来自地钱的不饱和脂肪酸合成系统酶基因及其利用

摘要

本发明从同种地钱中分离Δ5脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因及Δ6脂肪酸碳链延长酶基因，将这些基因导入高等植物，从而获得能够生产花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)的转基因植物体。

权利要求

1.来自地钱目生物的基因，所述基因由序列号5所示的碱基序列构成，且编码具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

2.对具有Δ5脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的基因，其中，所述基因对由序列号6所示的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码。

3.由权利要求1或2所述的基因所编码的蛋白质。

4.由序列号6所示的氨基酸序列构成、且具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

5.含有权利要求1或2所述基因的重组表达载体。

6.导入权利要求1或2所述基因而形成的转化体，其中，所述转化体为甲醇酵母转化体。

7.一种制备转化体的方法，所述方法包括将权利要求1或2所述基因导入宿主细胞以制备转化体。

8.如权利要求7所述的方法，所述转化体为酵母的转化体、植物体的转化体或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代的转化体。

9.如权利要求7所述的方法，所述转化体为植物组织的转化体。

10.一种生产导入了权利要求1或2所述基因的植物体、或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代的方法，所述方法包括将权利要求1或2所述的基因导入宿主细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述植物体为该植物体的组织。

12.脂肪酸生产方法，所述脂肪酸选自花生四烯酸和二十碳五烯酸，其特征在于，所述方法利用通过权利要求8所述的方法制备的转化体。

说明书

来自地钱的不饱和脂肪酸合成系统酶基因及其利用

[0001] 本申请是中国专利申请第200710199076.1号的分案申请，本分案申请是针对国家知识产权局于2010年6月2日发出的、发文序号为2010052900047380的第二次审查意见通知书中关于单一性的审查意见作出的。

[0002] 此外，所述第200710199076.1号的专利申请是中国专利申请第200480038471.6号的分案申请，第200480038471.6号的专利申请其申请日是2004年12月22日，发明名称是“来自地钱的不饱和脂肪酸合成系统酶基因及其利用”。

技术领域

[0003] 本发明涉及来自地钱(Marchantia polymorpha)的不饱和脂肪酸合成系统基因即Δ5脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因和Δ6脂肪酸碳链延长酶基因及其利用。

背景技术

[0004] 花生四烯酸、二十碳五烯酸(以下简称“EPA”)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid；PUFA)在人体中以神经系统为主的细胞膜脂质中含量丰富。这些多不饱和脂肪酸作为前列腺素、白三烯等生理活性物质的前体而发挥作用，在药理学上非常重要。近年来，市场上出售含花生四烯酸、EPA的健康食品。而且，脂肪酸还是洗涤剂、生物降解塑料等的原料，所以作为材料也备受注目。

[0005] 现在，通过从培养的微生物或鱼油中提取来生产多不饱和脂肪酸。因此存在以下问题：生产成本高，能源消耗量和废弃物量增加，特别是从鱼油提取制造多不饱和脂肪酸的方法，鱼资源有限。

[0006] 可认为花生四烯酸、EPA分别以亚油酸、α-亚麻酸为起点，通过Δ6去饱和、脂肪酸碳链延长及Δ5去饱和这三个连续的反应生物合成。这些反应分别由Δ6脂肪酸去饱和酶(以下简称“Δ6去饱和酶”)、Δ6脂肪酸碳链延长酶(以下简称“Δ6碳链延长酶”)及Δ5脂肪酸去饱和酶(以下简称“Δ5去饱和酶”)催化。

[0007] Δ6去饱和酶的基因在多种植物中被克隆。例如，在硅藻、小立碗藓(Physcomitrella patens)、角齿藓、琉璃苣、紫草、樱草及秋牡丹中克隆得到Δ6去饱和酶的基因。除植物外，还在丝状菌、线虫、蓝藻、大鼠及人类中克隆得到Δ6去饱和酶基因(参照非专利文献1(Eur.J.Biochem.269，p4105，2002)、非专利文献2(Plant J.15，p39，1998)、非专利文献3(Eur.J.Biochem.，267.p3801，2000)、非专利文献4(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，p4211，1997)、非专利文献5(Lipids 37，417，2002)、非专利文献6(FEBS Lett.542，p100，2003)、非专利文献7(Whitney et al.，Planta Epub 2003)、非专利文献8(Lipids
34，p649，1999)、非专利文献9(Gene，238，p445 1999)、非专利文献10(Biochem J.330，p611 1998)、非专利文献11(Plant Mol.Biol.，22，p293 1993)、非专利文献12(Biochem.Biophys.res.Commun.255，p575，1999)、非专利文献13(J.Biol.Chem.274，p471，1999))。而且，除蓝藻的Δ6去饱和酶外，上述其他的Δ6去饱和酶均在N末端存在细胞色素b5结构域。

[0008] Δ6碳链延长酶的基因最初在丝状菌和线虫中被克隆(参照非专利文献14(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，p8284，2000)、非专 利文 献15(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，p6421，2000))。在植物中，唯一从Sollya heterophylla中被克隆(参照非专利文献16(Plant J.31，p255，2002))。

[0009] 在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，存在参与鞘脂长链饱和酰基链合成的ELO2蛋白和ELO3蛋白(参照非专利文献17(J.Biol.Chem.，272，p17376，1997))，Δ6碳链延长酶的氨基酸序列与上述蛋白具有同源性。另一方面，在植物中存在另一类型的脂肪酸碳链延长酶，即β-酮酯酰CoA合酶(KCS)。此酶催化长链饱和/单不饱和脂肪酸的链延长(参照非专利文献15和非专利文献18(Plant Cell 7，p309，1995))。但是，Δ6碳链延长酶基因及酵母ELO 2/ELO3基因在进化上与KCS基因没有直接关系(参照非专利文献15和16)。

[0010] Δ5去饱和酶的基因最初从丝状菌被克隆(参照非专利文献19(J.Biol.Chem.273，p29360，1998)、非专利文献20(J.Biol.Chem.273，p19055))。Δ5去饱和酶的结构与Δ6去饱和酶相似，在N末端具有细胞色素b5结构域。在硅藻、线虫、大鼠、人类、小立碗藓(Physcomitrella patens)等中克隆得到Δ5去饱和酶基因(参照非专利文献1、非专利文献21(FEBS Lett.439，p215，1998)、非专利文献22(Arch.Biochem.Biophys.391，p8，2001)、非专利文献23(J.Biol.Chem.274，p37335，1999)、非专利文献24(J.Biol.Chem.278，35115，2003))。

[0011] 陆生植物由苔藓植物(苔藓植物门(Bryophyta))、蕨类植物、裸子植物及被子植物构成。苔藓植物是陆生植物中最古老的分化类群，由藓类(藓纲(Bryosida))、苔类(苔纲(Hepaticopsida))及角藓类这三类构成。地钱与上述生物中的小立碗藓在分类上最近，但小立碗藓属于藓类，而地钱属于苔纲地钱亚纲(Marchantiidae)。上述三类约在4亿3千年前就已经分化。因此虽然都称为苔藓，但小立碗藓与地钱在进化上大不相同，例如，甚于2亿年前分化的拟南芥与稻子的差异(参照非专利文献25(http://www.nibb.ac.jp/~mhasebe/Physcomitrella.html))。

[0012] 作为来自地钱的多不饱和脂肪酸合成系统酶基因，已经获得如上述KCS那样的链延长酶基因MpFAE2及MpFAE3(参照非专利文献26(Biosci.Biotechnol.Biochem.67，p605，2003)、非专利文献27(Biosci.Biotechnol.Biochem.67，p1667，2003))。但是，MpFAE2和MpFAE3不是Δ6碳链延长酶基因。

[0013] 如上所述，从各种各样的生物中克隆得到多种多不饱和脂肪酸合成系统酶基因，但在植物中生产花生四烯酸、EPA等碳原子数是20或大于20且不饱和度是4或大于4的多不饱和脂肪酸的例子少。上述例子的报道有：在亚麻中使来自硅藻的Δ6去饱和酶基因及Δ5去饱和酶基因、和来自小立碗藓的Δ6碳链延长酶基因表达，生产花生四烯酸及EPA，但其具体内容不详(参照非专利文献24)。

[0014] 综上所述，因为花生四烯酸、EPA等多不饱和脂肪酸是从培养的微生物或鱼油中提取来生产，所以存在以下问题：生产成本高、能源消耗量和废弃物量增加、鱼资源有限等。花生四烯酸、EPA等多不饱和脂肪酸的分子内有多个双键，这一特性使其可在各种工业中得到应用(例如，薄膜、生物降解塑料、功能性纤维、润滑油、洗涤剂的原料等)。通过基因重组植物生产上述多不饱和脂肪酸，可以降低生产成本，同时还可以实现更加环保的生产过程。如果可以利用基因重组技术在油料作物中大量生产上述多不饱和脂肪酸，则作为廉价多用途原料将非常有用。

[0015] 另一方面，当在植物中使异种生物的基因表达时，因存在转录、翻译、翻译后修饰等过程，所以很难预测该基因在植物体内发挥良好功能的程度。特别是使多个异种生物的基因表达时，可预测：与上述非专利文献24那样使来自不同种生物的多个基因表达的情况相比，使来自同一种生物的多个基因在植物内表达时能良好地发挥功能。此外，最早的陆生植物即苔藓类的地钱作为高等植物的模式系统，受到人们关注，并期待其基因在植物内良好地发挥功能。因此，如果能够获得来自地钱的多不饱和脂肪酸合成酶基因即Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因及Δ6碳链延长酶基因，可期待通过将这些基因导入植物在植物体内高效地蓄积花生四烯酸、EPA。

