高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用

摘要

本发明提供了一种高产鼠李糖脂的降解原油菌株及其应用。具体地说，本发明涉及保藏编号为CGMCC No.4002的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以及含有该菌的铜绿假单胞菌制剂。本发明还涉及所述的铜绿假单胞菌或其制剂在发酵培养生产生物表面活性物质中的应用，在处理废水中重金属中的应用，在降解原油中的应用以及在驱油采油中的应用。本发明的铜绿假单胞菌株能以废弃油为碳源高产糖脂类生物表面活性剂；该生物表面活性剂能够显著降低水溶液的表面张力、具有很强的乳化能力、有效的提高烷烃或原油在水中的溶解度、明显促进菌株对原油的降解。该菌株及其发酵液用于处理废水中的铅，具有较高的铅去除率。

权利要求

1.保藏编号为CGMCC No.4002的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

2.一种铜绿假单胞菌制剂，该铜绿假单胞菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.4002的铜绿假单胞菌，该铜绿假单胞菌制剂为固态或液态菌制剂。

3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂在发酵培养生产生物表面活性物质中的应用。

4.权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂在以废弃油为碳源发酵培养生产生物表面活性物质中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述废弃油选自工业生产中的柴油、汽油、机油和化工油脂剩下的脚油渣，以及生活中植物油、动物油的废弃油渣和泔脂水中的一种或多种，废弃油在发酵培养基中的含量为60～120g/L。

6.一种生产生物表面活性剂的方法，该方法包括：

利用权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂进行发酵培养，离心除去菌体，将上清液用硫酸调pH至2.0以下，并加入硫酸铵静置，再用氯仿和甲醇的萃取液萃取上清液，静置分层后，取下层，去除其中溶剂，制备得到生物表面活性剂，该生物表面活性剂含有鼠李糖脂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述发酵培养条件为：发酵培养基为：废弃油60～120g/L、NaNO38～10g/L、酵母膏1～1.5g/L；K2HPO40.1～

0.5％、CaCl20～0.1％、MgSO40～0.1％、FeSO40～0.1％、Na2MO40～0.1％，培养基初始pH

7.0～7.5，34～37℃100～300rpm培养72～180小时。

8.权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂在降解原油和/或驱油、采油中的应用。

9.权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂在去除废水中重金属中的应用。

10.权利要求9所述的应用，其中所述重金属为铅。

11.一种利用权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂处理含铅废水以去除废水中铅的方法，该方法包括：向待处理含铅废水中加入权利要求

1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述的铜绿假单胞菌制剂，调节废水pH 7.0～7.5，

30～38℃培养72～180小时。

说明书

高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株及其应用，该菌株能以废油为碳源高产鼠李糖脂类生物表面活性剂，且对于处理废水中的铅具有较高的铅去除率，同时具有较高的降解原油的能力。

背景技术

[0002] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)被广泛用于原油等有机物的生物降解，其分泌的鼠李糖脂(RL)是目前研究较多的一种生物表面活性剂，具有乳化、增溶、降低界面张力等功能，低毒、易生物降解，在石油化工、石油开采、生物医药、食品及环境保护等领域有很大应用前景。铜绿假单胞菌被普遍认为是微生物采油的有效功能菌。另有文献报道鼠李糖脂对于去除沉积物中的重金属例如Cd和Pb具有一定的作用。

[0003] 不同来源的铜绿假单胞菌其分泌的表面活性剂的组成、性能、产量差距均较大，寻找合适的铜绿假单胞菌具有重要价值。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一株新的铜绿假单胞菌菌株，该菌株具有高产生物表面活性剂的能力，用于降解原油、改变原油流变性，且对于去除废水中的重金属特别是铅具有独特的效果。

[0005] 本发明的另一目的在于提供所述的铜绿假单胞菌菌株在生产生物表面活性剂中的应用，以及所生产得到的生物表面活性剂。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的铜绿假单胞菌菌株及其发酵液在处理废水中重金属特别是铅中的应用。

[0007] 本发明的另一目的在于提供利用所述的铜绿假单胞菌菌株或其发酵液处理废水中重金属特别是铅的方法。

[0008] 本发明提供了一株能够高产包括鼠李糖脂在内的表面活性剂的铜绿假单胞菌菌株，本发明命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6。该菌株已于2010年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.4002。该菌株能够以各种碳源特别是原油、植物油、甚至是废弃油为碳源生长，高产糖脂类生物表面活性剂；该生物表面活性剂能够明显降低水溶液的表面张力、具有很强的乳化能力、有效的提高烷烃或原油在水中的溶解度、明显促进菌株对原油的降解，该菌株及其产生的生物表面活性剂可用于微生物采油。并且，该铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株及其发酵液在处理废水重金属特别是铅的应用中具有显著的效果。本发明中的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株亦称为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa CGMCC No.4002。

