甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法

摘要

本发明为“甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法”，属植物基因工程技术领域，包括如下步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，3)将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，5)将苗移入生根培养基中培养出根，6)转移至小培养钵中炼苗培养，7)移栽至温室或大田。本发明利用甜高粱幼穗为外植体，采用特定的培养基成分，不同的培养条件对愈伤诱导，增殖，分化，直至得到再生植株，本发明方法能得到较高的愈伤组织诱导率，实验结果表明幼穗是建立甜高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。

权利要求

1.甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法，包括如下步骤：1)选取幼穗，旗叶期长

2-5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂，pH 5.8，3)将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为：诱导培养基+KT 0.2mg/L，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8，5)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP8-10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8，6)转移至小培养钵中炼苗培养，7)移栽至温室或大田。

2.根据权利要求1所述的方法，所述幼穗长度为2-3cm，薄片约3mm长。

3.根据权利要求1所述的方法，所述诱导培养基中培养条件为：于20～21℃暗培养

3～4周。

4.根据权利要求1所述的方法，所述继代培养为每7-10天继代一次。

5.根据权利要求1所述的方法，所述分化培养基中的培养条件为：于26-28℃光培养

2～3周。

6.根据权利要求1所述的方法，所述培养出根的标准为苗高3～5cm，根长2～3cm。

7.根据权利要求1所述的方法，所述炼苗培养的时间为7-15天。

8.根据权利要求1所述的方法，所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。

说明书

甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，特别是涉及甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法。

背景技术

[0002] 甜高粱是普通高粱的一个变种，生长耗水量仅为玉米的1/3，亩产可高达5～10吨，其茎秆汁液是发酵制造酒精和培养酵母的理想生物质原料。用甜高粱取代玉米等粮食作物作为原料生产酒精的新工艺，不仅能节约粮食、降低成本，有力地带动发酵产业、振兴酒精生产行业、而且能推进可再生能源事业和畜牧业的发展。发展甜高粱产业关键在于甜高粱新品种的选育与高效栽培。传统育种技术在甜高粱的产量、品质、抗病、抗虫等特性改良方面已发挥了重要作用，但在生产上对品种、品质要求日益提高的情况下，因受现有资源的限制，单靠传统的育种方法难以取得重大突破。利用转基因技术改良高粱品种已引起广泛的关注。植物转基因技术通常依赖于植物快捷、高频率再生体系的建立。然而，甜高粱同普通高粱一样，通过组织培养获得再生植株相对比较困难。目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。

[0003] 从甜高粱的成熟胚和未成熟胚诱导愈伤到获得整个再生植株以前虽已有过一些报道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep.5：349-351；Ma et al.，1987，Theor App Genet.73：389-394；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci.58：692-693)，但遗憾的是能够从外植体诱导胚性愈伤到再生出植株的仅限于个别几个品种(Smith and Bhaskaran，1986，Springer-Verlag，New York，pp.220-223；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep.15：
72-75)。近年来随着人们对甜高粱应用价值的重视，甜高粱组织培养方面的研究也取得了快速的发展。通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行系统研究，为甜高粱品种建立有效的组织培养再生体系提供了参考(Zhao et al.，2008，Chinese Bull Bot.25：
465-468；Zhao et al.，2010，African Journal of Biotechnology.9(16)：2367-2374)。但以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚为外植体，目前为止以幼穗为外植体的研究尚很少见有报道。

[0004] 近年来各国科学家正在致力于相关方面的研究，相比其它作物，甜高粱组织培养植株再生困难，而且受基因型的限制，因此甜高粱遗传转化研究进展缓慢，目前尚很少见成功报道。据报道，2009年美国昆士兰大学的研究人员培育出了世界上首例木质素含量降低的转基因甜高粱植株，他们将编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)的DNA片段导入甜高粱品种中，通过改变木质素的含量和组分获得了成功，该项研究成果已申请了专利(Pub.No.US 2010/0058496A1)。其它研究尚未见相关报道。

[0005] 因此建立甜高粱的遗传转化体系，通过转基因技术培育甜高粱新品种，使其更好地满足实际生产的需求。转化体系的研发将为绿色能源生物燃料和生物材料的开发利用开辟新的途径。发明内容：

[0006] 本发明的目的是提供一种以甜高粱幼穗材料的组织培养形成再生体系，为以甜高粱幼穗诱导的愈伤组织的组织培养再生体系及遗传转化方法提供基础研究。

[0007] 甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法，包括如下步骤：1)选取幼穗，旗叶期长约2-5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂pH 5.8，3)将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为：诱导培养基+KT(激动素)0.2mg/L，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基+ZT2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8，5)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH5.8，6)转移至小培养钵中炼苗培养，7)移栽至温室或大田。

[0008] 优选2-3cm幼穗，薄片约3mm长。

[0009] 所述诱导培养基中培养条件为：于20～21℃暗培养3～4周。

[0010] 所述继代培养为每7-10天继代一次。

[0011] 所述分化培养基中的培养条件为：于26-28℃光培养2～3周。

[0012] 所述培养出根的标准为苗高3～5cm，根长2～3cm。

[0013] 所述炼苗培养的时间约7-15天。

[0014] 所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。

[0015] 本发明通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养的影响比较发现，培养基中添加玉米素2.0mg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作用，可以大幅度提高诱愈率；同时在培养基中适量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗坏血酸，可以有效地减轻褐化现象，促进诱愈率的提高。本发明建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再生体系：其中愈伤组织诱导培养基为：MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L，pH 5.8；继代培养基为：诱导培养基+KT 0.2mg/L；分化培养基为：MS+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8；生根培养基为：1/2MS+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+蔗糖30g/L+8.0g/L琼脂，pH 5.8。

