一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法

摘要

本发明公开了一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。具体步骤如下：1)血浆预处理，取新鲜鸡血，离心，除去红细胞，得到血浆。2)辛酸沉淀，向血浆中加入辛酸达到一定浓度，沉淀去除杂蛋白，离心分离，取上清液。3)柱层析，用填充有混合模式吸附剂的层析柱分离上清液，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到高纯度的免疫球蛋白IgY。本发明的特色在于开发了一条新的分离工艺，可以从鸡血中分离得到高纯度的免疫球蛋白IgY。方法的关键在于从辛酸沉淀的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY，具有操作步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。

权利要求

1.一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；

2)将血浆与pH为4.5～5.0，浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液按照体积比为1～

4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；

3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；

4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品；

所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质、以巯基苯并咪唑为配基的层析介质或者商业化介质MEP HyperCel；

所述的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5；

所述的洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。

说明书

一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。

背景技术

[0002] 禽类免疫球蛋白IgY具有生物学活性，用途广泛，可用于血清学免疫诊断(夹心法ELISA检测、免疫扩散、免疫吸附和补体结合等)和免疫治疗(鸡鸭的病毒性疾病、婴儿和幼畜的轮状病毒感染等)。通常IgY是从禽类蛋中获得，主要是产蛋母鸡用特定抗原免疫后，约7～10天后抗体从血液转移至卵黄，再从卵黄中分离到IgY，相关此研究的报道较多，例如专利CN1752105、CN1935841和CN101125886。但是，卵黄中脂肪含量很高(约30％)，从卵黄中提取IgY需要去除大量的脂类物质，规模化分离较为困难，因此直接从血液中分离IgY将更为有利。另一方面，我国是禽类(特别是鸡)养殖大国，禽类血液除了少部分食用外，一般作为废弃物排放，既浪费了宝贵的天然蛋白质资源，又造成了一定的环境污染问题。因此，综合利用禽类血液，特别是提取高附加值的活性蛋白，具有重要的经济价值和社会效益。

[0003] 混合模式层析是近年发展起来的新型生物分离技术，其功能配基同时兼有两种或两种以上的功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用模式，主要是疏水和静电相互作用。混合模式吸附剂的配基密度通常比较高，吸附容量大，可以通过静电相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸，特别适合于大规模的分离纯化，已经在免疫球蛋白的分离纯化中得到应用，是Protein A亲和层析的潜在替代方法。商业化的混合模式吸附剂有MEP HyperCel，由Pall公司生产。一些新型的混合模式吸附剂也有报道，如以巯基甲基咪唑或巯基苯并咪唑为配基的介质，制备方法见专利CN101279244、CN101279243和文献(Ind.Eng.Chem.Res47(23)：9566-9572，2008)。

[0004] 本发明有效地结合了辛酸沉淀与混合模式层析两种分离方法，采用辛酸沉淀去除部分杂蛋白，用混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗体选择性的特性，开发一种从鸡血中分离IgY免疫球蛋的经济高效方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。

[0006] 从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤：

[0007] 1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；

[0008] 2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2～5.0)按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；

[0009] 3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；

[0010] 4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。

[0011] 所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。

[0012] 本发明针对鸡血资源的综合开发，通过辛酸沉淀与混合模式层析的有机结合，能很好地从鸡血中分离纯化高纯度的免疫球蛋白IgY。采用辛酸沉淀去除部分杂蛋白，混合模式吸附剂直接处理辛酸沉淀后的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗体选择性，提高分离效率，简化分离步骤，得到一个经济高效的提取免疫球蛋白IgY的方法。本发明的优点在于：1)快速、成本低廉；2)分离步骤少、工艺简单、易于放大；3)过程处理量大、分离效率高；4)免疫球蛋白IgY的纯度高。

附图说明

[0013] 附图是本发明混合模式层析分离鸡血免疫球蛋白IgY的电泳谱图。

具体实施方式

[0014] 本发明提供一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法。将新鲜抗凝血液离心去除红细胞，得到血浆；用辛酸法沉淀去除部分杂蛋白，得到上清液；将上清液通过混合模式层析柱进行分离，得到免疫球蛋白IgY。本发明方法分离得到的免疫球蛋白IgY纯度大于90％。

[0015] 从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法包括如下步骤：

[0016] 1)配制0.1M的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，将鸡血与抗凝剂按照体积比为9∶1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，得到血浆；

[0017] 2)将血浆与浓度为60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2～5.0)按照体积比为1～4混合均匀，得到稀释血浆，加入辛酸，辛酸加入量为30～60μl/ml稀释血浆，4～8℃静置1～4小时，用离心机以8000～10000rpm转速离心20～30分钟，取上清液，得到免疫球蛋白IgY粗品溶液；

[0018] 3)调节免疫球蛋白IgY粗品溶液的pH至7.0～8.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有混合模式吸附剂的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到免疫球蛋白IgY溶液；

[0019] 4)将免疫球蛋白IgY溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于90％的免疫球蛋白IgY产品。

[0020] 所述的混合模式吸附剂为以巯基甲基咪唑为配基的层析介质，或者以巯基苯并咪唑为配基的层析介质，或者商业化介质MEP HyperCel；平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0～8.5；洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为3.6～4.2。

[0021] 以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

[0022] 实施例1

[0023] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液9.6ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为95.2％。

[0024] 实施例2

[0025] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入10ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约15ml，加入450μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液14.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.8)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为96.2％。

[0026] 实施例3

[0027] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2700rpm转速离心15分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入15ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)混合均匀，得到稀释血浆约20ml，加入800μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液19.4ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为97.6％。

[0028] 实施例4

[0029] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入800μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液24.3ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基-1-甲基咪唑为配基的混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为98.5％。

[0030] 实施例5

[0031] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液9.2ml。上清液用
0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为96.0％。

[0032] 实施例6

[0033] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入750μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液24.2ml。上清液用
0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充5ml以2-巯基苯并咪唑为配基的层析介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为95.4％。

[0034] 实施例7

[0035] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以2500rpm转速离心20分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入5ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)混合均匀，得到稀释血浆约10ml，加入600μl辛酸，搅拌均匀，4℃静置1小时，待杂蛋白沉淀完全，以10000rpm离心20分钟，得到上清液9.2ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为7.0，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充
5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为93.7％。

[0036] 实施例8

[0037] 取新鲜鸡血，按照9∶1(体积比)的比例加入0.1M的柠檬酸钠溶液抗凝，用离心机以3000rpm转速离心10分钟，除去红细胞，得到血浆。取5ml血浆，加入20ml 60mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)混合均匀，得到稀释血浆约25ml，加入750μl辛酸，搅拌均匀，8℃静置4小时，待杂蛋白沉淀完全，以8000rpm离心30分钟，得到上清液24.1ml。上清液用0.45μm滤膜过滤，调节pH值为8.5，取1ml作为进样样品。层析柱(内径1cm)中填充
5ml MEP HyperCel混合模式介质，平衡缓冲液为20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，洗脱液为20mM的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到免疫球蛋白IgY，电泳分析纯度为91.2％。