[0016] 此外，虽然从同样是苔藓植物的小立碗藓中克隆得到Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因及Δ6碳链延长酶基因，但地钱与小立碗藓在进化上相差很大，以现在的技术水平难以根据小立碗藓的基因获得地钱的基因。

发明内容

[0017] 鉴于上述以往的问题完成了本发明，本发明的目的是：提供能够在高等植物中生产花生四烯酸、EPA的来自地钱(Marchantia polymorpha)的不饱和脂肪酸合成酶基因及其利用方法，所述来自地钱的不饱和脂肪酸合成酶基因即Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因、Δ6碳链延长酶基因。

[0018] 本发明人等为了解决上述课题进行了潜心研究，从来自地钱(Marchantia polymorpha)的cDNA克隆中鉴定出编码上述Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ6碳链延长酶的基因，还成功地将这些基因导入甲醇酵母(Pichia pastoris)并使其表达，发现表达这些基因的蛋白质分别具有Δ6去饱和、Δ5去饱和、Δ6碳链延长的酶活性，从而完成了本发明。即，本发明包含以下的发明。

[0019] (1)来自地钱目生物的基因，其与由序列号1所示碱基序列构成的DNA的全部或部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的全部或部分在严格条件下杂交，且编码具有Δ6脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

[0020] (2)对具有Δ6脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号1所示碱基序列的基因。(b)与由序列号1所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0021] (3)对具有Δ6脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号1所示碱基序列中第253至1698号的碱基序列的基因。(b)与由序列号1所示碱基序列中第253至1698号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0022] (4)对具有Δ6脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)对由序列号2所示氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。(b)对由序列号2所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0023] (5)来自地钱目生物的基因，其与由序列号3所示碱基序列构成的DNA的全部或部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的全部或部分在严格条件下杂交，且编码具有Δ6脂肪酸碳链延长活性的蛋白质。

[0024] (6)对具有Δ6脂肪酸碳链延长活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号3所示碱基序列的基因。(b)与由序列号3所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0025] (7)对具有Δ6脂肪酸碳链延长活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号3所示碱基序列中第194至1066号的碱基序列的基因。(b)与由序列号3所示碱基序列中第194至1066号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0026] (8)对具有Δ6脂肪酸碳链延长活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a或(b)中记载的基因。其为对(a)由序列号4所示氨基酸序列构成的蛋白质、对(b)由序列号4所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换)、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0027] (9)来自地钱目生物的基因，其与由序列号5所示碱基序列构成的DNA的全部或部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的全部或部

[0028] 分在严格条件下杂交，且编码具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

[0029] (10)具有Δ5脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号5所示碱基序列的基因。(b)与由序列号5所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0030] (11)对具有Δ5脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。(a)具有序列号5所示碱基序列中第375至1829号的碱基序列的基因。(b)与由序列号5所示碱基序列中第375至1829号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0031] (12)对具有Δ5脂肪酸去饱和活性且来自地钱目生物的蛋白质进行编码的下述(a)或(b)中记载的基因。其为对(a)由序列号6所示氨基酸序列构成的蛋白质、对(b)由序列号6所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0032] (13)由上述(1)～(12)的任意一项中所述的基因所编码的蛋白质。

[0033] (14)以下(a)或(b)所述的蛋白质。(a)由序列号2所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由序列号2所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成、且具有Δ6脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

[0034] (15)以下(a)或(b)所述的蛋白质。(a)由序列号4所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由序列号4所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成、且具有Δ6脂肪酸碳链延长活性的蛋白质。

[0035] (16)以下(a)或(b)所述的蛋白质。(a)由序列号6所示氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由序列号6所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入和/或附加后的氨基酸序列构成、且具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质。

[0036] (17)识别上述(13)～(16)任意一项中所述的蛋白质的抗体。

[0037] (18)至少含有上述(1)～(12)任意一项中所述的基因的重组表达载体。

[0038] (19)至少导入上述(1)～(12)任意一项中所述的基因而形成的转化体。

[0039] (20)至少可表达地导入了上述(1)～(12)任意一项所述基因的植物体、或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、或该植物体的组织。

[0040] (21)至少可表达地导入了上述(1)～(12)任意一项所述的基因且脂肪酸组成被改变的植物体、或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、或该植物体的组织。

[0041] (22)上述(20)或(21)中所述的植物体的繁殖材料。

[0042] (23)用上述(21)中所述的植物体或植物体的组织生产脂肪酸的方法。

[0043] (24)含有通过上述(23)所述的脂肪酸生产方法得到的γ-亚麻酸、二均-γ-亚麻酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸中至少一种脂肪酸的材料。

[0044] (25)至少用(1)～(12)任意一项所述的基因改变脂肪酸组成的方法。

[0045] (26)用上述(1)～(12)任意一项所述的基因的至少一部分碱基序列或其互补序列作为探针的基因检测工具。

[0046] (27)用上述(13)～(16)任意一项中所述的蛋白质对调节该蛋白质的基因或调节该蛋白质的物质进行筛选的方法。

[0047] (28)通过上述(27)中所述的筛选方法得到的基因或物质。

[0048] 另外，只要在本说明书中没有特别说明，A、C、G、T分别表示腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶这四个碱基。

[0049] 本发明的其他目的、特征及优点可通过以下的说明充分了解。而且，通过参照附图的以下说明，还可以明白本发明的有益效果。

附图说明

[0050] [图1]

[0051] 表示将实施例6中使用的MpDES6基因、MpELO1基因及MpDES5基因的各表达盒连接的结构的构建顺序说明图。

具体实施方式

[0052] 以下说明本发明的实施形态之一。但是，本发明不限于此。

[0053] 下面，按照花生四烯酸及二十碳五烯酸(EPA)的合成途径、本发明涉及的基因、本发明涉及的蛋白质、本发明涉及的蛋白质及基因的获得方法、以及本发明涉及的基因及蛋白质的利用方法(有用性)这样的顺序，详细地说明本发明。

[0054] (1)花生四烯酸及二十碳五烯酸(EPA)的合成途径

[0055] 可认为花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)分别以亚油酸、α-亚麻酸为起点，通过Δ6去饱和、Δ6碳链延长及Δ5去饱和这三个连续的反应生物合成。这些反应分别由Δ6去饱和酶、Δ6碳链延长酶、Δ5去饱和酶催化，分别称为n-6途径(花生四烯酸合成途径)和n-3途径(EPA合成途径)。

[0056] 至今为止所报道的Δ6去饱和酶、Δ6碳链延长酶及Δ5去饱和酶均参与n-6及9，12
n-3途径。即，Δ6去饱和酶在n-6途径中将亚油酸(18:2Δ ，其中，18表示碳原子数，2表
6，9，12
示双键数，9、12表示双键的位置。以下同。)转变成γ-亚麻酸(GLA；18:3Δ )，在n-3
9，12，15 6，9，12，15
途径中将α-亚麻酸(ALA；18:3Δ )转变成十八碳四烯酸(STA；18:4Δ )。Δ6碳
8，11，14
链延长酶在n-6途径中将GLA转变成二均-γ-亚麻酸(DGLA；20:3Δ )，在n-3途径中
8，11，14，17
将STA转变成二十碳四烯酸(ETA；20:4Δ )。Δ5去饱和酶在n-6途径中将DGLA转
5，8，11，14 5，
变成花生四烯酸(20:4Δ )，在n-3途径中将ETA转变成二十碳五烯酸(EPA；20:5Δ
8，11，14，17
)。

[0057] (2)本发明涉及的基因

[0058] [本发明涉及的Δ6去饱和酶基因]

[0059] 本发明涉及的Δ6去饱和酶基因是对具有Δ6脂肪酸去饱和活性的蛋白质进行编码的来自地钱目生物的基因，只要是符合以下条件的基因即可。

[0060] 1.具有序列号1所示碱基序列的基因。

[0061] 2.与由序列号1所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0062] 3.与由序列号1所示碱基序列构成的DNA的一部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的一部分在严格条件下杂交的基因。

[0063] 4.具有序列号1所示碱基序列中第253至1698号的碱基序列的基因。另外，序列号1所示碱基序列的第253至1698号的碱基序列是被翻译成由序列号2所示氨基酸序列构成的蛋白质的区域。

[0064] 5.与由序列号1所示碱基序列中第253至1698号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0065] 6.对由序列号2所示氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0066] 7.对由序列号2所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0067] [本发明涉及的Δ6碳链延长酶基因]

[0068] 本发明涉及的Δ6碳链延长酶基因是对具有Δ6脂肪酸碳链延长酶活性的蛋白质进行编码的来自地钱目生物的基因，只要是符合以下条件的基因即可。

[0069] 1.具有序列号3所示碱基序列的基因。

[0070] 2.与由序列号3所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0071] 3.与由序列号3所示碱基序列构成的DNA的一部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的一部分在严格条件下杂交的基因。

[0072] 4.具有序列号3所示碱基序列中第194至1066号的碱基序列的基因。另外，序列号3所示碱基序列的第194至1066号的碱基序列是被翻译成由序列号4所示氨基酸序列构成的蛋白质的区域。

[0073] 5.与由序列号3所示碱基序列中第194至1066号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0074] 6.对由序列号4所示氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0075] 7.对由序列号4所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0076] [本发明涉及的Δ5去饱和酶基因]

[0077] 本发明涉及的Δ5去饱和酶基因是对具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质进行编码的来自地钱目生物的基因，只要是符合以下条件的基因即可。

[0078] 1.具有序列号5所示碱基序列的基因。

[0079] 2.与由序列号5所示碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0080] 3.与由序列号5所示碱基序列构成的DNA的一部分、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA的一部分在严格条件下杂交的基因。

