一种高效发酵床复合菌剂及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种高效发酵床复合菌剂，具体地说是涉及一种由枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、CGMCC1.210、植物乳杆菌CICC6073、热带假丝酵母CGMCC2.587、康宁木霉CGMCC3.4290共5株有益菌和其代谢产物(淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、有机酸、抗菌素等)组成的发酵床用复合菌剂，及其制备方法和用途。本发明提供的复合菌剂采用深层液体混合发酵工艺制成，首先将植物乳杆菌35℃液体深层发酵12h，再分别接种热带假丝酵母菌和康宁木霉30℃混合发酵12h后，再接种枯草芽孢杆菌液体深层混合发酵24h，使发酵活菌数分别控制为：1-2×109cfu/ml、5-8×108cfu/ml、3-5×108cfu/ml、3-5×109cfu/ml2-5×109cfu/ml，终止发酵，分装密封即可得到高效发酵床复合菌剂。同时本发明也提供了高效复合菌剂用途——制备发酵床垫料的方法。本发明的复合菌剂，活菌含量高，生物活性高，杂菌污染少，不仅可显著降低猪圈舍的臭味，减少蚊蝇滋生机会，达到无污染、零排放的生态养殖目的，而且制作发酵床过程简单、节省了垫料及人力等。

权利要求

1.一种高效发酵床复合菌剂，其特征在于：不仅包括植物乳杆菌CICC6073、热带假丝酵母CGMCC2.587、康宁木霉CGMCC3.4290、枯草芽孢杆菌CGMCC1.769、CGMCC1.210高活性益

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生菌，活菌数分别为1-2×10cfu/ml、5-8×10cfu/ml、3-5×10cfu/ml、3-5×10cfu/ml、9

2-5×10cfu/ml，还包括其代谢产物淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、有机酸及抗菌素。

2.如权利要求1所述的一种高效发酵床复合菌剂，其特征在于，是由下列步骤制成的：

1)、斜面菌种活化：

取安瓿管菌种，分别无菌操作接种于相应的试管斜面培养基中，植物乳杆菌30-37℃恒温培养48-72h；康宁木霉、热带假丝酵母菌25-30℃恒温培养48-72h；枯草芽孢杆菌

35-37℃恒温培养24-36h；制成试管斜面菌种，4℃冰箱保藏备用；

2)、种子液的制备：

A、植物乳杆菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，无菌操作接种于装有150-200ml的MRS培养基的500ml三角瓶中，转速100-150rpm，30-37℃恒温培养20-30h；

B、热带假丝酵母、康宁木霉菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有100-200ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，转速100-150rpm，25-30℃恒温培养

24-36h；

C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有

30-50ml的LB培养基的500ml三角瓶中，转速200-240rpm，35-37℃恒温培养8-16h；

3)、高效复合菌剂的制备

将植物乳杆菌种子液按照3-10％的接种量，接种于装有30-35L发酵培养基的50L发酵罐中，控制初始pH值为6.5-7.0，搅拌转速100-150rpm，通气量0.15-0.3V/V·min，30-37℃培养12-20h；再将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照3-10％的接种量分别同时接种，搅拌转速100-150rpm，通气量0.15-0.3V/V·min，25-30℃培养12-24h；再按照3-10％的接种量分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速160-200rpm，通气量0.3-0.8V/V·min，

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35-37℃培养12-20h；活菌数分别达到1-2×10cfu/ml、5-8×10cfu/ml、3-5×10cfu/ml、

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3-5×10cfu/ml、2-5×10cfu/ml，终止发酵，分装密封，即得高效复合菌剂；

其中步骤3)中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖40g/L，酵母膏5g/L，大豆蛋白 胨

18g/L，氯化钠5g/L，121℃灭菌20min。

3.如权利要求1或2所述的高效发酵床复合菌剂，其特征在于，是按照下列步骤制备发酵床垫料的：

1)铺10cm木屑，洒水达到30-40％湿度；

2)复合菌剂的使用量为1L/m3，将复合菌剂适当稀释，均匀泼洒在木屑表面；

3)铺10cm稻壳，洒水至30-40％湿度；

重复以上步骤2-4次，最后一层表面铺木屑10cm，将发酵池填满至50cm-100cm，喷水到湿度30-40％，发酵床垫料的铺设即完成。

说明书

一种高效发酵床复合菌剂及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于发酵床养猪的高效复合菌剂，还涉及这种复合菌剂的制备方法、用途，属于饲料添加剂领域。

