同源四倍体天山雪莲植株的培育方法

摘要

本发明涉及一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法。该方法利用切除根、叶后的天山雪莲无菌苗的下胚轴茎段为外植体，通过含有不同浓度秋水仙素的固体培养基进行诱导处理，诱导产生四倍体天山雪莲植株，运用四倍体的筛选鉴定技术鉴定所得四倍体天山雪莲。该方法提供了诱导四倍体产生的最佳秋水仙素浓度、处理时间、处理温度以及用于四倍体鉴定的形态学、染色体计数和流式细胞仪的改进方法。通过此方法可快速实现同源四倍体天山雪莲植株的培育，缩短育种周期，进而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪莲在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题。

权利要求

1.一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法，其特征在于按下列步骤进行：a、将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20-50sec，然后用15％H2O2溶液消毒15-50min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2-5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10-30粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；

b、将步骤a中萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

c、将步骤b中下胚轴茎段接种于添加有2％二甲基亚砜和浓度为0.05-0.20％秋水仙-2 -1素的出芽诱导培养基上处理1-3d，培养温度25-30℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时-1间16h·d ，出芽诱导培养基为MS+BA0.3-0.5mg/L+TDZ0.3-0.5mg/L+NAA0.05-0.1mg/L；

d、将步骤c中处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖-2 -1 -1培养基中培养25-30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

e、将步骤d中增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.05-0.2mg/L生根培养基中生根；

f、天山雪莲同源四倍体的筛选：将步骤e中的植株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者的外观形态之间的差异，初步确定为同源四倍体植株；

g、天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取步骤e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖组织，在温度0-4℃，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理或饱和对二氯苯水溶液预处理，卡诺固定液固定，温度60℃，1-2mol/L盐酸解离6-15min，改良苯酚品红染色液染色

10-15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，初步确定为同源四倍体植株；

h、天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取步骤e中部分植株的叶片，于常温下在装有3-5ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，～1

500-1000r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定为同源四倍体植株；

i、天山雪莲同源四倍体的移植：将步骤e中培育的植株洗去根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达82％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c、d和e中的培养基均为固体培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g中8-羟基喹啉预处理时间为2-6h，饱和对二氯苯水溶液预处理时间为5-10h，卡诺固定液固定时间为12-36h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤i温室苗床湿度为60％，温室培养温度控制在20-22℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f中所述外观形态为叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度。

说明书

同源四倍体天山雪莲植株的培育方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药用植物育种领域，具体来说，涉及一种珍稀民族药天山雪莲同源四倍体植株的培育方法。

背景技术

[0002] 天山雪莲(Saussurea involucrata Kar et Kir.)系菊科凤毛菊属多年生一次性开花结实大型草本植物，又名雪莲花或荷莲，是国家三级濒危保护种、新疆特有分布种。生长于海拔2400～4100m处的亚高山和高山悬崖陡壁之上、冰渍岩缝之中。为新疆特有的珍奇名贵中草药和高山花卉，具有重要的药用和观赏价值。雪莲耐低温、抗风寒，生长环境极为严酷、自然繁殖率低(野生环境下，种子萌发率不到5％)、生长周期长且人工栽培困难。目前，适宜雪莲生存的种群分布范围也随着全球气候变暖而日益缩小，人为的过度滥挖乱采，致使野生雪莲资源日益匮乏，物种濒临灭绝。

[0003] 天山雪莲生长期长达5～8年，根、茎、叶富含具有药用活性的次生代谢产物如生物碱、黄酮类、挥发油、内脂、甾体类、多糖等，其花蕾更富含微量元素和氨基酸等，具有活血通络、散寒除湿、抗炎镇痛、抗疲劳、终止妊娠以及滋阴壮阳等功效。多倍体植物由于染色体加倍，往往具有器官的巨大性，即根茎叶的产量较高，能较好地满足药材生产的要求；另一方面，植物染色体倍性的变化，也往往会导致次生代谢产物含量的变化，有可能获得有效成分含量高的药用植物。同时多倍体植株生态适应性及对逆境的抗性也有所增强。近年来，对天山雪莲的研究大多集中在生理、有效药用成分、药理以及基因工程等方面，关于其多倍体育种却研究甚少。因此，从根本上解决药用植物天山雪莲的品种选育，不仅对于促进人工道地性种植产业的推广和发展，而且对于高山濒危药用植物的保护、开发和利用都具有非常重要的意义。