[0081] 4.具有序列号5所示碱基序列中第375至1829号的碱基序列的基因。另外，序列号5所示碱基序列的第375至1829号的碱基序列是被翻译成由序列号6所示氨基酸序列构成的蛋白质的区域。

[0082] 5.与由序列号5所示碱基序列中第375至1829号的碱基序列构成的DNA、或与由该DNA的互补碱基序列构成的DNA在严格条件下杂交的基因。

[0083] 6.对由序列号6所示氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0084] 7.对由序列号6所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质进行编码的基因。

[0085] 另外，上述“严格条件”意味着只有当序列间存在至少90％的同一性、优选至少95％的同一性、最优选至少97％的同一性时才发生杂交。

[0086] 上述杂交可以用J.Sambrook et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中所述的方法等以往公知的方法进行。
通常，温度越高，盐浓度越低，严格度越高(越难杂交)，可以获得同源性更高的基因。作为杂交的条件，可以适宜地采用以往公知的条件，没有特殊限制，例如，42℃、6×SSPC、50％甲酰胺、1％SDS、100μg/ml salmon sperm DNA、5×Denhardt溶液(1×SSPE；0.18M氯化钠、
10mM磷酸钠、pH 7.7、1mM EDTA)。

[0087] 上述“地钱目生物”不限于地钱(Marchantia polymorpha)，包含属于地钱亚纲地钱目(Marchantiales)的生物。其中，已知在Monoclea forsteri(Monocleales)、Corsinia coriandrina(Marchantiales)、Oximitra paleacea(Marchantiales)、Ricciocarpos natans (Marchantiales)、Ricca huebeneriana(Marchantiales)、Ricca fluitans(Marchantiales)、Ricca duplex(Marchantiales)、Ricca canaliculata(Marchantiales)、Ricca bifurca(Marchantiales)、
Ricca ciliifera(Marchantiales)、Ricca glauca(Marchantiales)、Ricca
sorocarpa(Marchantiales)、Ricca warnstorfii(Marchantiales)、Ricca
michelii(Marchantiales)、Ricca papillosa(Marchantiales) 以 及 Ricca
zachariae(Marchantiales)中存在超长链多不饱和脂肪酸(参照Prog.Lipid Res.32，p281，1993)。以现有的技术水平可容易地从这些生物中获得Δ6去饱和酶、Δ6碳链延长酶以及Δ5去饱和酶的基因。例如，众所周知近缘生物中具有同一功能的酶的编码基因产生交叉杂交。

[0088] 本发明的基因不仅包含双链DNA，还包含构成双链DNA的被称为有意义链及反义链的各单链DNA、RNA。反义链可用作探针或反义化合物。DNA包括例如通过克隆、化学合成技术或这些技术的组合而得到的cDNA、基因组DNA等。而且，本发明的基因还可以是含有非翻译区(UTR)的序列、载体序列(含有表达载体序列)等序列的基因。

[0089] (3)本发明涉及的蛋白质

[0090] [本发明涉及的Δ6去饱和酶蛋白质]

[0091] 本发明涉及的Δ6去饱和酶蛋白质，只要是来自地钱目生物的蛋白质并且是具有Δ6脂肪酸去饱和活性的蛋白质即可。更具体地说，只要是下述的蛋白质即可。

[0092] 1.由上述(2)所述的本发明涉及的Δ6去饱和酶基因所编码的蛋白质。

[0093] 2.由序列号2所示氨基酸序列构成的蛋白质。

[0094] 3.由序列号2所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质。

[0095] [本发明涉及的Δ6碳链延长酶蛋白质]

[0096] 本发明涉及的Δ6碳链延长酶蛋白质只要是来自地钱目生物的蛋白质并且是具有Δ6脂肪酸碳链延长活性的蛋白质即可。更具体地说，只要是下述的蛋白质即可。

[0097] 1.由上述(2)所述的本发明涉及的Δ6碳链延长酶基因所编码的蛋白质。

[0098] 2.由序列号4所示氨基酸序列构成的蛋白质。

[0099] 3.由序列号4所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质。

[0100] [本发明涉及的Δ5去饱和酶蛋白质]

[0101] 本发明涉及的Δ5去饱和酶蛋白质只要是来自地钱目生物的蛋白质并且是具有Δ5脂肪酸去饱和活性的蛋白质即可。更具体地说，只要是下述的蛋白质即可。

[0102] 1.由上述(2)所述的本发明涉及的Δ5去饱和酶基因所编码的蛋白质。

[0103] 2.由序列号6所示氨基酸序列构成的蛋白质。

[0104] 3.由序列号6所示氨基酸序列发生1个或大于1个氨基酸置换、缺失、插入、和/或附加后的氨基酸序列构成的蛋白质。

[0105] 上述“Δ6脂肪酸去饱和活性”意味着对亚油酸或α-亚麻酸有底物特异性，分别将其转变成γ-亚麻酸或十八碳四烯酸。上述“Δ6脂肪酸碳链延长活性”意味着对γ-亚麻酸或十八碳四烯酸有底物特异性，分别将其转变成二均-γ-亚麻酸或二十碳四烯酸。上述“Δ5脂肪酸去饱和活性”意味着对二均-γ-亚麻酸或二十碳四烯酸有底物特异性，分别将其转变成花生四烯酸或二十碳五烯酸(EPA)。

[0106] 上述“1个或大于1个氨基酸被置换、缺失、插入、和/或附加”意味着通过定点诱变法等公知的突变蛋白质制备方法所能够置换、缺失、插入、和/或附加的数目(优选10个或小于10个、更优选7个或小于7个、进一步优选5个或小于5个)的氨基酸被置换、缺失、插入、和/或附加。这样的突变蛋白质并不限于通过公知的突变蛋白质制备方法人工导入了突变的蛋白质，也可以是天然存在的同样的突变蛋白质经分离纯化后得到的蛋白质。

[0107] 另外，本发明的蛋白质只要是氨基酸通过肽键结合形成的多肽即可，但并不限于此，也可以是包含多肽以外的其他结构的复合蛋白质。这里所述的多肽以外的其他结构，可以是糖链、异戊间二烯基等，没有特殊限制。

[0108] 而且，本发明的蛋白质也可以含有附加多肽。被多肽附加的情况例如，本发明的蛋白质被His、Myc、Flag等表位标记等。

[0109] 此外，本发明的蛋白质可以是将上述本发明的基因(对本发明的蛋白质进行编码的基因)导入宿主细胞使其蛋白质在细胞内表达的状态，也可以是从细胞、组织等分离纯化的状态。而且，根据上述宿主细胞中的表达条件，本发明的蛋白质还可以是与其他蛋白质相连的融合蛋白。此外，本发明的蛋白质也可以是化学合成的蛋白质。

[0110] (4)本发明涉及的蛋白质及基因的获得方法

[0111] 对本发明涉及的蛋白质及基因的获得方法(生产方法)没有特殊限制，作为代表性方法，可以列举以下各种方法。

[0112] [蛋白质的获得方法]

[0113] 如上所述，对本发明的蛋白质的获得方法(生产方法)没有特殊限制，首先，可以列举这样的方法：从表达本发明蛋白质的细胞、组织等中简单纯化。对纯化方法没有特殊限制，用公知的方法从细胞、组织制备细胞提取液，将此细胞提取液用公知的方法如色谱柱等进行纯化即可。

[0114] 此外，本发明的蛋白质的获得方法还可以列举利用基因重组技术等的方法。例如，可以采用这样等方法：将本发明的基因整合进载体等，然后通过公知的方法可表达地导入宿主细胞，纯化细胞内翻译得到的上述蛋白质。

[0115] 另外，如上所述那样将外源基因导入宿主时，存在各种整合了使外源基因在宿主内表达的启动子的表达载体以及各种宿主，根据目的选择即可。生成的蛋白质的纯化方法根据使用的宿主、蛋白质的性质不同而不同，通过标签的利用等，可以较容易地纯化目的蛋白质。

[0116] 对突变蛋白质的制备方法也没有特殊限制。可以采用公知的突变蛋白质制备方法，例如，利用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh，Gene 152，271-275(1995)等)、PCR法在碱基序列中导入点突变来制备突变蛋白质的方法、或者通过插入转位子制备突变株的方法等。制备突变蛋白质时，也可以利用市售的试剂盒。

[0117] 本发明蛋白质的获得方法并不限于上述方法，例如，还可以化学合成。例如，可以利用体外蛋白质合成液由本发明的基因合成本发明的蛋白质。

[0118] [基因的获得方法]

[0119] 对本发明的基因的获得方法(生产方法)也没有特殊限制，例如，利用差异筛选(subtractive cloning)的方法。在此方法中，按照公知的技术，在试管内反复进行直接杂交，浓缩目的cDNA(本发明的基因)即可。

[0120] 在通常采用的条件下，实施上述差异筛选中的各个步骤即可。由此得到的克隆可以通过制作限制酶图谱及测定其碱基序列(sequencing)进行更详细地解析。根据上述解析，可以容易地判断是否获得了含有本发明基因序列的DNA片段。

[0121] 作为本发明的基因的获得方法，还可以是：通过公知的技术，将含有本发明的基因的DNA片段分离并克隆。例如，制备与本发明基因的碱基序列的一部分特异性杂交的探针，筛选基因组DNA文库、cDNA文库即可。上述探针只要是与本发明基因的碱基序列或其互补序列的至少一部分特异性杂交的探针即可，可以采用任何序列和长度的探针。