[0009] 本发明的Pseudomonas aeruginosa SLQT-6是从华北蒙古林的油水样中分离得到的。参考《常见系统系统鉴定手册》，根据SLQT-6的生理生化特征，以及16S rDNA基因序列在Genbank数据库中BLAST比对的结果，可鉴定SLQT-6为pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞菌。

[0010] 本发明还提供了一种铜绿假单胞菌制剂，该铜绿假单胞菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.4002的铜绿假单胞菌，该铜绿假单胞菌制剂为固态或液态菌制剂。

[0011] 本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂在以各种碳源特别是以废弃油为碳源发酵培养生产生物表面活性物质中的应用。

[0012] 本发明还提供了一种生物表面活性剂，其是利用所述的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂发酵培养而得到的。

[0013] 本发明还提供了一种生产生物表面活性剂的方法，该方法包括：利用所述的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂以各种碳源特别是以废弃油为碳源进行发酵培养，离心除去菌体，将上清液用硫酸调pH至2.0以下，并加入硫酸铵静置，再用氯仿和甲醇的萃取液萃取上清液，静置分层后，取下层，去除其中溶剂，制备得到生物表面活性剂。具体的，该方法中，所述发酵培养条件优选为：发酵培养基为：碳源优选为废弃油60～120g/L、NaNO38～10g/L、酵母膏1～1.5g/L；K2HPO4 0.1～0.5％、CaCl2 0～0.1％、MgSO4 0～0.1％、FeSO4 0～0.1％、Na2MO4 0～0.1％，培养基初始pH 7.0～7.5，34～37℃ 100～300rpm培养72～180小时。本发明还提供了按照该方法制备得到的生物表面活性剂。本发明的SLQT-6菌株产生的生物表面活性剂，经酸水解后的样品稀释液进行TLC实验，用硫酸-蒽酮显色后呈蓝绿色，说明表面活性剂样品中含有糖类成分；用茚三酮显色呈紫黄色，说明表面活性剂样品中含有蛋白质组分；表面活性剂样品的丁酮抽提物用钼酸铵-高氯酸显色呈蓝-黑色斑点，说明表面活性剂样品中含有脂类物质。SLQT-6代谢产生的表面活性剂主要以糖脂类为主。通过红外光谱分析表面活性剂中的糖脂为鼠李糖脂。即，本发明的SLQT-6菌株产生的生物表面活性剂是一种主要包括糖组分、脂组分以及蛋白组分的混合发酵产物，且其中含有鼠李糖脂。

[0014] 本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂在去除废水中重金属特别是铅中的应用。即，本发明还提供了一种利用所述的铜绿假单胞菌菌株或其发酵液或所述的铜绿假单胞菌制剂处理废水中重金属特别是铅的方法。根据本发明的优选实施方案，利用本发明的铜绿假单胞菌处理废水中铅的方法包括：向待处理含铅废水中加入本发明的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂(可以种子液的形式加入)，调节废水pH中性(7.0～7.5)，30～38℃培养(振荡培养)72～180小时，即可有效降低废水中的铅浓度。具体实施时，可将本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在LB培养基中30～38℃培养8～24小时，制得种子液，然后按照0.5％～15％的接种量投入到含铅废水中(可事先调整所述废水中铅含量10～200mg/L。另外，废水中可加入适当的营养剂，以供菌体代谢活动)，振荡培养，培养后去除菌体的废水中的铅含量即大幅降低。

[0015] 本发明还提供了所述的铜绿假单胞菌或所述的铜绿假单胞菌制剂或者所述的生物表面活性剂在降解原油和/或驱油、采油中的应用。

[0016] 本发明的SLQT-6菌在具有很好的降解不同粘度原油的能力。用SLQT-6菌株生长细胞进行对不同粘度原油降解实验的结果表明：SLQT-6可有效降解并乳化稠油和稀油，未接入菌体的原油培养基恒温培养后的水相仍然是清澈的，油相呈大片油块漂浮在水溶液上层或黏附在瓶壁，两相完全隔离，油水界面清晰。接入菌体的原油培养基培养7d后，油层分散在水相中呈细末状，瓶壁上没有黏附原油，水相呈棕黑色，油水界面不清，静止后不分层。SLQT-6对蒙古林、新疆六中区稠油和京9-11、中岔口安415稀油的降解率分别为65.51％、
56.25％、45.45％、61.98％，对稠油的降解率高于稀油。稠油和稀油的主要区别在于稠油的胶质沥青质含量大，可见SLQT-6对高碳数组分的降解能力较好。

[0017] 本发明提供的SLQT-6菌株还能够以原油为唯一碳源的基础培养基中发酵培养生产生物表面活性剂。优化的培养基组成为(g/L)：原油8～10，NaNO3 1.0，K2HPO4 1.0，NaH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2 0.01，ZnCl2 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，pH 7.2～7.5。所产生的生物表面活性剂可以使去细胞去残余油的培养液的表面张力在培养48小时后降至29.58mN/m，培养90小时后表面活性剂浓度达到最大值，将其稀释1000倍后，仍具有很好的表面活性。表面活性剂的96小时乳化系数EI96仍可以达到90％，且乳化非常稳定。