[0004] 单倍体是指体细胞中含有本物种配子染色体数的生物个体。而一倍体是指体细胞含一个染色体组的个体。绝大多数生物为二倍体生物，其单倍体的体细胞中含一个染色体组，如果原物种本身为多倍体，那么它的单倍体的体细胞中含有的染色体组数一定多于一个。如四倍体水稻的单倍体含两个染色体组，六倍体小麦的单倍体含三个染色体组。多倍体就是指体细胞中含有三个以上染色体组的生物个体。同源多倍体是由原来的染色体组加倍形成的多倍体。鉴于此，在进行同源四倍体天山雪莲植株的培育过程中，就要确实保证细胞内的染色体数呈整数加倍，而不是单单指染色体数的简单增多，否则得到的多倍体只是杂合体(染色体数不规律增加)或嵌合体(含有不同倍性的各种细胞)，而且此类多倍体在继代增殖过程中往往会发生回复突变，且性状不稳定。为了得到纯合同源四倍体天山雪莲植株，本发明在2007100089255.X基础上进行了大幅度改进。在优化种子表面消毒方法、四倍体植株诱导条件特别是处理温度及后期增殖温度的严格控制、改用茎尖生长点为材料进行染色体压片、利用先进准确的DNA含量流式细胞仪检测技术等方面做了细化和改进，并成功实现组培四倍体植株的温室移栽，通过大量实验摸索出了一套培育纯合同源四倍体天山雪莲植株的实验方法。

[0005] 此外，本发明还结合雪莲无菌苗快速诱导丛生芽与增殖技术，利用秋水仙素处理下胚轴茎段使再生植株染色体加倍，诱导产生四倍体天山雪莲植株，结合形态学、解剖学、染色体压片以及流式细胞仪技术筛选鉴定具有优良性状且生物量和药用成分均有所提高的四倍体植株。可以克服天山雪莲在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题，对于扩大新疆特有珍稀药用植物种植面积，提高天山雪莲种植收入，满足市场需求以及推广常用中药开发利用有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法。该方法利用切除根、叶后的天山雪莲无菌苗的下胚轴茎段为外植体，通过含有不同浓度秋水仙素的固体培养基进行诱导处理，诱导产生四倍体天山雪莲植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其生物量及药用成分的含量，通过四倍体的筛选鉴定得到四倍体天山雪莲。该方法提供了诱导四倍体产生的有效秋水仙素浓度、处理时间、处理温度以及用于四倍体鉴定的形态学、染色体计数和流式细胞仪的改进方法。通过此方法可快速实现同源四倍体天山雪莲植株的培育，进而有效提高其活性成分的含量，克服天山雪莲在自然繁殖和人工种植中出现的品种退化问题。

[0007] 发明所述的一种同源四倍体天山雪莲植株的培育方法，按下列步骤进行：

[0008] a、将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20-50sec，然后用15％H2O2溶液消毒15-50min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2-5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10-30粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；

[0009] b、将步骤a中萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0010] c、将步骤b中下胚轴茎段接种于添加有2％二甲基亚砜和浓度为0-0.20％秋水仙-2 -1素的出芽诱导培养基上处理1-3d，培养温度25-30℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时-1
间16h·d ，出芽诱导培养基为MS+BA0.3-0.5mg/L+TDZ0.3-0.5mg/L+NAA0.05-0.1mg/L；

[0011] d、将步骤c中处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/-2 -1L增殖培养基中培养25-30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间-1
16h·d ；

[0012] e、将步骤d中增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.05-0.2mg/L生根培养基中生根；

[0013] f、天山雪莲同源四倍体的筛选：将步骤e中的植株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定为同源四倍体植株；

[0014] g、天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取步骤e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖组织，在温度0-4℃，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理或饱和对二氯苯水溶液预处理，卡诺固定液固定，温度60℃，1-2mol/L盐酸解离6-15min，改良苯酚品红染色液染色10-15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，初步确定为同源四倍体植株；