[0122] 此外，从上述在地钱之间被良好保留的区域中选择上述探针的序列，对其他地钱的基因组DNA(或cDNA)文库进行筛选，可以分离并克隆对具有与上述蛋白质同样功能的同源分子、类似分子进行编码的基因。

[0123] 或者，本发明的基因的获得方法还可以是采用PCR等扩增手段的方法。例如，从本发明基因的cDNA序列的5′侧及3′侧的序列(或其互补序列)中分别制备引物，利用这些引物，以基因组DNA(或cDNA)等为模板进行PCR等，扩增两个引物之间的DNA区域，从而可以获得大量含有本发明的基因的DNA片段。

[0124] (5)本发明涉及的基因及蛋白质的利用方法(有用性)

[0125] (5-1)重组表达载体

[0126] 本发明涉及的重组表达载体只要含有前述(2)记载的本发明涉及的基因即可，没有特殊限制。例如，插入了cDNA的重组表达载体。制备重组表达载体时，可以用质粒、噬菌体、或黏粒等，没有特殊限制。而且，制备方法采用公知的方法即可。

[0127] 对载体的具体种类没有特殊限制，适宜地选择能在宿主细胞中表达的载体即可。即，根据宿主细胞的种类，选择确实能使基因表达的合适启动子序列，将该启动子序列和本发明的基因整合进各种质粒等，作为表达载体使用即可。

[0128] 还可以利用各种标记来确认本发明的基因是否已被导入宿主细胞，而且是否已在宿主细胞中真实地表达。例如，以宿主细胞中缺失的基因为标记，以含有此标记和本发明的基因的质粒等为表达载体导入宿主细胞。根据标记基因的表达，可以确认本发明的基因的导入。或者，也可以使本发明的蛋白质作为融合蛋白表达，例如，以来自水母Aequorea coerulescens(Brandt)的绿色荧光蛋白GFP(Green Fluorescent Protein)为标记，使本发明的蛋白质作为GFP融合蛋白表达。

[0129] 上述宿主细胞没有特殊限制，可以适宜地采用以往公知的各种细胞。具体可列举：大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌、酵母(出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe)、线虫(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞等，没有特殊限制。

[0130] 对将上述表达载体导入宿主细胞的方法即转化方法没有特殊限制，可以适宜地采用电穿孔法、磷酸钙法、核糖体法、DEAE葡聚糖法等以往公知的方法。而且，例如，使本发明的蛋白质在昆虫中转移表达时，可以采用杆状病毒表达系统。

[0131] (5-2)转化体

[0132] 本发明涉及的转化体只要是导入了前述(2)记载的本发明涉及的基因的转化体即可，没有特殊限制。这里所述的“转化体”不仅包含细菌、组织、器官，还包含生物个体。

[0133] 对转化体的制备方法(生产方法)没有特殊限制，例如，可以是这样的方法：将上述重组表达载体导入宿主细胞并转化。此外，对成为转化对象的生物也没有特殊限制，可以是上述宿主细胞中例举的各种微生物、动物等。

[0134] 本发明涉及的转化体优选：可表达地导入了本发明涉及的基因的植物体、或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、或该植物体的组织。通过这样的转基因植物，可以在成本低且环保的生产过程中生产花生四烯酸、EPA等多不饱和脂肪酸。

[0135] 这里所述的“基因被可表达地导入”是指：通过公知的基因工程手法(基因操作技术)，将基因可表达地导入对象细胞(宿主细胞)。

[0136] 植物体转化所使用的重组表达载体，只要是能够使插入基因在该植物细胞内表达的重组表达载体即可，没有特殊限制。例如，可以利用以下载体：具有在植物细胞内使基因恒定表达的启动子(例如，花椰菜花叶病毒35S启动子)的载体、具有因外界刺激而诱导活化的启动子的载体。另外，上述植物细胞包含各种形态的植物细胞，例如：悬浮培养的细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。

[0137] 向植物细胞导入重组表达载体时，可以采用聚乙二醇法、电穿孔法(Electroporation法)、农杆菌介导法、微弹枪法(particle gun法)等本领域技术人员公知的各种方法。可以根据植物细胞的种类不同，采用本领域技术人员所公知的方法由转化细胞再生植物体。

[0138] 例如，已建立多种在烟草中培育转基因植物体的方法，如：使转化后的农杆菌感染烟草叶盘的方法、利用聚乙二醇向原生质体导入基因并再生植物体的方法、通过电脉冲向原生质体导入基因并再生植物体的方法、通过微弹枪法向细胞直接导入基因并再生植物体的方法等。在本发明中，可以适宜地采用这些方法。

[0139] 而且，与拟南芥一样，烟草也是利用基因工程技术进行植物育种中的模式植物。如果说在上述烟草中可以获得花生四烯酸、EPA含量增加了的转化体，则可以毫不夸张地说在所有植物中都可以获得转化体。另外，在本说明书中，如后述的实施例所示，不仅获得了转基因烟草，还获得了转基因稻子，由此证实：通过本发明可以获得所有种类的转基因植物体。

[0140] 例如，已建立多种在稻子中培育转基因植物体的方法，如：利用聚乙二醇向原生质体导入基因并再生植物体的方法、通过电脉冲向原生质体导入基因并再生植物体的方法、通过微弹枪法向细胞直接导入基因并再生植物体的方法等。在本发明中，可以适宜地采用这些方法。

[0141] 当上述转基因植物体是稻子时，因稻子中的花生四烯酸、EPA含量增加，所以食用从该转基因植物体得到的种子即米，可以容易地向体内摄入花生四烯酸、EPA等多不饱和脂肪酸。因此，转基因稻子作为粮食具有很高的价值，在食品产业、农业领域极其有用。此外，用目前较少得到利用的米糠、稻谷壳、蘖等生产花生四烯酸、EPA，从中提取这些脂肪酸，从而可作为健康食品的原料得到有效利用。而且，还可以用作家畜的饲料。

[0142] 一旦获得基因组内导入了本发明的基因的转基因植物体，则可以通过有性生殖或无性生殖从该植物体获得后代。还可以从该植物体或其后代、或克隆中得到繁殖材料(例如，种子、果实、插条、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等)，以繁殖材料为基础，大量生产该植物体。因此本发明包含：可表达地导入了本发明的基因的植物体、或、与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、或、该植物体的组织、或、该植物体的繁殖材料。

[0143] 该植物体、与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、及该植物体的组织也包含营养繁殖的植物体。营养繁殖也被称为营养生殖、克隆，一般通过插芽、插枝等进行繁殖，在试管内，可以由叶、茎、根等器官进行植物体的再分化、通过愈伤组织进行繁殖。根据植物种类不同，有时枝端形成特殊的冬芽、腋芽肉质化、花变成珠芽、形成块根、块茎等。

[0144] 本发明还包含：可表达地导入了本发明的基因且脂肪酸组成被改变了的植物体、或与该植物体具有同一性状的该植物体的后代、或该植物体的组织、该植物体的繁殖材料。“脂肪酸组成被改变了”是指：转化前植物体的脂肪酸组成与转化后植物体的脂肪酸组成不同。例如，原脂肪酸组成中不含花生四烯酸、EPA的植物，通过用本发明涉及的基因进行转化，使转基因植物的脂肪酸组成中含有花生四烯酸、EPA。

[0145] (5-3)脂肪酸生产方法

[0146] 本发明包含：利用经本发明涉及的基因转化且脂肪酸组成改变了的植物体或植物体的组织来生产脂肪酸的方法。

[0147] 例如，从上述花生四烯酸、EPA含量增加了的本发明涉及的转基因植物制得的食用油，其花生四烯酸、EPA的含量高，是高价值的食用油。上述转基因植物体的种子、果实、切穗、块茎、块根等作为含有花生四烯酸、EPA的食物，也很有价值。

[0148] (5-4)材料

[0149] 本发明还包含：含有由上述脂肪酸生产方法得到的物质即γ-亚麻酸、二均-γ-亚麻酸、花生四烯酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸中至少一种脂肪酸的材料。该“材料”指：除了作为上述食物的种子、果实、切穗、块茎、或块根外，还指能作为工业原料利用的所有材料。

[0150] 上述材料例如可以是含花生四烯酸、EPA的健康食品，薄膜、生物降解塑料、功能性纤维、润滑油、洗涤剂的原料等。上述不饱和脂肪酸具有分子内存在多个双键这一特性。因此，通过本发明的转基因植物体生产花生四烯酸、EPA，可以降低生产成本。而且通过本发明，还可以实现环保的生产过程。

[0151] (5-5)改变脂肪酸组成的方法

[0152] 本发明包含：用本发明涉及的基因改变脂肪酸组成的方法。例如，通过制备如上述那样导入了本发明涉及的基因的转化体，可以改变宿主细胞的脂肪酸组成。作为改变脂肪酸组成的对象，不受特殊限制，除植物以外还可以是动物、细菌、酵母等所有生物。

[0153] (5-6)基因检测工具

[0154] 本发明涉及的基因检测工具用本发明涉及的基因的至少一部分碱基序列或其互补序列作为探针。基因检测工具可以在各种条件下用于本发明基因的表达模式的检出和测定等。

[0155] 本发明的基因检测工具例如可以是：将与本发明的基因特异性杂交的上述探针固定在支持物(载体)上的DNA芯片。这里所述的“DNA芯片”主要指以合成的寡核苷酸为探针的合成型DNA芯片，但还包含以PCR产物等的cDNA为探针的粘贴型DNA微阵列。

[0156] 通过从cDNA序列中特定出特征序列的以往的公知方法，可以决定用作探针的序列。具体如SAGE：Serial Analysis of Gene Expression法(Science 276：1268，1997；Cell 88：243，1997；Science 270：484，1995；Nature 389：300，1997；美国专利第
5,695,937号)等。