背景技术

[0002] 近年来，随着我国规模化、集约化养猪业的迅猛发展，生产效率得到了极大提高，而传统水泥地面饲养模式也产生了一些弊端，一是猪粪集中排放，需要大面积的粪场和冲刷用水，浪费资源和劳力，并造成养殖环境和周边环境的严重污染，我国每年畜禽粪便产生量已达19亿吨，超过了工业固体废弃物排放量的2倍多。二是抗生素滥用造成的毒副作用、药残和细菌抗药性以及畜产品质量安全问题；因此，养猪生产必须寻求能达到降低环境污染.提高猪肉食品安全等要求的全新生猪养殖生产方式。发酵床式生态养猪模式在某种程度上满足了这些要求。

[0003] 发酵床式生态养猪模式是利用全新的自然农业理念，结合现代微生物发酵处理技术提出的一种环保、安全、有效的生态养猪法。

[0004] 发酵床式生态养殖模式的原理是利用发酵床菌种，按一定比例混合秸秆、锯末屑、稻壳粉等垫料进行微生物发酵繁殖形成一个微生态发酵床，再利用生猪的拱翻习性，使猪粪、尿和垫料充分混合，微生物以尚未消化的猪粪为营养繁殖，使猪粪、尿中的有机物质得到充分的分解和转化，臭味消失。而同时繁殖生长的大量微生物又提供了营养和菌体蛋白质为猪食用，从而使发酵床成微生态环境，因此说，发酵床养猪是一种无污染、无排放的、无臭气的新型环保生态养猪技术。

[0005] 目前，我国处于发酵床推广应用兴起阶段，相对养殖市场的大量需求，专业高效的发酵床用产品、技术显得很匮乏，为追求利润，市场上很多发酵床产品、技术良莠不齐，部分厂家直接采集土著菌，经简单处理后包装销售，产品质量和效果无法保证。有个别单位推出发酵床养猪用复合微生态制剂，但存在的问题是：生产工艺过于简单，产品质量、效果一般，制备发酵床垫料方法，仍需要进行垫料提前发酵，垫料厚度须为80-100cm，操作过程复杂，浪费人力、物力。这些都限制了发酵床的广泛推广与应用。

[0006] 针对上述存在的问题，本发明提出的解决方案是：首先根据猪粪分解原理、微生态平衡原理选择性能优良的有益菌种，即能高产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、抗菌素、菌体蛋白的菌种组合，并且菌种之间互生互利，互不拮抗；然后采用深层液体混合发酵工艺制成高生物活性的复合菌剂；利用本发明的复合菌剂制备发酵床，垫料不用提前发酵，垫料厚度可以降低至50cm。因此本发明解决了分解粪便效率低；制备发酵床垫料需求量大，厚度须为80-100cm；且垫料需要提前发酵、制备过程复杂且劳动量大的问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供了一种枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、康宁木霉、热带假丝酵母共5株益生菌及其代谢产物组成的高效发酵床复合菌剂，其特征在于，枯草芽孢杆菌CGMCC1.210产α-淀粉酶活力很强，枯草芽孢杆菌CGMCC1.769产蛋白酶活力很高，产蛋白酶1200U/mL，康宁木霉CGMCC3.4290产纤维素酶活力很高，植物乳杆菌CICC6073产乳酸、抗菌素高，热带假丝酵母CGMCC2.587是良好的菌体蛋白，菌体蛋白质含量高达55％。

