用于水溶性阳离子两亲性药用活性物质给药的药物递送系统

摘要

一种用于水溶性阳离子两亲性药用活性物质(API)给药的药物递送系统(DDS)，该DDS包括由API和N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的Na盐和/或N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的Na盐形成的水溶性差的纳米颗粒。包括这样的DDS的药用组合物。用于制备这样的DDS和这样的药用组合物的方法。这样的DDS和药用组合物用于治疗癌症的用途。

权利要求

1.一种用于药用活性物质给药的药物递送系统，所述药用活性物质本身为阳离子两亲性分子，且自身的水溶解度为至少4mg/ml，其特征在于，所述药物递送系统包括水溶解度在

0.1mg/ml以下的小于50nm的纳米颗粒，所述纳米颗粒由所述物质与N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或他们的组合物结合而形成。

2.根据权利要求1所述的药物递送系统，其特征在于，所述纳米颗粒的水溶解度在

0.01mg/ml以下。

3.根据权利要求1或2所述的药物递送系统，其特征在于，所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合。

4.根据权利要求1或2所述的药物递送系统，其特征在于，所述物质为细胞毒素或细胞生长抑制化合物。

5.根据权利要求4所述的药物递送系统，其特征在于，所述细胞毒素或细胞生长抑制化合物为质子化形式的多柔比星、米托蒽醌、表柔比星、柔红霉素、伊达比星、托泊替康、依立替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、安吖啶、丙卡巴肼、氮芥或它们的组合物。

6.根据权利要求5所述的药物递送系统，其特征在于，所述化合物为质子化形式的多柔比星。

7.根据权利要求5所述的药物递送系统，其特征在于，所述化合物为质子化形式的米托蒽醌。

8.根据权利要求4所述的药物递送系统，用于治疗癌症。

9.一种药用组合物，包含可药用载体和根据前述权利要求中任一项所述的药物递送系统。

10.一种药用组合物，包含可药用载体和根据权利要求4-7中任一项所述的药物递送系统。

11.根据权利要求9或10所述的药用组合物，其特征在于，所述药用组合物为水溶液、凝胶、乳膏、软膏、片剂、胶囊或软胶囊的形式。

12.N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物在制备根据权利要求1-8中任一项所述的药物递送系统中的用途。

13.N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物用于使自身的水溶解度为至少4mg/ml的阳离子两亲性物质疏水化的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述阳离子两亲性物质为细胞毒素或细胞生长抑制化合物。

15.一种用于制备药物递送系统的方法，所述药物递送系统用于至少一种本身为阳离子两亲性分子且自身的水溶解度为至少4mg/ml的药用活性物质的给药，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合以形成水溶解度在0.1mg/ml以下的小于50nm的纳米颗粒。

16.根据权利要求15所述的方法，其中N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。

17.根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

18.一种制备包括可药用载体和根据权利要求1-8中任一项所述的药物递送系统的药用组合物的方法，其中所述药用活性物质与0.2-10当量的量的N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合，所述当量基于包含在所述药物递送系统中的两亲性分子的阳离子电荷。

19.一种用于增强至少一种药用活性物质的药物功效的方法，所述药用活性物质本身为阳离子两亲性分子，且自身的水溶解度为至少4mg/ml，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合以形成水溶解度在0.1mg/ml以下的纳米颗粒。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述物质与0.2-10当量的过量的所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合。

22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

23.一种用于提高至少一种药用活性物质的生物利用度的方法，所述药用活性物质本身为阳离子两亲性分子，且自身的水溶解度为至少4mg/ml，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合以形成水溶解度在0.1mg/ml以下的纳米颗粒。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述物质与0.2-10当量的过量的所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合。

26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

27.根据权利要求1-8中任一项所述的药物递送系统在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

28.根据权利要求9-11中任一项所述的药用组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

说明书

用于水溶性阳离子两亲性药用活性物质给药的药物递送系

统

技术领域

[0001] 本发明涉及用于两亲性阳离子药用活性物质给药的药物递送系统、包含这样的药物递送系统的药用组合物和制备这样的药物递送系统的方法。本发明还涉及这样的药物递送系统在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