[0157] 另外，制造DNA芯片时，采用公知的方法即可。例如，当利用合成的寡核苷酸作为寡核苷酸时，通过照相平板印刷技术(Photo lithography)与DNA固相合成技术相结合，在支持物上合成该寡核苷酸即可。而当利用cDNA作为寡核苷酸时，用阵列机粘贴在支持物上即可。

[0158] 此外，与一般的DNA芯片一样，也可以排布完全匹配探针(寡核苷酸)和该完全匹配探针中有一个碱基被置换的错配探针，进一步提高基因的检测精度。而且，为了平行检测不同的基因，还可以将多种寡核苷酸固定在同一支持物上构建DNA芯片。

[0159] 本发明涉及的基因检测工具不限于上述例举的DNA芯片，只要是用本发明涉及的基因的至少一部分碱基序列或其互补序列作探针的基因检测工具即可。

[0160] (5-7)抗体

[0161] 本发明涉及的抗体是以本发明涉及的蛋白质、或其部分蛋白质·部分肽为抗原，通过公知的方法得到的多克隆抗体或单克隆抗体。公知的方法如文献(Harlow等 的“Antibodies：A laboratory manual”(Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988))、岩崎等的“单克隆抗体杂交瘤与ELISA，讲谈社(1991)”)中记载的方法。按照上述方法得到的抗体，可用于本发明蛋白质的检出和测定等。

[0162] (5-8)筛选方法

[0163] 本发明涉及的筛选方法是用本发明涉及的蛋白质对调节该蛋白质的基因或调节该蛋白质的物质进行筛选的方法。作为本发明的筛选方法，可以适宜地采用分析物质间有无结合、有无解离的以往公知的各种方法，没有特殊限制。例如，对促进本发明涉及的蛋白质的活性(Δ6去饱和活性、Δ6碳链延长活性和/或Δ5去饱和活性)的物质进行筛选。

[0164] 而且，本发明还包含：通过上述筛选方法得到的基因或物质。

[0165] 下面，列举实施例，更详细地说明本发明，当然，本发明不限于以下的实施例，在细节上可以是各种形态。而且，本发明也不限于上述实施形态，在权利要求相所示的范围内可以有各种变更，适宜地组合已公开的技术手段的实施形态也包含在本发明的技术范围内。

[0166] [实施例]

[0167] 在本实施例中，只要没有特殊说明，实验方法遵照Molecular Cloning(Sambrook et.al.Cold Spring Harbour Laboratory Press，1989)中所述的方法。

[0168] [实施例1：来自地钱的Δ6去饱和酶基因的分离]

[0169] 由至今为止克隆的Δ6去饱和酶的氨基酸序列的比较可知：氨基酸序列Trp-Trp-Lys-(Glu/Asp)-Lys-His-Asn(序列号37)和Trp-Phe-Thr-Gly-Gly-Leu-Asn(序列号38)被保留。因此，为了分离来自地钱的Δ6去饱和酶基因，采用对上述氨基酸序列进行编码的下述简并引物。

[0170] d 6DES-F 5’-TGGTGGAA(A/G)GA(A/G/T/C)AA(A/G)CA(T/C)AA-3’(序列号7)[0171] d 6DES-R 5’-(A/G)TTIA(A/G)ICCICCIGT(A/G)AACCA-3’(序列号8)

[0172] (I表示肌苷，()内表示多个碱基)

[0173] 试验材料用的是E系统地钱(参照Transgenic Res.9，p179，2000)的叶状体。按照文献(Biosci.Biotechnol.Biochem.67，p605，2003；Biosci.Biotechnol.Biochem.67，p1667，2003)中记载的方法，从叶状体中分离poly(A)+RNA。将分离得到的poly(A)+RNA1.5μl用Ready-To-Go T-primed First Strand kit(Amersham公司生产)逆转录成cDNA。
以上述cDNA约10ng为模板，利用上述引物(d 6DES-F和d 6DES-R)及酶(Takara Ex Taq、Takara公司生产)0.5U，用制造者推荐的方法进行PCR。反应液量为20μl，采用GeneAmp PCR system9700(PE Applied Biosystems公司生产)，在94℃下保持2分钟后，进行94℃下1分钟、45℃下1.5分钟、72℃下2分钟的反应，循环35次，然后冷却到4℃。

[0174] 将得到的PCR产物用1％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，根据以往的Δ6去饱和酶的氨基酸序列预测扩增片段的大小，将具有预测大小的扩增片段用Prep-A Gene(Bio-rad公司生产)通过凝胶回收。将回收的扩增片段连接于pT7Blue Vector(Takara公司生产)，转化入大肠杆菌Electro-max DH10B cells(Invitrogen公司生产，Carlsbad，CA)。

[0175] 利用BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems 公司生产)及automated sequencer ABI PRISM 377(Applied Biosystems公司生产)，测定得到的全克隆的碱基序列，寻找具有目的cDNA序列的克隆。

[0176] 为了获得全长cDNA序列，进行5’-RACE和3’-RACE。利用5’-RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0(Invitrogen公司生产)、Ready-To-Go T-primed First Strand kit(Amersham公司生产)以及下述引物(MpDES6-O2R和MpDES6-O1F)，按照制造者推荐的方法进行。

[0177] MpDES6-O2R：5’-AAGTTGCCTTCGATGTTTCTGG-3’(序列号9)

[0178] MpDES6-O1F：5’-GCTCGCCTGGAGCAAGGAAATC-3’(序列号10)

[0179] 结果分离得到一种同源候选基因，将此基因作为MpDES6基因。分离的MpDES6基因的cDNA长度(除去polyA部分)为2,522bp，其编码的推定氨基酸序列为481个残基。其碱基序列在序列号1表示，氨基酸序列在序列号2表示。

[0180] 将MpDES6 cDNA的推定氨基酸序列与小立碗藓的Δ6去饱和酶的氨基酸序列比较，结果显示：只有47.5％的同一性。

[0181] [实施例2：来自地钱的Δ6碳链延长酶基因的分离]

[0182] 由至今为止克隆的Δ6碳链延长酶的氨基酸序列的比较可知：氨基酸序Val-Glu-Phe-Met-Asp-Thr-Val(序列号39)及Lys-Tyr-Leu-Phe-Trp-Gly-Arg(序列号40)被保留。因此，为了分离来自地钱的Δ6碳链延长酶基因，采用对上述氨基酸序列进行编码的下述简并引物。

[0183] d 6ELO-F 5’-GTIGA(A/G)TT(T/C)ATGGA(T/C)ACIGT-3’(序列号11)

[0184] d 6ELO-R 5’-C(G/T)ICCCCA(A/G)AAIA(A/G)(A/G)TA(T/C)TT-3’(序列号12)[0185] 用上述引物(d 6ELO-F和d 6ELO-R)进行PCR，将获得的DNA片段进行亚克隆。测定得到的克隆的碱基序列，利用下述引物(MpELO1-O2R和MpELO1-O1F)从具有目的cDNA序列的克隆中获得全长cDNA。另外，实验材料及方法与实施例1相同。

[0186] MpELO1-O2R：5’-GCGAGCTTTCTCGTTCTTTCCC-3’(序列号13)

[0187] MpELO1-O1F：5’-TATGATTTTGAAGCGCAACACG-3’(序列号14)

[0188] 结果分离得到一种同源候选基因，将此基因作为MpELO1基因。MpELO1基因的cDNA长度(除去polyA部分)为1,559bp，推定氨基酸序列为290个残基。其碱基序列在序列号3表示，氨基酸序列在序列号4表示。

[0189] 将MpELO1 cDNA的推定氨基酸序列与小立碗藓的Δ6碳链延长酶的氨基酸序列比较，结果显示：同一性为62.7％。

[0190] [实施例3：来自地钱的Δ5去饱和酶基因的分离]

[0191] 其他生物种类的Δ5去饱和酶在N末端有细胞色素b5结构域。由此预测：来自地钱的Δ5去饱和酶基因与Δ6去饱和酶基因一样，属于细胞色素b5结构域融合型去饱和酶基因家族。但在硅藻、真菌中，Δ5去饱和酶及Δ6去饱和酶之间在氨基酸序列水平上的同源性非常低。因此，对丝状菌(M.alpina)的Δ5去饱和酶及Δ6去饱和酶间的氨基酸序列进行比较，结果发现：局部存在简并引物设计时最少需要的4至5个残基的连续保守序列。还惊奇地发现：这些保守序列在同种内的Δ5去饱和酶和Δ6去饱和酶之间比在异种的Δ5去饱和酶的氨基酸序列之间被更好地保留。由此可认为：在细胞色素b5结构域融合型去饱和酶基因中，有时存在种特异性保守序列。于是，潜心比较并探讨了上述MpDES6和在Genetics159，p981，2001中记载的功能未知的MpDES的碱基序列，结果发现：两处氨基酸序列(I(E/N)(G/D)KVYDV(序列号41)、及DPDI(Q/D)(Y/T)(M/V)P(序列号42))被保留。与各氨基酸序列对应的简并引物序列如下所示。

[0192] d 5DES-F 5’-AT(A/T/C)(A/G)AIG(A/G)IAA(A/G)TITA(T/C)GA(T/C)GT-3’(序列号15)

[0193] d 5DES-R 5’-GGIA(T/C)I(G/T)(A/T)IT(G/C)(A/G/T)AT(A/G)TCIGG(A/G)TC-3’(序列号16)