[0008] 本发明的另一目的是提供了一种高效发酵床复合菌剂的制备方法，为利用5株菌种之间互生互利，互不拮抗的原理采用深层液体混合发酵工艺制成高活性复合菌剂。首先接种植物乳杆菌30-37℃液体深层发酵12-20h，再分别接种热带假丝酵母菌和康宁木霉25-30℃混合发酵12h-24h后，再接种枯草芽孢杆菌35-37℃液体深层混合发酵12-20h，使
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发酵液活菌数分别达到：1-2×10cfu/ml、5-8×10cfu/ml、3-5×10cfu/ml、3-5×10cfu/
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ml 2-5×10cfu/ml，终止发酵，分装密封即可得到高效发酵床复合菌剂。

[0009] 本发明的还一个目的是提供了一种高效发酵床复合菌剂的用途，即制备发酵床垫料的方法。

[0010] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0011] 1、优良菌种的选择

[0012] 猪粪(干物质含量)中有机物80.1％，易分解性有机碳27.3％，相脂肪15.7％，半纤维素3.5％，纤维素9.0％，半固体部分30.8％，木质素17.6％，含氮量3.61％。因此应选择能分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶且活力高的能够有效分解粪便中有机物的有益菌种；其次选择具有抑菌功能的益生菌，能够有效抑制粪便、垫料中的致病菌。

[0013] 因此本发明选择的优良菌种具体如下：

[0014] 枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC1.769：中国普通微生物菌种保藏管理中心。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。特别指出的是本发明的选择的枯草芽孢杆菌蛋白酶活性很高，产蛋白酶1200U/mL。

[0015] 枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC1.210：中国普通微生物菌种保藏管理中心。产α-淀粉酶活力很强。

[0016] 康宁木霉(Trichoderma koningii)CGMCC3.4290：中国普通微生物菌种保藏管理中心。菌丝有隔膜，蔓延生长，广铺于固体培养基上，菌外观为浅绿，黄绿或绿色，反面无色，分生孢子。梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上又可继续分枝，形成2级、3级分枝，分枝末端即为瓶状梗。分生孢子由小梗相继生出，靠黏液把它们聚成球形或近球形的孢子头，分生孢子卵形成椭圆形，壁光滑。单个孢子近无色，形成堆状为绿色。此菌有很强的纤维素酶及淀粉酶等，特别指出的是本发明选择的康宁木霉产纤维素酶活性很高。

[0017] 热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC2.587：中国普通微生物菌种保藏管理中心。热带假丝酵母是最常见的假丝酵母。细胞呈球形或卵球。在麦芽汁琼脂上菌落为白色到奶油色，无光泽或稍有光泽。软而平滑或部分有皱纹。培养时间长时，菌落变硬。用农副产品和工业废弃物也可培养热带假丝酵母，既扩大了饲料来源，又减少了环境污染。特别指出，本发明的热带假丝酵母含蛋白质55％，是优质饲料菌体蛋白。

[0018] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CICC6073：中国工业微生物菌种保藏中心。外观为杆状直线型，两端以圆弧形收尾。通常宽为0.9～1.2mm；长为3.0～8.0mm；以单个，两两成对或短链形式排列存在；兼性厌氧菌，产乳酸，产抗菌素，能够有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌。

[0019] 2、高效复合菌剂的制备

[0020] 2.1、斜面菌种活化：

[0021] 取安瓿管菌种，分别无菌操作接种于相应的试管斜面培养基中，植物乳杆菌30-37℃恒温培养48-72h；康宁木霉、热带假丝酵母菌25-30℃恒温培养48-72h；芽孢杆菌
35-37℃恒温培养24-36h；制成试管斜面菌种，4℃冰箱保藏备用。

[0022] 2.2、种子液的制备：

[0023] (1)植物乳杆菌种子液的制备：取冰箱保减斜面菌种，无菌操作接种于装有150-200ml的MRS培养基的500ml三角瓶中，转速100-150rpm，30-37℃恒温培养20-30h。

[0024] (2)热带假丝酵母、康宁木霉菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有100-200ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，转速100-150rpm，25-30℃恒温培养24-36h。

[0025] (3)枯草芽孢杆菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有30-50ml的LB培养基的500ml三角瓶中，转速200-240rpm，35-37℃恒温培养8-16h。