[0002] 而且，本发明还涉及用于增强两亲性药用活性物质的药物功效的方法，和用于提高两亲性药用活性物质的生物利用度的方法。

背景技术

[0003] 与药物功效有关的两个重要的参数是“治疗指数”(也被称为“治疗比”)和“治疗窗”。治疗指数是起到治疗作用的治疗剂的量与引起有毒效果的量的比较。定量地，其是由产生有毒效果所需剂量除以治疗剂量得到的比例。通常使用LD50除以ED50测量治疗指数。治疗窗是用于估计可以有效地治疗疾病同时处于安全范围的药物剂量的参数。它是介于ED50和LD50曲线起始点之间的范围。据信调节该参数可以有助于避免大多数潜在的副作用。

[0004] 具有窄治疗窗的药物是普遍的，并且常见于多组药物中，例如抗心律失常药、抗痉挛药、强心苷类、氨基糖苷类、细胞毒素类和免疫抑制剂。

[0005] 大多数抗肿瘤剂具有非常窄的治疗窗。一种改善这样的试剂的治疗指数的方法是使用合适的输注方案。理想地，药物浓度在期望时间范围内保持在治疗窗内，之后，快速离开身体。延长输注过程通常显示出良好的功效，具有的副作用很少。例如，延长输注过程是减少多柔比星的心脏毒性的最有效方式，多柔比星是一种主要使用的抗癌药。然而，延长输注过程(有时多至72小时)昂贵且不方便。因此，已经通过使用可以确保活性成分从多种药物贮库中缓慢释放的药物递送系统进行了较大努力来模拟这样的输注。包括这样的贮库的药物递送系统通常通过将药物包囊(encapsulation)在各种聚合物、聚合物囊泡(polymerosomes)、脂质体或微乳液的纳米颗粒中来提供。

[0006] 然而，为了保护自身不受不同种类的有害入侵者(比如病毒、细菌和真菌孢子)的侵害，人体和动物体发展了消除或分解大于约50纳米的颗粒的机制。网状内皮系统(RES)是免疫系统的一部分，是这样的颗粒的最有效的破坏者。RES靶向颗粒的概率随颗粒尺寸的增加而显著地增加。

[0007] 许多药物以阳离子两亲性的形式提供，例如其结构中具有一个或多个氨基的药物。在酸性环境中，这些药物物质转化成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、乳酸盐或酒石酸盐，且主要以质子化形式存在。这些转化增加了药物在水溶液中的溶解度，使得能够使用这些溶液进行i.v.输注。在输注后，由于血液的pH为约7.4，因此环境转变成微碱性，从而引起药物去质子化。这反而降低了所述物质的溶解度，其通过增加蛋白结合的程度、促进物质渗透进入细胞并降低肾脏清除率改善了药物的PK/PD性质。许多抗肿瘤药都以阳离子两亲性的形式提供，并且对于药物应用描述的给药途径，所述药物例如多柔比星及其类似物(表柔比星、柔红霉素、伊达比星)、长春花生物碱(长春碱、长春新碱、长春瑞滨)、安吖啶、米托蒽醌、托泊替康和依立替康。

[0008] US 2004048923描述了一组类视黄醇，其包括多种物质，其中包括N-(全反式视黄酰基(retinoyl))-L-半胱氨酸甲酯的钠盐和N-(13-顺式-视黄酰基)-L-半胱氨酸甲酯的钠盐。据说该物质使制备水溶性差的药用化合物如紫杉醇和多西他赛的新的胶束制剂成为可能。US 2004048923的教导不是旨在提供具有降低的水溶解度和改善的包囊容量的更小的纳米颗粒的形成方法。

发明内容

[0009] 人们期望能够创制一种用于水溶性两亲性阳离子药用活性物质给药的药物递送系统，该系统将提供具有降低的水溶解度和改善的包囊容量的更小的纳米颗粒的形成方法。这将得到更好的PK/PD性质，并且改善了给药药物的治疗指数。

[0010] 本发明的一个目的是提供这样的药物递送系统。

[0011] 因此，本发明的一个方面涉及一种用于本身为阳离子两亲性分子且自身的水溶解度至少为4mg/ml的药用活性物质给药的药物递送系统，该药物递送系统包括水溶解度在0.1mg/ml以下的纳米颗粒，所述纳米颗粒是由所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物结合而形成的。

