新碱原药，具有统计学意义，有效的延长了药物作用时间，减少了短期突释造成的组织损伤。

[0074] 表1VCR组不同药物浓度在不同时间的吸光度(OD值)比较

[0075]

[0076] 表2PLGA(VCR)-NPs组OD值比较

[0077]

[0078] 表3FA-PLGA(VCR)-NPs组OD值比较

[0079]

[0080] 以三组药物与ACC-2细胞共培养第一天的结果(表3)为例，得到表4[0081] 表4共培养第1天三组药物OD值及抑制率(％)比较

[0082]

[0083] 表5三组药物OD值比较

[0084]

[0085] 实验例2

[0086] 异硫氰荧光素(FITC)标记微球分子。10％胎牛血清/无叶酸RPMI1640培养液培养ACC细胞于6孔板中。其中2孔加入1mmol/l游离叶酸1.0ml，培养2h。取出孔板，分别加入已标记的空载纳米微球2孔、叶酸靶向缓释纳米微球4孔(含有已加入游离叶酸的2孔)，培养3h。荧光显微镜观察。实验证明，叶酸靶向缓释纳米微球可以靶向附着在腺样囊性癌细胞表面，这种结合作用可以被游离叶酸抑制。

[0087] 于裸鼠腺样囊性癌移植瘤内分别注射生理盐水(A组)、VCR(B组)、PLGA-NPs(C组)、PLGA(VCR)-NPs(D组)和FA-PLGA(VCR)-NPs(E组)各0.1ml(含0.03mgVCR)，两个微球组在第14天时的肿瘤体积明显小于其他组。高效液相色谱法检测肿瘤组织内残余药物浓度提示，给药后第14天VCR组的药物残留浓度非常低，远远小于两个微球组，这充分说明了PLGA微球对药物起到了缓释作用，能够保持药物在一个浓度范围中持续释放。此外，透射电镜分析肿瘤组织发现，在给药后第14天时，仍有大量致密的颗粒状物存留在细胞核及细胞质中，也提示纳米微球可以进入细胞内发挥持久的杀伤作用。

[0088] 表6各组肿瘤体积抑制率比较

[0089]