[0026] 本发明步骤2.1和2.2中所述的培养基配方分别如下：

[0027] 植物乳杆菌用培养基(g/L)：MRS培养基：蛋白陈：10.0g，牛肉粉：5.0g，酵母粉：4.0g，葡萄糖：20.0g，吐温80：1.0mL，磷酸氢二钾：2.0g，乙酸钠：5.0g，柠檬酸三铵：2.0g，硫酸镁：0.2g，硫酸锰：0.05g，蒸馏水：1000mL，如制成试管斜面培养基再加15-20.0g琼脂，
121℃灭菌20min。

[0028] 热带假丝酵母、康宁木霉用培养基(g/L)：5Brix麦芽汁培养基，如制成试管斜面培养基再加15-20.0g琼脂，121℃灭菌20min。

[0029] 枯草芽孢杆菌用培养基(g/L)：LB培养基：胰蛋白胨：10.0g，酵母提取物：5.0g，氯化钠：10.0g，蒸馏水1000ml，如制成试管斜面培养基再加15.0-20.0g琼脂，121℃灭菌20min。

[0030] 2.3、高效复合菌剂的制备

[0031] 将植物乳杆菌种子液按照3-10％的接种量，接种于装有30-35L发酵培养基的50L发酵罐中，控制初始pH值为6.5-7.0，搅拌转速100-150rpm，通气量0.15-0.3V/V·min，30-37℃培养12-20h；再将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照3-10％的接种量分别同时接种，搅拌转速100-150rpm，通气量0.15-0.3V/V·min，25-30℃培养12-24h；再按照3-10％的接种量分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速160-200rpm，通气量
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0.3-0.8V/V·min，35-37℃培养12-20h；活菌数分别达到1-2×10cfu/ml、5-8×10cfu/ml、
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3-5×10cfu/ml、3-5×10cfu/ml 2-5×10cfu/ml，终止发酵，分装密封，即得高效复合菌剂。

[0032] 本发明的步骤2.3中所述的发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖40，酵母膏5，大豆蛋白胨18，氯化钠5，121℃灭菌20min。

[0033] 3、高效复合菌剂的使用方法——发酵床垫料的制备

[0034] 利用本发明的高效复合菌剂制备发酵床垫料，不用提前进行垫料发酵，随铺即用，这是由于：复合菌剂中含有抗菌物质，能够有效抑制垫料中病原菌的生长繁殖，另外在发酵床启动后垫料中部的高温发酵也会杀死多数的病原菌。本发明的复合菌剂是按下述步骤制备发酵床垫料的：

[0035] 1)铺10cm左右木屑，洒水达到30-40％湿度；

[0036] 2)复合菌剂的使用量为1L/m3，将复合菌剂适当稀释，均匀泼洒在木屑表面；

[0037] 3)铺10cm左右稻壳，洒水至30-40％湿度；

[0038] 重复以上步骤2-4次，最后一层表面铺木屑10cm左右，将发酵池填满，喷水到湿度30-40％，垫料的铺设即完成。

[0039] 特别指出，本发明步骤3中所述的垫料厚度可以是50-100cm；垫料原料还可以是锯末、稻壳、秸秆、花生壳等常见的农作物下脚料的组合。

[0040] 本发明的优点和有益效果是：

[0041] 本发明的复合菌剂，不仅含有高效分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶的有益菌种，保证了粪便的高效分解，可以降低垫料厚度至50cm，提高了相对饲养密度；还含有产生抗菌物质的乳酸菌，又保证了垫料可以不用提前发酵，从而节省了许多人力、垫料、水、时间成本，方便用户使用；含有活性高的酵母菌，提供了大量的菌体蛋白，节省了饲料；因此本发明的复合菌剂，可以显著减轻环境污染，提高猪肉品质，提高饲料利用率，节工省本，提高经济效益。

具体实施方式

[0042] 通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

[0043] 实施例1：斜面菌种活化

[0044] (1)植物乳杆菌斜面菌种活化：取安瓿管菌种，无菌操作接种于试管斜面培养基中，37℃恒温培养72h，制成试管斜面菌种，4℃冰箱保藏备用。斜面培养基(g/L)：MRS培养基：蛋白陈：10.0g，牛肉粉：5.0g，酵母粉：4.0g，葡萄糖：20.0g，吐温80：1.0mL，磷酸氢二钾：2.0g，乙酸钠：5.0g，柠檬酸三铵：2.0g，硫酸镁：0.2g，硫酸锰：0.05g，蒸馏水：1000mL，琼脂15g，121℃灭菌20min。