[0012] 本发明的药物递送系统提供小于约50nm的纳米颗粒，所述甲酯赋形剂的包囊容量(表示为赋形剂的重量与被包囊的药物重量的比例)为约1.2。

附图说明

[0013] 在下述说明书、实施例和附图中将更详细地描述本发明，其中

[0014] 图1示出了通过使阳离子两亲性分子与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合从而形成基本上水不溶性纳米颗粒的方案。

[0015] 图2显示由N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和多柔比星盐酸盐(w/w比例为2.3∶1)形成的颗粒的尺寸对多柔比星浓度的依赖关系。溶剂：NaCl(130mmol)、CaCl2(2mmol)和MgCl2(0.8mmol)的水溶液。

[0016] 图3显示在稀释w/w比例为2.1∶1的N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和多柔比星盐酸盐的制剂后，溶解颗粒的动力学。溶剂：NaCl(5.9mg/ml)、KCl(0.3mg/ml)、CaCl2(0.295mg/ml)、六水合MgCl2(0.2mg/ml)、乙酸钠(4.1mg/ml)的水溶液。多柔比星从2mg/ml稀释至0.04mg/ml。

[0017] 图4显示通过在NaCl(9mg/ml)溶液中重建多柔比星、N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(w/w/w 1∶1.05∶1.05)的冷冻干燥混合物得到的制剂按体积的尺寸分布，多柔比星的浓度为0.5mg/ml。

具体实施方式

[0018] 在公开和描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文公开的特定构型、制备步骤和材料，因为这样的结构、制备步骤和材料可以发生某种程度的变化。还应当理解，本文所用的术语是仅仅用于描述特定实施方案的目的，而不意味着限制，因为本发明的范围仅仅由附加权利要求书和其同等物来限制。

[0019] 必须指出，如在本说明书和权利要求书中使用的单数形式“一个(种)”和“所述的”包括复数个指示物，除非上下文另有明确地规定。

[0020] 在本说明书中，除非另有说明，术语“约”修饰在本发明的药物递送系统或组合物中的成分的量或应用于本发明的方法中时，其指所述数量可能会有所偏差，其可能由于下述原因而出现，例如，由于在实际工作中为了制造浓缩物的或使用溶液而进行的典型的测量和液体处理方法；由于制备药物递送系统或组合物或实施所述方法使用的成分的制备方法、来源或纯度的差异；以及类似原因。术语“约”还包括因为由特定的初始混合物得到的组合物的平衡条件不同而导致的不同的量。无论是否用术语“约”修饰，权利要求书包括所述量的当量。

[0021] 在本说明书中，除非另有说明，术语“可药用载体”指无毒的惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或任何类型的制剂助剂。

[0022] 在本说明书中，除非另有说明，术语“药物递送系统”指递送治疗剂至期望的身体部位和/或使治疗剂及时释放的制剂或装置。

[0023] 在本说明书中，除非另有说明，术语“药用活性物质”包括当给药至宿主，包括人类和动物时，将产生治疗有益的药理学反应的任何物质。

[0024] 在本说明书中，除非另有说明，术语“颗粒尺寸”指通过动态光散射使用波长633nm的红色激光测量的Z-平均直径。

[0025] 在本说明书中，除非另有说明，术语“纳米颗粒”指其尺寸以纳米计的微观粒子。

[0026] 在本说明书中，除非另有说明，术语物质的“溶解度”指在接近室温下，物质溶于特定溶剂中的能力，所述接近室温指约15℃至约38℃。

[0027] 在本说明书里，除非另有说明，术语“细胞毒素化合物”指具有阻止细胞生长或杀死其的能力的化合物。

[0028] 在本说明书里，除非另有说明，术语“细胞生长抑制化合物”指具有使细胞进入永久非增殖状态(尽管不一定裂解或杀死细胞)的能力的化合物。

[0029] 在本说明书中，除非另有说明，术语“衍生物”指直接通过原始结构的化学反应、或通过部分替代原始结构的“修饰”、或通过设计和从头合成，由原始结构形成的化合物。衍生物可以是合成的，或者可以是细胞或体外酶促反应的代谢产物。