[0194] 用上述引物(d 5DES-F和d 5DES-R)进行PCR，将得到的DNA片段进行亚克隆。测定得到的克隆的碱基序列，采用下述引物(MpDES5-O2R及MpDES5-O1F)从具有目的cDNA序列的克隆中获得全长cDNA。另外，实验材料及方法与实施例1相同。

[0195] MpDES5-O2R：5’-GTGTGTACGATCCGTGGTTACC-3’(序列号17)

[0196] MpDES5-O1F：5’-AAGGCGGGACAGGATTCAACAC-3’(序列号18)

[0197] 作为来自地钱的Δ5去饱和酶的候选基因，分离得到2种长度不同的克隆c1及c2(c1：2,427bp、c2：2,285bp)。比较c1和c2的碱基序列，结果表明：在5’非翻译区发生自动拼接(选择性拼接)。自动拼接没有引起阅读框架的改变，任一克隆均编码484个氨基酸(序列号6)。以下，将2,427bp长的克隆c1作为MpDES5基因(序列号5)，在下面的实施例中使用。

[0198] 将MpDES5cDNA的推定氨基酸序列与丝状菌(M.alpina)的Δ5去饱和酶的氨基酸序列比较，结果显示：同一性为31.4％。因为与地钱有近缘关系的小立碗藓的Δ5去饱和酶的序列信息没有被公开，所以在此没进行比较。

[0199] [实施例4：利用甲醇酵母(Pichica pastoris)的功能分析]

[0200] 为了分析MpDES6、MpELO1及MpDES5的cDNA的功能，首先，将各个ORF构建于甲醇诱导型启动子AOX1的下游。将制备的这些结构导入甲醇酵母(Pichia pastoris)，分析其脂肪酸组成。利用下述引物，通过PCR扩增MpDES6、MpELO1及MpDES5的cDNA碱基序列的ORF部分。

[0201] (MpDES6 ORF扩增用引物)

[0202] MpD6-17F：5’-GGAATTCGCGATGGCCTCGTCCACCACCAC-3’(序列号19)

[0203] MpD6-18F：5’-GGAATTCTACTTTCGCAGCGTATGCTACC-3’(序列号20)

[0204] (MpELO1 ORF扩增用引物)

[0205] MpD6ELO1-15F：5’-GGAATTCGCGATGGAGGCGTACGAGATGG-3’(序列号21)[0206] MpD6ELO1-16F：5’-GGAATTCTTCTGCCTTTTTGCTCTTGATC-3’(序列号22)[0207] (MpDES5 ORF扩增用引物)

[0208] MpD5-11F：5’-GTTGAATTCGACAGTTATGCCGCCACACGC-3’(序列号23)

[0209] MpD5-12R：5’-GTTGAATTCAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC-3’(序列号24)

[0210] 这些引物含有下划线所示的EcoRI识别序列，在以下的克隆中利用。用Pyrobest DNA polymerase(Takara公司生产)0.5U，按照制造者推荐的方法，反应液量为20μl，进行PCR。反应条件为，在94℃下保持2分钟后，进行94℃下1分钟、57℃下1分钟、72℃下1分钟的反应，循环25次，然后冷却到4℃。将得到的各ORF片段用EcoRI消化后，用实施例1中记载的方法进行凝胶纯化。然后，正向连接于甲醇酵母的表达载体pPICZA(标记：Zeocin抗性基因，Invitrogen公司生产)内甲醇诱导型启动子5’AOX1下游的EcoRI部位。

[0211] 将 各个 表 达 结 构以 及 作 为 对 照的 pPICZA载 体用 Pichia EasyComp kit(Invitrogen公司生产)导入甲醇酵母的PPY1系统，以Zeocin抗性为标记，获得转化体。另外，甲醇酵母可以合成Δ6去饱和酶的底物即亚

[0212] 油酸和α-亚麻酸，但不能合成花生四烯酸、EPA的其他的前体。

[0213] 为了使导入的基因表达，利用EasySelect Pichia Expression Kit(Invitrogen公司生产)，按照该试剂盒推荐的方法，将各转化体在以1.0％甘油为唯一碳源的最低限度培养基中培养到OD值(600nm)到0.5后，在以0.5％甲醇为唯一碳源的最低限度培养基中，在30℃下培养3天到饱和状态。然后，用GC-MS，通过公知的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.67，p605，2003)，测定各转化体的脂肪酸组成。

[0214] 在表达MpDES6基因的转化体中，新检测出Δ6去饱和酶的反应产物即γ-亚麻酸、十八碳四烯酸，分别为总脂肪酸的7.4％、0.7％。在导入了作为对照的pPICZA载体的酵母中，没有检测出上述物质。由此表明，MpDES6编码Δ6去饱和酶。

[0215] 在表达MpELO1基因的转化体中，当添加了γ-亚麻酸时新检测出二均-γ-亚麻酸，为总脂肪酸的14.1％，当添加了十八碳四烯酸时新检测出二十碳四烯酸，为1.5％。在导入了作为对照的pPICZA载体的酵母中，没有检测出上述物质。由此表明，MpELO1编码Δ6碳链延长酶。

[0216] 在表达MpDES5基因的转化体中，当添加了二均-γ-亚麻酸时检测出花生四烯酸，为总脂肪酸的1.1％，当添加了二十碳四烯酸时检测出二十碳五烯酸(EPA)，为0.1％。在导入了作为对照的pPICZA载体的酵母中，没有检测出上述物质。由此表明，MpDES5编码Δ5去饱和酶。

[0217] 如上所述，从地钱中获得了编码Δ6去饱和酶、Δ6碳链延长酶及Δ5去饱和酶的基因，分别为MpDES6、MpELO1及MpDES5。

[0218] [实施例5：甲醇酵母(P.pastoris)中地钱多不饱和脂肪酸生物合成系统的再构建]

[0219] 为了使MpDES6、MpELO1及MpDES5共表达，将上述实施例4中制备的经EcoRI消化的MpELO1及MpDES5的ORF扩增片段，分别正向连接于不同的甲醇酵母表达载体pPIC3K(标记：HIS4基因、Invitrogen公司生产)及pPIC6A(标记：灭瘟素(blasticidin)抗性基因、Invitrogen公司生产)的5’AOX1启动子下游的EcoRI部位。此外，MpDES6采用的是实施例4中制备的表达载体。以下各表达载体分别表示为pPICZA-MpDES6、pPIC3K-MpELO1及pPIC6A-MpDES5。

[0220] 首先，将pPICZA-MpDES6、或只将作为对照的pPICZA载体转化到甲醇酵母PPY12系统(his4，arg4)，该甲醇酵母PPY12系统具有与上述实施例4中用的甲醇酵母PPY1系统相同的脂肪酸组成，并以Zeocin抗性为标记，获得转化体。然后，将pPIC3K-MpELO1、或只将作为对照的pPIC3K载体分别导入基因组中整合了pPICZA-MpDES6、或只整合了pPICZA的转化体，以组氨酸合成能力为标记，获得转化体。最后，将pPIC6A-MpDES5、或只将作为对照的pPIC6A载体导入基因组中整合了pPICZA-MpDES6及pPIC3K-MpELO1、或整合了pPICZA及pPIC3K的上述转化体中，以灭瘟素(ブラストジン)抗性为标记，获得转化体。

[0221] 用得到的导入了2种或3种基因的转化体，进行地钱的花生四烯酸/EPA生物合成系统的再构建实验。首先，利用上述导入了2种基因(MpDES6及MpELO1)的转化体，使MpDES6基因及MpELO1基因在甲醇酵母内共表达。其结果为，除了生成作为Δ6去饱和反应产物的γ-亚麻酸(总脂肪酸的2.9％)及十八碳四烯酸(总脂肪酸的0.4％)外，还生成其碳链延长反应产物即二均-γ-亚麻酸(总脂肪酸的2.8％)及二十碳四烯酸(总脂肪酸的0.2％)。在作为对照的转化体中，没有检测出这些脂肪酸。在上述转化体中再导入MpDES5的转化体，除了生成γ-亚麻酸(总脂肪酸的2.8％)、十八碳四烯酸(总脂肪酸的0.5％)、二均-γ-亚麻酸(总脂肪酸的1.5％)及二十碳四烯酸(总脂肪酸的0.1％)这
4种脂肪酸外，还生成花生四烯酸(总脂肪酸的0.1％)及二十碳五烯酸(EPA、总脂肪酸的
0.03％)。在作为对照的转化体中，没有检测出这些脂肪酸。该结果表明：通过使来自地钱的Δ6去饱和酶基因、Δ6碳链延长酶基因及Δ5去饱和酶基因表达，即使在地钱以外的生物种类中也可以再构建多不饱和脂肪酸生物合成系统。

[0222] [实施例6：导入稻子的载体的构建及该载体向稻子的导入]

[0223] 在稻子中，为了使MpDES6、MpELO1及MpDES5基因表达，按照以下(i)～(iv)所示的顺序，构建表达结构。构建顺序在图1中显示。

[0224] (i)利用在pBI221(TOYOBO公司生产)的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和NOS终止子间设计的以下引物，进行PCR，从而制备除去了β-Glucuronidase(GUS)基因部分的表达载体p35S-NOS。

[0225] MK001(F)：5’-CGGGATCCTCTCCTGGCGCACCATCGTC-3’(序列号25)

[0226] MK002(R)：5’-GGGGTACCAACGCGCTTTCCCACCAACG-3’(序列号26)