[0045] (2)热带假丝酵母菌、康宁木霉斜面菌种活化：取安瓿管菌种，分别无菌操作接种于试管斜面培养基中，30℃恒温培养48h，制成试管斜面菌种，4℃冰箱保藏备用。斜面培养基(g/L)：5Brix麦芽汁培养基，20g琼脂，121℃灭菌20min。

[0046] (3)枯草芽孢杆菌斜面菌种活化：取安瓿管菌种，无菌操作接种于试管斜面培养基中，37℃恒温培养24h，制成试管斜面菌种，4℃冰箱保藏备用。斜面培养基(g/L)：LB培养基：胰蛋白胨：10.0g，酵母提取物：5.0g，氯化钠：10.0g，蒸馏水1000ml，琼脂20.0g，121℃灭菌20min。

[0047] 实施例2：种子液的制备

[0048] (1)植物乳杆菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，无菌操作接种于装有200ml的MRS培养基的500ml三角瓶中，37℃恒温150rpm培养20h。种子培养基：本发明实施例1(1)中的斜面培养基不加琼脂。

[0049] (2)热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有100ml的麦芽汁培养基的500ml三角瓶中，30℃恒温100rpm培养24h。种子培养基：本发明实施例1(2)中的斜面培养基不加琼脂。

[0050] (3)枯草芽孢杆菌种子液的制备：取冰箱保藏斜面菌种，分别无菌操作接种于装有30ml的LB培养基的500ml三角瓶中，35℃恒温200rpm培养16h。种子培养基：本发明实施例1(3)中的斜面培养基不加琼脂。

[0051] 实施例3：高效复合菌剂的制备

[0052] 将植物乳杆菌按照10％的接种量分别同时接种于装有30L发酵培养基的50L发酵罐中，控制初始pH值为6.5；搅拌转速100rpm，通气量0.15V/V·min，30℃培养20h；再分别同时将热带假丝酵母菌、康宁木霉种子液按照5％的接种量接种，搅拌转速100rpm，通气量0.3V/V·min，25℃培养12h；再分别同时接种枯草芽孢杆菌，搅拌转速200rpm，通气量9 8 8
0.8V/V·min，37℃培养20h；活菌数分别达到1×10cfu/ml、8×10cfu/ml、5×10cfu/ml、
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1×10cfu/ml、3×10cfu/ml，终止发酵，分装、密封，即得复合菌剂。

[0053] 实施例4：复合菌剂的用途——发酵床垫料的制备

[0054] (1)铺10cm木屑，洒水达到40％湿度；

[0055] (2)复合菌剂的使用量为1L/m3，取5L复合菌剂并稀释至20L，均匀泼洒在木屑表面；

[0056] (3)铺10cm稻壳，洒水至40％湿度；

[0057] 重复以上步骤2次，最后一层表面铺木屑10cm，将发酵池填满至50cm，喷水到湿度40％，垫料的铺设即完成。

[0058] 发酵垫料含水量的控制：40％较合适，鉴别方法：手抓可成团，松手即散，指缝无水渗出。

[0059] 实施例5、利用本发明的复合菌剂制备发酵床的养猪功效

[0060] 选择同批的杜×长×大三元健康活泼体重约10kg的断奶仔猪96头，根据体重及性别比例相近的原则，试验分四组，对照组、试验组I、试验组II、试验组III，每组有三个重复，每个重复8头断奶仔猪。其中对照组，水泥地板饲喂，试验组I为用本发明的复合菌剂制成50cm的发酵床垫料饲喂，试验组II为用本发明的复合菌剂制成100cm的发酵床垫料饲喂，试验组III为用发明的复合菌剂按照常规方法进行垫料提前发酵制作发酵床，饲喂70天。

[0061] 实验结果如下：

[0062] 发酵床与水泥地面圈舍环境及体表观察结果

[0063]

[0064] 发酵床与水泥地面养猪的生产性能结果