[0030] 在一个实施方案中，本发明的药物递送系统的纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

[0031] 在另一个实施方案中，所述药用活性物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合。

[0032] 所述阳离子药用活性物质可以例如具有一个或多个氨基；共存阴离子可以是例如氯离子、硫酸根、乳酸根或酒石酸根。所述物质可以是天然、合成或半合成来源的。

[0033] 在一个实施方案中，所述药用活性物质为细胞毒素或细胞生长抑制化合物；在该实施方案的一个方面，所述细胞毒素或细胞生长抑制化合物为质子化形式的多柔比星、米托蒽醌、表柔比星、柔红霉素、伊达比星、托泊替康、依立替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、安吖啶、丙卡巴肼、氮芥或它们的组合物；在一个具体的方面，所述化合物为质子化形式的多柔比星；在另一个方面，所述化合物为质子化形式的米托蒽醌。

[0034] 根据本发明的其它实施方案，还提供了：

[0035] -本发明药物递送系统在制备用于治疗癌症的药物中的用途，和用于治疗癌症的方法，在所述方法中向需要这样的治疗的患者以治疗有效量给药本发明的药物递送系统；和

[0036] -本发明药用组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，和用于治疗癌症的方法，在所述方法中向需要这样的治疗的患者以治疗有效量给药本发明的药用组合物。

[0037] 本发明的另一个实施方案涉及一种药用组合物，其包括可药用载体和这种药物递送系统。在该实施方案的一个方面，所述药用活性物质为细胞毒素或细胞生长抑制化合物；在该实施方案的一个方面，所述药用组合物可以以水溶液、凝胶、乳膏、软膏、片剂、胶囊或软胶囊(softgel)的形式提供。

[0038] 这样的组合物可以通过例如混合包含一个或多个质子化氨基的药用活性物质例如盐酸盐、硫酸盐、乳酸盐或酒石酸盐的的水溶液与每个氨基超过一当量的N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物来制备。其由下式表示，以盐酸盐为例：

[0039] (药物-NH3)n+Cl-n+n AnSurfact-O-Na+→(药物-NH3)n+AnSurfact-O-n+n NaCl[0040] 其中

[0041] 术语“AnSurfact-O-”表示N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯或N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯或它们的组合物的阴离子；和

[0042] 术语“(药物-NH3)n+”表示具有质子化氨基的药用活性物质。

[0043] 可见，n当量的AnSurfact-O-与(药物-NH3)n+结合从而形成符合所述式的基本上-水不溶性的复合物，余量的AnSurfact-O 用于确保得到的复合物的溶解度。

[0044] 过量的AnSurfact-O-可以在0.2-10当量的范围内。可以使用纯净水或不同的水-溶液作为该方法中的溶剂。通过混合药物的铵盐与AnSurfact-O 得到的这些新组合物可以直接使用或者冷冻干燥用于进一步的用途。

[0045] 本发明的一个进一步的实施方案涉及N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物在制备这样的药物递送系统中的用途。

[0046] 本发明的一个进一步的实施方案涉及N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物在使自身的水溶解度为至少4mg/ml的阳离子两亲性物质疏水化(hydrophobation)中的用途；在该实施方案的一个方面中，所述阳离子两亲性物质为细胞毒素或细胞生长抑制化合物。

[0047] 本发明的另一个实施方案涉及一种用于制备药物递送系统的方法，该药物递送系统用于至少一种本身为阳离子两亲性分子且自身的水溶解度为至少4mg/ml的药用活性物质的给药，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合以形成具有水溶解度低于0.1mg/ml的纳米颗粒；在该实施方案的一个方面，所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。在该实施方案的一个进一步的方面，所述物质与约0.2-10当量的过量的所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合。在该实施方案的一个具体实施方案中，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

[0048] 在该实施方案的一个方面，N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物按照1∶1的mol/mol比例与多柔比星或其类似物的盐酸盐、硫酸盐、乳酸盐或酒石酸盐混合，以提供基本上不溶于水的纳米颗粒，所述类似物比如表柔比星、柔红霉素或伊达比星；托泊替康；依立替康；或安吖啶。