[0227] 另外，引物MK001(F)含有下划线所示的BamHI识别序列，与GUS基因的3’末端退火，引物MK002(R)与GUS基因的5’末端退火(BamHI位点存在于退火部位的上游)。利用Pyrobest DNA polymerase(Takara公司生产)0.5U，按照制造者推荐的方法，反应液量为50μl，进行PCR。反应条件为，96℃保持5分钟后，进行94℃下30秒、68℃下4分钟的反应，循环30次，然后冷却到4℃。将得到的各ORF片段进行BamHI消化后，用实施例1中记载的方法进行凝胶纯化，然后使其自我连接。

[0228] (ii)接着，分别将MpDES6基因、MpELO1基因及MpDES5基因的ORF连接到p35S-NOS的XbaI位点。ORF扩增采用含有下划线所示XbaI识别序列的以下引物。

[0229] (MpDES6 ORF扩增用引物)

[0230] MpD6-21F：5’-GCTCTAGAGCGATGGCCTCGTCCACCACC-3’(序列号27)

[0231] MpD6-11R：5’-GCTCTAGACTATACTTTCGCAGCGTATGC-3’(序列号28)

[0232] (MpELO1 ORF扩增用引物)

[0233] MpD6ELO1-18F：5’-GCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACGAGATGG-3’(序列号29)[0234] MpD6ELO1-13R：5’-GCTCTAGATTATTCTGCCTTTTTGCTC-3’(序列号30)

[0235] (MpDES5 ORF扩增用引物)

[0236] MpD5-22F：5’-GCTCTAGAGACAGTTATGCCGCCACACGC-3’(序列号31)

[0237] MpD5-23R：5’-GCTCTAGAAGGCCCAAAGCATGCTGTCAC-3’(序列号32)

[0238] 用Pyrobest DNA polymerase(Takara公司生产)0.5U，按照制造者推荐的方法，反应液量为20μl，进行PCR。反应条件为，在94℃下保持2分钟后，进行94℃下1分钟、57℃下1分钟、72℃下1分钟的反应，循环25次，然后冷却到4℃。将得到的各ORF片段用XbaI消化后，用实施例1中记载的方法进行凝胶纯化，用于克隆。

[0239] (iii)得到的各基因的表达结构(分别表示为p35S-MpDES6、p35S-MpELO1、p35S-MpDES5)均在CaMV35S启动子5’末端具有PstI位点、在NOS终止子3’末端具有EcoRI位点，利用此结构将上述3种基因的表达盒连接。首先，利用以下所示的引物，以p35S-MpDES5为模板，进行PCR，扩增MpDES5基因的表达盒部分，克隆到p35S-MpDES6的CaMV35S启动子5’末端的PstI位点。(参照图1)

[0240] (MpDES 5基因表达盒扩增用引物)

[0241] M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(序列号33)

[0242] NOS-R4-PST：5’-AAACTGCAGATTCCCGATCTAGTAACATAG-3’(序列号34)

[0243] 另外，M13R引物与CaMV35S启动子上游的载体序列退火。而NOS-R4-PST引物含有下划线所示的PstI识别序列，与NOS终止子3’末端退火。不包含同样存在于NOS终止子3’末端的EcoRI位点。

[0244] 用Pyrobest DNA polymerase(Takara公司生产)0.5U，按照制造者推荐的方法，反应液量为20μl，进行PCR。反应条件为，在94℃下保持2分钟后，进行94℃下1分钟、57℃下1分钟、72℃下1分钟的反应，循环25次，然后冷却到4℃。将得到的DNA片段用PstI消化后，用实施例1中记载的方法进行凝胶纯化，克隆到含有MpDES6基因表达盒的质粒(p35S-MpDES6)的PstI位点。

[0245] (iv)在上述得到的连有MpDES5及MpDES6基因的表达盒的结构(表示为p35S-MpDES5/35S-MpDES6)上，再连接MpELO1基因的表达盒。利用以下引物，以p35S-MpELO1为模板进行PCR，扩增MpELO1基因的表达盒部分，克隆到MpDES6基因表达盒内NOS终止子3’末端的EcoRI位点。

[0246] (MpELO1基因表达盒扩增用引物)

[0247] 35S-F3-EI：5’-CCGGAATTCGCATGCCTGCAGGTCCCCAGA-3’(序列号35)

[0248] M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(序列号36)

[0249] 另外，35S-F3-EI引物含有下划线所示的EcoRI识别序列，与CaMV35S启动子的5’末端退火。M13F引物与NOS终止子下游的载体序列退火。

[0250] 用Pyrobest DNA polymerase(Takara公司生产)0.5U，按照制造者推荐的方法，反应液量为20μl，进行PCR。反应条件为，在94℃下保持2分钟后，进行94℃下1分钟、57℃下1分钟、72℃下1分钟的反应，循环25次，然后冷却到4℃。将得到的DNA片段用EcoRI消化后，用实施例1中记载的方法进行凝胶纯化，克隆到使MpDES5及MpDES6基因的表达盒连接的结构(p35S-MpDES5/35S-MpDES6)的EcoRI部位。

[0251] 通过以上操作，制备3种基因的表达盒按照MpDES5、MpDES6、MpELO1的顺序连接的表达结构(p35S-MpDES5/35S-MpDES6/p35S-MpELO1)。

[0252] 用公知的方法(Genes Genet.Syst.73，p219，1998)，将按照上述方法得到的上述结构与以双丙氨膦为选择标记的质粒一起用微弹枪导入稻子，获得转基因稻子。

[0253] [实施例7：烟草(N.tabacum SR-1)中地钱多不饱和脂肪酸合成系统的再构建][0254] 在本实施例中证实：上述来自地钱的不饱和脂肪酸合成酶基因即MpDES6基因、MpDES5基因、MpELO1基因在植物体中良好地发挥功能。

[0255] 具体地说证实了：在烟草中导入MpDES6基因、MpDES5基因、MpELO1基因，在该烟草中可以生产花生四烯酸等。作为对照，制备导入了来自丝状菌(M.alpina)的Δ6去饱和酶基因(MaDES6)、Δ5去饱和酶基因(MaDES5)、Δ6脂肪酸碳链延长酶基因(MaELO)的烟草。

[0256] (i)含有来自丝状菌基因的载体(pSPB1519)的构建

[0257] pE2113(Mitsuhara et al.Plant Cell Physiol.37，45-591996)具有花椰菜花叶病毒35S(E1235S)启动子及胭脂碱合成酶(nos)终止子，所述花椰菜花叶病毒35S(E1235S)启动子具有反复的增强子序列。

[0258] 将pE2113用SnaBI消化后，与XhoI接头(TAKARA公司)连接，从而制备质粒。将此质粒用SacI消化后，进行末端平滑化，再与BamHI接头(TAKARA公司)连接，从而制备pUE7。将pUE7经HindIII和EcoRI消化而得到的DNA片段中具有E1235S启动子的片段、与经HindIII和EcoRI消化的植物转化用双元载体pBINPLUS(van Engelen et al.Transgenic research 4，p288，1995)连接，从而制备pSPB505。

[0259] 另一方面，将含有MaDES6基因的质粒pMLD101用XhoI消化后，再用BamHI部分消化，从而得到约1.6kb的DNA片段。将此片段与pSPB505经XhoI和BamHI消化得到的双元载体部分的DNA片段连接，从而制备pSPB559。

[0260] 将pUCAP(van Engelen et al.Transgenic research 4，p288，1995)用AscI消化后，进行末端平滑化，与PacI接头连接，从而制备pUCAPP。

[0261] 将pE2113用SnaBI消化后，与BamHI接头(TAKARA公司)连接，制备pUE6。将pUE6用SacI消化后，进行末端平滑化，与SalI接头(TAKARA公司)连接，从而制备pUE8。将pUE8经HindIII及EcoRI消化得到的DNA片段中具有E1235S启动子的片段，插入pUCAPP的HindIII-EcoRI间，从而制备质粒。将此质粒用BamHI和SalI消化得到的DNA片段、与MaELO基因的cDNA经BamHI和XhoI消化得到的DNA片段连接，制备pSPB1130。将pSPB1130用PacI消化，将得到的约2.3kb的DNA片段插入pBINPLUS的PacI位点。选择MaELO基因的转录方向与pBINPLUS上的nptII基因的转录方向相同的质粒，将该质粒作为pSPB1157P。

[0262] 将上述pSPB559用PacI消化后，进行末端平滑化，与AscI接头连接，从而制备pSPB559A。然后，将pSPB559A经AscI消化得到的含有MaDES6基因的DNA片段，插入pSPB1157P的AscI位点，从而制备pSPB1157。

[0263] 将pCGP1364(Plant Cell Physiol.36，1023，1995)经HindIII及SacII消化得到的约1.3kb的DNA片段、pCGP1364经PstI消化并进行末端平滑化后又用SacII消化得到的约2.9kb的DNA片段、pUCAPA经SacI消化并进行末端平滑化后又用HindIII消化得到的约2.7kb的DNA片段连接，从而得到pSPB184。

[0264] 另一方面，从亚克隆了MaDES5基因的pCRII载体中，通过XbaI和KpnI的消化，切割含有MaDES5基因的DNA片段。将此DNA片段与上述pSPB184经XbaI和KpnI消化得到的DNA片段连接，从而制备pSPB1519A。将pSPB1519A用AscI消化，将得到的DNA片段插入pSPB1157的AscI位点，制备pSPB1519。在此pSPB1519上，MaDES6基因、MaDES5基因及MaELO基因在同一方向上被转录，受同一组成型启动子的控制。

[0265] (ii)构建来自地钱的基因的载体(pSPB2368)

[0266] 将pUCAP(van Engelen et al.Transgenic Research 4，288-290，1995)用AscI消化后与SgfI接头连接，再用PacI消化后与FseI接头连接，从而制备pUCSAPF。此外，对pBINPLUS也实施同样的处理，制备pBINSAPF。