[0015] h、天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取步骤e中部分植株的叶片，于常温下在装有3-5ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，～1500-1000r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定为同源四倍体植株；

[0016] i、天山雪莲同源四倍体的移植：将步骤e中培育的植株洗去根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达82％。

[0017] 步骤c、d和e中的培养基均为固体培养基。

[0018] 步骤g中8-羟基喹啉预处理时间为2-6h，饱和对二氯苯水溶液预处理时间为5-10h，卡诺固定液固定时间为12-36h。

[0019] 步骤i温室苗床湿度为60％，温室培养温度控制在20-22℃。

[0020] 本发明所述同源四倍体天山雪莲植株的培育方法优点为：

[0021] 消毒方法的改进。实验室种子表面消毒是为了保证材料在培养过程中不污染。而以前的消毒方法大多采用了HgCl2，这对于药用植物来说往往会造成Hg离子的毒害和残留，废液也会引起环境重金属污染等，使用HgCl2消毒也会使种子萌发率降低。而过氧化氢的漂白作用对于雪莲种子特有的褶皱表皮结构有显著消毒效果，改进后的两步消毒法节省了时间，减少了Hg的污染，保护了环境。此外，将种子消毒前使用流水冲洗改用温水浸泡还可以达到节约水资源等成本的目的。

[0022] 诱导方法的选择。天山雪莲是多年生草本，种子量少且获取非常艰难。在试验田用浸种法、涂抹法等途径处理雪莲种子和种子苗，效果均不理想，也未获得纯合四倍体，而且还受季节的限制。在实验室中，用附加秋水仙素的固体培养基萌发天山雪莲种子，容易得到变异苗，但是多为畸形苗，后期存活率低。同时这种新萌发的苗较为脆弱，对秋水仙素的毒害作用敏感。而采用本发明将处理生长一段时间后的无菌苗经诱导获得四倍体的效果更好，在处理期间适当升高温度(25～30℃)可使诱导率显著提高，而在增殖阶段则需要适当低温(20±1℃)，通过温度的调控可使四倍体再生植株形态差异显著，诱变率高。方法可行、筛选工作量小。

[0023] 倍性鉴定方法的选择。植物形态变化鉴定四倍体最简便、也最粗略，可用于变异株的初筛；气孔所表现出来的较大性可作为鉴定四倍体的重要标准；然而外观形态的变化仅能说明植株可能发生了变异，要想更准确无误地判断其倍性还需染色体及DNA含量分子水平方面的证据。本发明在早期形态和气孔观察的基础上，再结合染色体计数和流式细胞仪对诱导得到的四倍体植株进行综合鉴定，易于操作，结果准确可靠。四种不同的倍性鉴定方法还可以在增殖扩繁、诱导筛选的各个组织培养阶段同时进行，保证了所得四倍体材料的准确定性，特别是将流式细胞仪技术引入珍稀药用植物的倍性育种和鉴定中，可以实现对四倍体材料的适时跟踪检测，针对性强、效率高。

[0024] 染色体倍性鉴定方法的选择。对诱变所得植株采用染色体计数进行倍性检测中，多围绕根尖、组培芽、愈伤、花粉、胚乳等材料进行了鉴定。但天山雪莲是多年生一次性开花结实草本植物，要实现对诱导苗的适时跟踪检测，组培芽和根尖无疑是最理想的材料。雪莲幼苗叶片基生，只有一个生长点部位，用组培芽切除后进行压片，都会对筛选得来的珍贵材料造成浪费，而将其培育到生根阶段再进行压片，则周期较长，这对于药用植物育种来说是非常不利的。本发明利用下胚轴茎段生长点成功观察到染色体，实现了对多倍体天山雪莲苗生长过程染色体数的有效、快速检测。

附图说明

[0025] 图1为本发明萌发天山雪莲无菌苗的种子外观形态图。

[0026] 图2为本发明切除根、叶留下的下胚轴茎段图。

[0027] 图3为本发明二倍体与四倍体表型比较图，其中a1、b1、c1为二倍体；a2、b2、c2为四倍体，a为叶片、b为根、c为整株。

[0028] 图4为本发明二倍体a与四倍体b气孔比较图。

[0029] 图5为本发明二倍体染色体a与四倍体染色体b图。

[0030] 图6为本发明二倍体a与四倍体b～e DNA相对含量曲线比较图。

具体实施方式

[0031] 实施例1：

[0032] 将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用浓度75％乙醇表面消毒20sec，然后用15％H2O2溶液消毒15min，将消毒后的种子用无菌水漂洗3次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；种子萌发率为73.3％(正常发芽种子数/参试种子总数)。