[0049] 在具有多于一个氨基的药用活性物质例如米托蒽醌和长春花生物碱的情况下，N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物的量应与质子化氨基的数量相一致。

[0050] 本发明的另一个实施方案涉及一种制备包含可药用载体和根据权利要求1-8中任一项所述的药物递送系统的药用组合物的方法，其中所述药物递送系统与约0.2-10当量的量的N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合，所述当量基于包含在所述药物递送系统中的两亲性分子的阳离子电荷。

[0051] 本发明的另一个实施方案涉及一种用于增强至少一种药用活性物质的药物功效的方法，所述药用活性物质本身为阳离子两亲性分子，且自身的水溶解度为至少4mg/ml，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合从而形成水溶解度在0.1mg/ml以下的纳米颗粒；在该实施方案的一个方面，所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。

[0052] 在该实施方案的一个进一步的方面，所述物质与约0.2-10当量的过量的所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或他们的组合物联合。在该实施方案的一个具体实施方案中，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

[0053] 本发明的另一个实施方案涉及一种用于提高至少一种药用活性物质的生物利用度的方法，所述药用活性物质本身为阳离子两亲性分子，且自身的水溶解度为至少4mg/ml，其中所述物质与N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物联合从而形成水溶解度在0.1mg/ml以下的纳米颗粒；在该实施方案的一个方面，所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物非共价地结合所述物质。在该实施方案的一个进一步的方面，所述物质与约0.2-10当量的过量的所述N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或他们的组合物联合。在该实施方案的一个具体实施方案中，所述纳米颗粒的水溶解度在0.01mg/ml以下。

[0054] 本发明药物递送系统的纳米颗粒提供较低的极性和降低的水溶解度，其反而使细胞膜渗透性有所提高并且与蛋白的结合更强，从而引起功效增加。

[0055] 在下述非限制性实施例中将更详细地阐述本发明。

[0056] 实施例

[0057] 材料和方法

[0058] 使用的制剂为新制备的或通过用特定的重建溶液重建冷冻干燥的药用活性物质与N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐或它们的组合物得到的。

[0059] 多柔比星购自日本Mercian公司。米托蒽醌、托泊替康和伊立替康购自瑞典Chemtronica KB。Adriamycin和Doxil购自药房，根据制造商的处方信息重建。

[0060] 通过动态光散射方法使用红光激光(633nm，Nano-ZS，英国马尔文仪器有限公司)测量制剂的颗粒尺寸。计算三次独立测量值的平均值用于绘制颗粒尺寸曲线图。Y-误差线由测量值的+/-标准差组成。

[0061] 为了评价体外细胞毒性，从美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection)(美国马里兰州洛克维尔市)购买不同的人类肿瘤细胞系的细胞：人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC-HTB-26，Lot3576799)、人类卵巢腺癌细胞系SKOV-3(ATCC-HTB-77，Lot 3038337)和人类肺非小癌细胞系A549(ATCC-CCL-185，Lot3244171)。MDA-MB-231细胞是在含有2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FBS)和抗生素的MEM培养基中增殖的。SKOV-3细胞是在补充有1.5mM L-谷氨酰胺、10％FBS和抗生素的McCoy′s 5A培养基中培养的。所有的培养基和补充剂都购自Sigma-Aldrich Co.(美国TM 2
密苏里州圣路易斯市)。所有系的细胞增殖都在BD Falcon 25或75cm 培养瓶(Becton Dickinson Labware)中进行。A549细胞是在在含有1mM L-谷氨酰胺、10％FBS和抗生素TM 2
的Ham′s F-12培养基中培养的。所有系的细胞增殖都在BD Falcon 25或75cm 培养烧瓶中进行。

[0062] 使用用于粘附细胞的BD FalconTM 96孔培养板(Becton DickinsonLabware)进行3
药物细胞毒性试验。用细胞接种这些板，接种体积200μl/孔，对于MDA-MB-231为8×10
3 3
细胞/孔，对于SKOV-3为10×10 细胞/孔，或对于A549为6×10 细胞/孔。将烧瓶和培养板都置于37℃下95％空气和5％CO2的湿润气氛中温育，以使细胞生长。