[0267] 作为其他亚克隆用载体，将pUC19用HindIII消化后，与PacI接头连接，再用EcoRI消化后与FseI接头连接，从而制备pUCPF。此外，将pUC19用HindIII消化后，与SgfI接头连接，再用EcoRI消化后与AscI接头连接，从而制备pUCSA。将在pUCSAPF的HindIII-XbaI间插入E1235S且在SacI-EcoRI间插入甘露碱合成酶(mas)基因终止子的载体，用XbaI及SacI消化后，将末端平滑化，从而得到pSPB2353A。在pSPB2353A的平滑末端，连接从p35S-MpDES6中用XbaI切割并进行末端平滑化后的含有MpDES6基因的DNA片段，制备pSPB2353。

[0268] 将在pUCSA的HindIII-XbaI间插入E1235S且在SacI-EcoRI间插入甘露碱合成酶(mas)基因终止子的载体，用XbaI、SacI消化，从而制备pSPB2355A。

[0269] 另一方面，以p35S-MpELO1为模板，利用下述引物XbaMpELOf和SacMpELOr，进行PCR。

[0270] XbaMpELOf：5‘-AGTCTCTAGAGCGATGGAGGCGTACG-3’(序列号43)

[0271] SacMpELOr：5‘-CAGTGAGCTCGGTGTCTTATTCTGCC-3’(序列号44)

[0272] PCR的酶采用高精度的KOD+DNA聚合酶(东洋纺)，在94℃下保持2分钟后，94℃下15秒、68℃下1-3分钟，循环25次。将这样制备的MpELO1 DNA片段经XbaI和SacI消化后的片段连接于上述pSPB2355A，制备pSPB2355。再将pSPB2355经SgfI、AscI消化得到的DNA片段，连接于经SgfI和AscI消化后的pSPB2353，制备pSPB2361。

[0273] 将在pUCPF的HindIII-XbaI位点插入E1235S且在SacI-EcoRI位点插入甘露碱合成酶(mas)基因终止子的载体，用XbaI及SacI消化，从而制备pSPB2352A。

[0274] 另一方面，以p35S-MpDES5为模板，利用下述引物XbaMpD5f和SacMpD5r，进行PCR。PCR的反应条件与上述PCR条件相同。XbaMpD5f：5’-AGCTTCTAGAGCCATGCCGCCACACGCCC-3’(配列番号45)SacMpD5r：5’-CAGTGAGCTCTCAGCCATCCAGTCGT-3’(配列番号46)[0275] 将通过PCR制备的MpD5 DNA片段用XbaI、SacI消化后，与pSPB2352A连接，制备pSPB2352。

[0276] 在pBINSAPF经PacI和FseI消化得到的DNA片断上，连接从pSPB2352用PacI和FseI切出的含有MpDES5基因的DNA片断，制备pSPB2368A。再将pSPB2368A用SgfI和PacI消化后，连接从pSPB2361用SgfI和PacI切出的含有MpDES6基因和MpELO1基因的DNA片断，从而得到pSPB2368。在此质粒上，MpDES6基因、MpDES5基因、以及MpELO1基因在同一方向上被转录，受同一组成型启动子的控制。

[0277] (iii)向烟草中导入基因

[0278] 接着，根据公知的方法(Plant J.5，81，1994)，用pSPB2368或pSPB1519转化Agrobacterium tumefaciens(菌株：A gl0(Lazo et al.1991，Biotechnology9：963-967)。使该具有pSPB2368或pSPB1519的转化体农杆菌感染烟草叶盘。从这样得到的重组烟草叶片中用RNeasy Plant miniKit(Qiagen)提取RNA，按照规定的方法，通过RT-PCR，筛选表达了导入基因的系统。

[0279] 从按照上述方法得到的导入了由来自丝状菌的酶基因构成的pSPB1519的烟草(pSPB1519转基因烟草)、导入了由来自地钱的酶基因构成的pSPB2368的烟草(pSPB2368转基因烟草)的叶片中，根据公知的方法(藤野安彦编(1978)生物化学实验法9学会出版中心、山田晃弘编(1989)生物化学实验法24学会出版中心)进行脂质的提取。将得到的脂质用气相色谱法(Hewlett Packard公司HP-6800)进行分析，分析结果在表1中显示。

[0280] 另外，作为对照，用没有导入基因的烟草叶片进行同样的分析。

[0281] [表1]

[0282]花生四烯酸 0 0 10.27 1.49 0
二十碳四烯酸 0 0 4.89 0.71 0
二十碳五烯酸 0 0 2.68 0.39 0
全脂质量 - 12.25 - 14.48 -

[0283] 本实施例的气相色谱法的分析条件如下所示。

[0284] (气相色谱法分析条件)

[0285] 色谱柱：Supelco SP-2330、Fused Sili ca Capillary Column、30mx0.32mm ID、0.2μm

[0286] 温度：In j：240℃、Det：250℃、Oven：180℃3分、180℃→220℃(2℃/min)[0287] 柱流量：30cm/sec、压力200kPa、检测器FID

[0288] 根据标准脂肪酸甲酯的保留时间和GC-MASS(Hewlett Packard公司、HP-5973)分析，决定色谱中的各个峰值，此外，由峰面积决定各脂肪酸的比例。

[0289] 在表1中，Control表示对照，pSPB2368表示pSPB2368转基因烟草，pSPB1519表示pSPB1519转基因烟草。

[0290] 由表1所示的结果可知：在导入了由来自丝状菌的酶基因构成的pSPB1519的烟草(pSPB1519转基因烟草)中，有二均-γ-亚麻酸的蓄积，但没有花生四烯酸的蓄积。而在导入了由来自地钱的酶基因构成的pSPB2368的烟草(pSPB2368转基因烟草)中，不仅有花生四烯酸的蓄积，还有二十碳四烯酸和二十碳五烯酸的蓄积。由此可知，在高等植物中，来自地钱的酶在功能上优于来自丝状菌的酶，能够以亚油酸、α-亚麻酸为底物合成以花生四烯酸为代表的多不饱和脂肪酸。

[0291] Abbadi等报道：将硅藻(Phaeodactylum tri cornutum)的Δ6去饱和酶基因、Δ5去饱和酶基因、以及小立碗藓(Physcomitrella patens)的碳链延长酶基因导入烟草及亚麻(Linum usitatissimum)中，使烟草种子中蓄积1.5％花生四烯酸，使亚麻种子中蓄积1.0％花生四烯酸(Amine Abbadi et al.Plant Cell 16，2734-2748，2004)。

[0292] 在本实施例中，将来自地钱的Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶及碳链延长酶的基因导入烟草后，在烟草叶中蓄积10％或大于10％花生四烯酸。此结果表明，与上述报道相比，本实施例的pSPB2368转基因烟草具有更高效地合成多不饱和脂肪酸的能力。

[0293] 此外，在用定鞭藻(Isochrysis galbana)的Δ9碳链延长酶基因、小眼虫(Englena gracilis)的Δ8去饱和酶基因、丝状菌的Δ5去饱和酶基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中进行脂质改变的报道中，可知叶片中花生四烯酸占总脂质的6.6mol％、碳原子数为20或大于20的脂质占22.5mol％(Baoxiu Qi et al.Nature Biotechnology 22，739-745，2004)。在此报告中，经不同于采用Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶及碳链延长酶的修饰路径合成多不饱和脂肪酸，不能简单地作比较，但可知利用来自地钱的酶可蓄积更多的多不饱和脂肪酸。

[0294] 在总脂质的30％或大于30％是改变的脂肪酸的pSPB2368转基因烟草中，没有发现形态异常。而且，育性上也没问题，产生许多种子，从中可知异位多不饱和脂肪酸的增加对植物的生长影响小。

[0295] 根据至今为止的报道，在基因重组植物中生产的碳原子数20或大于20的多不饱和脂肪酸占总脂质的20％左右已经是最高限，就花生四烯酸而言，最高为6％左右。但是，按照本实施例的方法，通过利用来自地钱的脂肪酸合成酶，可以打破上述界限，在植物中生产更多的多不饱和脂肪酸。

[0296] 另外，基于具体实施方式的具体实施形态或实施例是对本发明技术内容的说明，不应该只限于上述具体例子被狭义地解释，在本发明的精神和所述权力要求的范围内，可以进行各种变更后实施。

[0297] 本发明涉及的基因是从同一种地钱中分离的Δ5去饱和酶基因、Δ6去饱和酶基因及Δ6碳链延长酶基因。因此具有这样的效果：与使来自不同生物种类的多个基因在植物体内表达时相比，使上述3种基因在植物体内同时表达能发挥更好的功能。还具有这样的效果：因为地钱被认为是高等植物的模式系统，所以这些基因比来自植物以外的生物种类基因在植物体内能更好地发挥功能。

[0298] 而且，本发明涉及的转化体可以生产花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)等多不饱和脂肪酸。特别是，本发明涉及的转基因植物可以在成本低且环保的生产过程中生产花生四烯酸、EPA等多不饱和脂肪酸。按照上述方法得到的花生四烯酸、EPA可作为廉价多用途的材料得到应用。而且，当上述转基因植物体作为食品时，因其花生四烯酸、EPA的含量高，所以具有很高的价值。

[0299] 综上所述，本发明的基因·蛋白质在花生四烯酸、EPA的生产中很有用。而且，可表达地导入了本发明的基因的转化体在制药产业、食品产业、各种材料产业等产业中生产花生四烯酸、EPA时极其有用。尤其当上述转化体是植物体时，因植物体内花生四烯酸、EPA的含量增加，所以在农业领域等领域上也非常有用。