[0033] 将萌发生长的无菌苗切除根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0034] 将下胚轴茎段接种到添加有2％二甲基亚砜的诱导出芽培养基MS+BA0.3mg/L+TDZ0.3mg/L+NAA0.05mg/L中 处 理3d( 对 照)，培 养 温 度25-30 ℃，光 照 强 度-2 -1 -150μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0035] 将处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基-2 -1 -1中培养25d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0036] 将增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.1mg/L生根培养基中生根；

[0037] 天山雪莲同源四倍体的筛选：将疑似株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定其为二倍体；

[0038] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取对照组幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖等组织，在4℃下，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理4h，卡诺固定液固定24h，温度60℃，1mol/L盐酸解离10min，改良苯酚品红染色液染色15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，初步确定染色体为2n＝2x＝32，为二倍体植株；

[0039] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取对照组幼嫩叶片，于常温下在装有-13ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，1000r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定植株二倍体的荧光通道值PI为300；

[0040] 天山雪莲同源四倍体的移植：将培育的植株洗去根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，湿度60％，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养温度控制在22℃，天山雪莲植株炼苗移栽成活率达90％；

[0041] 不定芽存活率100％，多倍体的诱导率0％(诱导率＝多倍体数/增殖的芽数)。

[0042] 实施例2：

[0043] 将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用浓度75％乙醇表面消毒20sec，然后用15％H2O2溶液消毒15min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种15粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；种子萌发率为73.3％(正常发芽种子数/参试种子总数)。

[0044] 将萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0045] 将下胚轴茎段接种到均添加有2％二甲基亚砜和0.05％秋水仙素的诱导出芽培养基MS+BA0.3mg/L+TDZ0.3mg/L+NAA0.05mg/L中处理3d，培养温度25℃，光照强度-2 -1 -150μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0046] 将处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基-2 -1 -1中培养25d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0047] 将增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.05mg/L生根培养基中生根；

[0048] 天山雪莲同源四倍体的筛选：将疑似株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定其为四倍体；

[0049] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖等组织，在4℃下，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理2h，卡诺固定液固定12h，温度60℃，1mol/L盐酸解离6min，改良苯酚品红染色液染色10min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，染色体确定为2n＝4x＝64为四倍体植株；

[0050] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取对照组幼嫩叶片，于常温下在装有～14ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，500r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定植株四倍体的荧光通道值PI为600；

[0051] 天山雪莲同源四倍体的移植：洗去四倍体植株根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，湿度60％，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养温度控制在20℃，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达78％。

[0052] 不定芽存活率达56％，多倍体的诱导率27％(诱导率＝多倍体数/增殖的芽数)。

[0053] 实施例3：

[0054] 将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒30sec，然后用15％H2O2溶液消毒30min，将消毒后的种子用无菌水漂洗4次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种20粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；种子萌发率为75％(正常发芽种子数/参试种子总数)。

[0055] 将萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0056] 将下胚轴茎段接种到添加有2％二甲基亚砜和0.10％秋水仙素的诱导出芽培养基MS+BA0.4mg/L+TDZ0.4mg/L+NAA0.08mg/L中处理2d，培养温度28℃，光照强度-2 -1 -150μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0057] 将处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基-2 -1 -1中培养28d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0058] 将增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.1mg/L生根培养基中生根；

[0059] 天山雪莲同源四倍体的筛选：将疑似株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定其为四倍体；

[0060] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖等组织，在4℃下，经过饱和对二氯苯水溶液预处理5h，卡诺固定液固定24h，温度60℃，2mol/L盐酸解离10min，改良苯酚品红染色液染色13min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，染色体确定为2n＝4x＝64为四倍体植株；

[0061] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取疑似株幼嫩叶片，于常温下在装有～13ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，1000r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定植株四倍体的荧光通道值PI为600；