[0063] 使培养板中的细胞培养物在24小时的温育中进行粘附。在细胞接种后的第1天，将在合适溶剂中浓度不同的待测制剂的溶液4μl加入到含有培养物的孔中(剂量-反应试验)。在对照培养物中，加入4μl的溶剂作为溶剂对照。连续温育所述细胞2-4天。在温育期结束时，通过胰蛋白酶消化分离粘附的细胞，并使用台盼蓝不相容试验和血细胞计数器计数活细胞数量。所有的试验进行至少三次，数据来源于三次测量(每次四个复制样本)的平均值。将结果表示为平均细胞数±SE，利用Student’s t检验评价对照组和试验组之间的差异。基于细胞生长抑制的程度评价药物细胞毒性。如下计算测试药物的细胞生长抑制性：

[0064]

[0065] 在对照组中，将用于药物试验的不同的溶剂4μl加入到培养物中作为阴性溶剂对照。这些对照组之间的差异没有显著性；因此，使用阴性对照的平均值进行计算。

[0066] 使用同类化合物如多柔比星盐酸盐、米托蒽醌二盐酸盐、托泊替康盐酸盐等以及它们的市售制剂的溶液作为阳性对照。这些药物在不同溶剂中的生长抑制没有显著性差异；因此，使用阳性对照的平均抑制进行计算。

[0067] 基于至少三个独立的试验计算平均IC50±SE。

[0068] 用对照的比较药物的IC50除以本发明制剂的IC50来计算增强因子(EF)。

[0069] 实施例1

[0070] 多柔比星盐酸盐向去质子化形式的转化

[0071] 将20mg的多柔比星盐酸盐(0.034mmol)(水溶解度大于25mg/ml)溶于10ml的水中。将3.4ml的氢氧化钠(0.01M)在搅拌的同时加入到所述溶液中。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能的大的产物团聚体。通过UV方法在波长495nm测量胺形式的多柔比星的溶解度，其等于0.015mg/ml。

[0072] 实施例2

[0073] 米托蒽醌二盐酸盐向去质子化形式的转化

[0074] 将26mg的米托蒽醌二盐酸盐(0.05mmol)溶于10ml的水中。将10ml的氢氧化钠(0.01M)在搅拌的同时加入到该溶液中。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能的大的产物团聚体。通过UV方法在波长660nm测量胺形式的米托蒽醌的溶解度，其等于0.03mg/ml。

[0075] 实施例3

[0076] 托泊替康盐酸盐向去质子化形式的转化

[0077] 将23mg的托泊替康盐酸盐(0.05mmol)溶于10ml的水中。将5ml的氢氧化钠(0.01M)在搅拌的同时加入到该溶液中。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能的大的产物团聚体。通过UV方法在波长385nm测量胺形式的托泊替康的溶解度，其等于0.09mg/ml。

[0078] 实施例4

[0079] 由质子化形式的多柔比星和去质子化形式的N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯组成的颗粒的形成

[0080] 在10ml试管中混合N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(2ml，5mg/ml)和多柔比星盐酸盐(6ml，2mg/ml)的水溶液。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能的大的产物团聚体。通过UV方法在波长350nm测量得到的颗粒的溶解度，其等于0.0002mg/ml。

[0081] 实施例5

[0082] 由二质子化形式的米托蒽醌和2当量的去质子化形式的N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯组成的颗粒的形成

[0083] 在10ml试管中混合N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(2ml，5mg/ml)和米托蒽醌二盐酸盐(5.2ml，1mg/ml)的水溶液。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能的大的产物团聚体。通过UV方法在波长660nm测量得到的颗粒的溶解度，其等于0.002mg/ml。

[0084] 实施例6

[0085] 由质子化形式的托泊替康和去质子化形式的N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯组成的颗粒的形成

[0086] 在10ml试管中混合N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(2ml，5mg/ml)和托泊替康盐酸盐(4.7ml，2mg/ml)的水溶液。在混合期间，出现细小的沉淀。通过以3000rpm离心试管10分钟分离沉淀。除去上清液，用10ml的水振荡沉淀，接着再次离心。在三次另外的如上所述的洗涤步骤之后，用0.2mm过滤器过滤上清液，以除去可能大的产物聚集体。通过UV方法在波长364nm测量得到的颗粒的溶解度，其等于0.024mg/ml。