[0016] 本发明利用甜高粱幼穗为外植体，采用特定的培养基成分，不同的培养条件对愈伤诱导，增殖，分化，直至得到再生植株，本发明方法能得到较高的愈伤组织诱导率，但是，不同基因型来源的愈伤组织的胚性状况及再生能力差别较大。实现结果表明幼穗是建立甜高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。

附图说明

[0017] 图1：甜高粱幼穗组织培养再生体系示意图。

[0018] a：幼穗切片接种于诱导培养基；b：诱导产生愈伤；c：愈伤继代培养；d：愈伤分化出苗；e：幼苗移入生根培养基；f：幼苗生根；g：移栽温室；h：植株结实。

具体实施方式

[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0020] 下面所用的材料均有来源，公众还可以免费从申请人的实验室中得到。

[0021] 1.用于甜高粱组织培养的幼穗材料选择与准备

[0022] 本发明取旗叶期长约2～5cm的幼穗，用70％酒精进行表面消毒3min，无菌水冲洗多次；在超净台中用刀切成大小均一的薄片接种于诱导培养基[MS基础培养基+2，4-D2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂pH 5.8]置于20～21℃暗培养3～4周，使之开始脱分化，形成愈伤组织；之后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养[诱导培养基+KT(激动素)0.2mg/L]，每7～10天继代一次。挑选生长状态良好的愈伤组织接于分化培养基[MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8-10mg/L+水解酪蛋白
500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8]上26-28℃光培养2～3周，之后将愈伤组织再生出的苗移入生根培养基[1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP8-10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8]中，当长出根时(苗高3～5cm，根长
2～3cm)，洗去培养基，转移到装有消毒蛭石的小培养钵中炼苗培养7-15d，然后移栽温室或大田。

[0023] 2.选择合适的发育时期的幼穗诱导愈伤组织

[0024] 不同发育时期的幼穗(以幼穗长度为准)接种于幼穗培养基上，其愈伤诱导能力存在差别。幼穗长度小于1.0cm时诱导愈伤率很低，仅为16.7％；幼穗长度为1.0～2.0cm时期的诱愈率有所提高，可达到43.8％；当幼穗长度在2.0～3.0cm时，诱愈率达到最高，为61.7％。当幼穗长度大于5.0cm后，随着其发育时期的延长，幼穗长度的增加，愈伤组织的诱导率逐渐下降(表1)。本实验结果表明，甜高粱幼穗长度即幼穗在不同发育时期对愈伤组织的诱导具有较大的影响，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，应注意选择适宜的发育时期的幼穗。

[0025] 表1幼穗长度对愈伤组织诱导的影响

[0026]

[0027] 3.不同基因型对幼穗愈伤组织诱导的影响

[0028] 选取7种不同甜高粱基因型幼穗材料，在接种的866块外植体中共有617块外植体能诱导出愈伤组织，平均诱愈率为71.25％，褐化死亡率为28.75％。但不同基因型间诱愈率差异很大，其中以“BABUSH”诱愈率最高，可达84.23％，其次是“MN-3025”，诱愈率为79.26％；“品甜三号”诱愈率很低，仅为31.11％(表2)。说明基因型是影响甜高粱幼穗组织培养的一个重要因素，因此在实际操作中应注意选择基因型。

[0029] 表2不同基因型对甜高粱幼穗愈伤组织诱导的影响

[0030]

[0031] 注：/--表示未诱导出愈伤组织 Note：/--meant the unable inducted callus.[0032] 4.不同基因型幼穗愈伤组织的再生能力比较

[0033] 如表3所示，不同基因型愈伤组织的分化再生能力表现出明显的差异。供试的7种不同幼穗基因型中，幼穗愈伤组织分化率明显不同。在接种的368块幼穗愈伤组织中，共有228块愈伤组织能够分化再生出苗，平均分化率为61.96％，褐化死亡率为38.04％。其中“BABUSH”的分化率最高，可达94.44％，其褐化死亡率最低，为5.56％，而“品甜三号”的分化率最低，仅有26.67％，褐化死亡率则高达73.33％。此结果说明各基因型间愈伤组织分化率差异很明显，基因型也是影响其再生能力极其重要因素之一。

[0034] 表3不同基因型对愈伤组织分化率的影响

[0035]

[0036] 注：a：代表能分化出苗的愈伤组织块；b：代表分化出苗的愈伤组织占转接到分化培养基上的愈伤组织总数的百分率。

[0037] 结论：

[0038] 本发明通过比较发现不同甜高粱幼穗长度对愈伤组织的诱导率具有显著的影响(p＝0.000＜0.001)，因此，在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时，选择2-3cm的发育时期的幼穗较为合适。研究发现不同基因型幼穗材料的诱导愈伤能力及分化再生能力表现出明显的差异：平均诱愈率为71.25％，平均分化率为61.96％。经过比较从中筛选出两个具有高频再生能力的甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”，可用于进一步的遗传转化研究。