[0062] 天山雪莲同源四倍体的移植：洗去四倍体植株根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，湿度60％，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养温度控制在21.5℃，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达85％。

[0063] 不定芽存活率43％，多倍体的诱导率达61％(诱导率＝多倍体数/增殖的芽数)。

[0064] 实施例4：

[0065] 将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用浓度75％乙醇表面消毒40sec，然后用15％H2O2溶液消毒40min，将消毒后的种子用无菌水漂洗5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种30粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；种子萌发率为86.4％(正常发芽种子数/参试种子总数)；

[0066] 将萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0067] 将下胚轴茎段接种到添加有2％二甲基亚砜和0.15％秋水仙素的诱导出芽培养基MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L中处理1d，培养温度30℃，光照强度-2 -1 -150μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0068] 将处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基-2 -1 -1中培养30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0069] 将增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.15mg/L生根培养基中生根；

[0070] 天山雪莲同源四倍体的筛选：将疑似株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定其为四倍体；

[0071] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖等组织，在4℃下，经过0.002mol/L 8-羟基喹啉预处理6h，卡诺固定液固定36h，温度60℃，1.5mol/L盐酸解离12min，改良苯酚品红染色液染色15min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，染色体确定为2n＝4x＝64为四倍体植株；

[0072] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取疑似株幼嫩叶片，于常温下在装有～15ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，1000r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定植株四倍体的荧光通道值PI为600；

[0073] 天山雪莲同源四倍体的移植：洗去四倍体植株根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，湿度60％，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养温度控制在21℃，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达74％。

[0074] 不定芽存活率35％，多倍体的诱导率49％(诱导率＝多倍体数/增殖的芽数)。

[0075] 实施例5：

[0076] 将天山雪莲种子用温水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒50sec，然后用15％H2O2溶液消毒50min，将消毒后的种子用无菌水漂洗2次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种25粒种子，7-15天后雪莲种子即可萌发产生无菌苗；种子萌发率为55.1％(正常发芽种子数/参试种子总数)。

[0077] 将萌发生长的无菌苗切除其根部和叶片，保留下胚轴茎段部分；

[0078] 将下胚轴茎段接种到添加有2％二甲基亚砜和0.20％秋水仙素的诱导出芽培养基MS+BA0.3mg/L+TDZ0.4mg/L+NAA0.08mg/L中处理1d，培养温度29℃，光照强度-2 -1 -150μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0079] 将处理过的下胚轴茎段转入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培养基-2 -1 -1中培养30d，培养温度20±1℃，光照强度50μmol·m ·s ，光照时间16h·d ；

[0080] 将增殖的苗切成单芽后转接至1/2MS+NAA0.2mg/L生根培养基中生根；

[0081] 天山雪莲同源四倍体的筛选：将疑似株与二倍体对照植株做对比分析，根据二者在外观形态如叶片宽度、叶面积以及解剖结构上气孔保卫细胞的大小和密度之间的差异，初步确定其为四倍体；

[0082] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之一：随机剪取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽茎尖等组织，在4℃下，经过饱和对二氯苯水溶液预处理10h，卡诺固定液固定20h，温度60℃，2mol/L盐酸解离8min，改良苯酚品红染色液染色13min，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽茎尖染色体，染色体确定为2n＝4x＝64为四倍体植株；

[0083] 天山雪莲同源四倍体的鉴定之二：随机剪取疑似株幼嫩叶片，于常温下在装有～14ml细胞核提取缓冲液的培养皿中用剪刀将其剪碎，200目尼龙网过滤，900r·min 离心漂洗3次，流式细胞仪检测确定植株四倍体的荧光通道值PI为600；

[0084] 天山雪莲同源四倍体的移植：洗去四倍体植株根部附着的残留培养基，定植于草炭土∶珍珠岩∶蛭石＝3∶1∶1的温室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通风一次，每次30min，每两天浇水一次，湿度60％，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期浇水，温室培养温度控制在20.5℃，天山雪莲同源四倍体植株炼苗移栽成活率达70％。

[0085] 不定芽存活率40％，多倍体的诱导率33％(诱导率＝多倍体数/增殖的芽数)。