[0087] 实施例7

[0088] 含有N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐的多柔比星制剂的制备

[0089] 在搅拌下，将50ml的多柔比星盐酸盐溶液(8.6mg/ml)滴加到在500ml圆底烧瓶中的200ml包含N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(3mg/ml)和13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(3mg/ml)的溶液中。继续搅拌另外20分钟。得到的制剂中多柔比星的浓度为1.6mg/ml。用0.2mm过滤器过滤得到的溶液，并冷冻干燥。过滤没有引起多柔比星浓度降低。

[0090] 实施例8

[0091] 含有N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐的托泊替康制剂的制备[0092] 在500ml的圆底烧瓶中，混合托泊替康盐酸盐(120ml，1.09mg/ml)和N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(32ml，15mg/ml)的甲醇原液，并在真空中蒸发。将120ml的氯化钠溶液(9mg/ml)加入到蒸发后得到的残余物中，并搅拌该混合物直到其变得澄清透明(约20分钟)。在得到的溶液中托泊替康的浓度为1mg/ml，相当于托泊替康盐酸盐的浓度为1.09mg/ml。用0.2mm过滤器过滤得到的溶液。过滤没有引起托泊替康浓度降低。

[0093] 实施例9

[0094] 含有N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐的依立替康制剂的制备[0095] 在500ml的圆底烧瓶中，混合三水合依立替康盐酸盐(100ml，1.15mg/ml)和N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(27ml，15mg/ml)的甲醇原液，并在真空中蒸发。将100ml的水加入到蒸发后得到的残余物中，并搅拌该混合物直到其变得澄清透明(约30分钟)。在得到的溶液中依立替康的浓度为1mg/ml，相当于三水合依立替康盐酸盐的浓度为
1.15mg/ml。用0.2mm过滤器过滤得到的溶液，并冷冻干燥。过滤没有引起依立替康浓度降低。

[0096] 实施例10

[0097] 由N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和多柔比星盐酸盐(w/w比例为2.3∶1)形成的颗粒尺寸对多柔比星浓度的依赖关系的研究

[0098] 通过在包含(130mmol)、CaCl2(2mmol)和MgCl2(0.8mmol)的水溶液中重建由w/w比例为2.3∶1的N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和多柔比星的混合物组成的冷冻干燥样品来制备溶液。

[0099] 表1

[0100]

[0101] 如表1和图2所示，浓度在浓度范围0.1-3mg/ml之内的降低引起颗粒尺寸减小。进一步稀释对于颗粒尺寸没有影响。

[0102] 实施例11

[0103] 颗粒溶解动力学的研究

[0104] 通过将w/w比例为2.1∶1的N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐和多柔比星盐酸盐的混合物的冷冻干燥样品溶于NaCl(5.9mg/ml)、KCl(0.3mg/ml)、CaCl2(0.295mg/ml)、六水合MgCl2(0.2mg/ml)和乙酸钠(4.1mg/ml)的水溶液中使多柔比星的浓度达到2mg/ml来制备起始溶液。将所述起始溶液稀释50倍至多柔比星的浓度为0.04mg/ml，在漩涡混合器上剧烈搅拌得到的溶液10秒，并直接用于测量平均颗粒尺寸。

[0105] 表2

[0106]

[0107] 如表2和图3所示，颗粒尺寸减小的速率随时间减慢，直到形成几乎不溶的颗粒。

[0108] 生物学评价-实施例12-15

[0109] 对不同恶性细胞培养系如乳腺癌、卵巢腺癌和肺非小细胞癌症的体外试验证实阳离子两亲性化合物制剂的活性强烈依赖于共存离子的性质和纳米颗粒的形貌。使用N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯、N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯或它们的组合物降低了阳离子两亲性化合物的溶解度，从而促进所述化合物转运穿过细胞膜，使这样的制剂的效力增加。

[0110] 在如下实施例中使用下述市售制剂作为参照： (配制成PEG化脂质体的多柔比星盐酸盐)、 (米托蒽醌盐酸盐)、 (多柔比星盐酸盐)、 (托泊替康盐酸盐)，和 (依立替康盐酸盐)

[0111] 实施例12

[0112] 所述制剂在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞系的培养物中的细胞毒性的对比性评价[0113] 通过将冷冻干燥粉末溶解在合适的水溶液中制备包含N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯和N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的纳米颗粒混合物的制剂。根据制造商的说明稀释市售制剂。将结果列在下表3中。

[0114] 表3

[0115]

[0116]

[0117] 对： 和计算增强因子。

[0118] 实施例13

[0119] 所述制剂在人类卵巢腺癌SKOV-3细胞系的培养物中的细胞毒性的对比性评价[0120] 通过将冷冻干燥粉末溶解在合适的水溶液中制备包含N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯和N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的纳米颗粒混合物的制剂。根据制造商的说明稀释市售制剂。将结果列在下表4中。

[0121] 表4

[0122]

[0123]

[0124] 对： 和计算增强因子。

[0125] 实施例14

[0126] 所述制剂在人类肺非小癌细胞系A549的培养物中的细胞毒性的对比性评价[0127] 通过将冷冻干燥粉末溶解在合适的水溶液中制备包含N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯和N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的纳米颗粒混合物的制剂。根据制造商的说明稀释市售制剂。将结果列在下表5中。

[0128] 表5

[0129]

[0130]

[0131] 对： 和计算增强因子。

[0132] 实施例15：制剂“多柔比星-N-全反式视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐-N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(w/w/w＝1∶1.05∶1.05)”在大鼠中的一个月毒性研究

[0133] 通过在盐水中重建多柔比星-N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐-N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐的冷冻干燥混合物来制备试验制剂。在58只雄性和58只雌性HanTac:WH系(GALAS)的SPF Wistar大鼠中进行该试验。将动物分成4组：组1(0.9％的盐水)、组2(多柔比星6mg/kg)、组3(题述制剂4mg/kg)和组4(题述制剂
6mg/kg)。组2接受与组4相同剂量的多柔比星，并作为与组4直接比较的阳性对照。通过每周静脉注射一次进行治疗。因为在3次剂量后(在第1、8和15天时剂量给药之后)，在组2和4中看到严重的治疗相关的临床征兆，在第22天对所有动物都没有剂量给药，但是在第29天重新开始剂量给药。当重新开始时，在第29天的剂量给药引起无法耐受的临床征兆，由于判定不得不使一些动物安乐死，决定在第33天提前终止组2和4。在第36天时组
1和3接受五分之一剂量并在第39天时终止。使用临床征兆、体重、食物消耗、检眼镜检查、临床病理学、尿液分析、尿显微镜检查、骨髓读数、器官重量记录、肉眼和显微镜检查作为标准以发现任何不良副作用。而且，在第1天时采集血样用于毒物代谢动力学评价。每周一次以4和6mg/kg/天的剂量静脉内给药题述制剂，分别给药5和4个重复剂量，引起在临床观察、体重记录、食物消耗记录方面、在血液学和临床化学分析方面、在骨髓读数方面、在器官重量测量以及在组织病理学检查方面严重的治疗相关结果。对包含多柔比星的受测的细胞生长抑制制剂预测了在多次剂量后的毒理学结果。由于严重的治疗相关的临床征兆，组
2、3和4中各有一些动物被处以安乐死。另外，发现在组2和4中各有一只动物死亡。当与对照动物相比时，在用题述制剂和多柔比星处理的所有组中都见到显著的体重降低和体重增加的降低。题述制剂的毒性特征与多柔比星类似，不同在于在阳性对照组2中，病征比如颈周围的严重发痒和搔抓(包括自我施加的创伤)更严重。而且，严重的毒性病征即腹部积液仅仅在阳性对照组2中观察到。该实施例证实与同样浓度的常规多柔比星制剂相比，纳米颗粒制剂“多柔比星-N-全反式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐-N-13-顺式-视黄酰基半胱氨酸甲酯的钠盐(w/w/w 1∶1.05∶1.05)”具有更低的毒性。

[0134] 尽管参照某些实施方案，包括发明人目前已知的最佳方式描述了本发明，但是应当理解在没有背离如权利要求中提出的本发明的范围的前提下，可以进行如对本领域普通技术人员而言显而易见的各种变化和修饰。