[0018] 本发明的Pseudomonas aeruginosa SLQT-6能够有效地改善原油的性质，气相色谱分析和柱层析分析表明：原油降解前后，原油的饱和烃分明显增加，芳香、非烃和沥青质的含量明显减少。说明说明菌作用后原油轻质组分含量增加，重质组分含量降低，原油流变性变好。

[0019] 本发明的Pseudomonas aeruginosa SLQT-6作用原油前后原油流变性发生变化，测量作用前后粘度变化，结果表明作用后原油流变性明显变好，粘度降低。

[0020] 本发明的SLQT-6菌株以及发酵液进行物理模拟驱油实验，结果表明：注入SLQT-6菌液后岩心的驱油效率为9.06％。可见本发明的表面活性剂可有效提高原油采收率，在微生物采油、驱油过程中有很强大的应用潜力。

[0021] 综上所述，本发明提供了铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6，其能够以废弃油为碳源有效生产糖脂类表面活性剂，薄层色谱及红外光谱分析得该糖脂为鼠李糖脂，产量高达60.86g/L，显著提高了鼠李糖脂产量，具有预料不到的技术效果；该菌对不同的原油有很好的降解乳化能力，通过气相色谱、柱层析、原油降解率的测定表明SLQT-6能改善原油性质，使其重组分减少，轻组分增加，原油流动性变好；该菌生成的表面活性剂，能够有效地降低表面张力，对柴油具有很好的乳化效果，增加了烃和原油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃和原油的降解；物理实验表明SLQT-6及其表面活性剂可以应用于采油工程领域尤其是微生物提高石油采收率技术中具有巨大潜力。且本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在处理含铅废水时具有较高的铅去除率，带来了显著的技术效果。

附图说明

[0022] 图1为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以不同碳源发酵生产表面活性剂中的鼠李糖脂含量对比分析图表。

[0023] 图2为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以不同菌体接种量对废水中铅的去除率的影响。

[0024] 图3为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6处理不同浓度铅含量的废水时的去除率效果。

[0025] 图4A～图4D分别为本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在降解不同原油前后分离获得的饱和烃气相色谱分析结果。

[0026] 图5为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6产生的生物表面活性剂表面张力图。

[0027] 图6为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6产生的生物表面活性剂红外光谱图。

[0028] 图7为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6产生的生物表面活性剂CMC图。

[0029] 用于专利程序的微生物保存：

[0030] 保藏日期：2010年07月13日；

[0031] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

[0032] 保藏编号：CGMCC No.4002；

[0033] 分类命名：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

具体实施方式

[0034] 下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

[0035] 实施例1 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6的分离

[0036] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6的筛选与分离主要包括取样和富集培养、筛选和纯化以及鉴定，具体方法如下：

[0037] (1)取样和富集培养

[0038] 取适量华北油田蒙古林油藏的油水样(于2009年11月3日采集于华北蒙古林的腾格尔组腾一段下部第3小层的2、3细层的地层水10ml(去除肉眼可见机械杂质)，转接到90ml富集培养基中培养。富集培养基用的是无机盐培养基(g/L)：NaNO3 3.5、Na2HPO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 1.5、FeCl2 0.5、酵母粉0.3、液体石蜡10，绿浓素10，pH7.2～7.5，
121℃灭菌，37℃ 200rpm摇床培养7～14天。

[0039] (2)铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6筛选和纯化

[0040] 将步骤(1)中的富集培养液梯度稀释，分别取稀释倍数为104、105的菌液均匀涂布在溶血平板培养基(牛肉蛋白胨0.2％、酵母膏0.01％、氯化钠0.1％、琼脂1.8％、羊血5％)上。37℃培养1～2天，观察菌落形态，挑选培养后的菌落周围形成明显的溶血透明圈的菌种，尤其选择具有以下特征的菌落：灰褐色，偏平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态，菌落周围有水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色，菌落有金属光泽或者有生姜气味。可将所挑选的单菌落显微镜下染色观察，如果不纯，再一次地利用上述的培养基分离，直到分离得到纯的菌落(得到的纯菌落可转接到平板培养基上，以液体石蜡为碳源培养保持其降解烃特性)。

[0041] 接种环挑取通过上述方法筛选得到的单菌落接种于发酵培养基(豆油60、NaNO36、酵母膏1.5；K2HPO40.3％、CaCl20.010％、MgSO40.024％、FeSO40.01％、Na2MO40.01％、pH7.0～7.5)中，250ml三角瓶，装液量100ml，34℃ 200r/min摇床培养。80h后取出发酵液，60℃水浴加热10min，10000*g离心20min，取上清液分别用排油方法、圈表面张力SF和乳化系数EI24测试表面活性，选择排油圈直径大于10cm、表面张力低于30mN/m，且EI24为90％以上的的菌种作为高产菌保存。将去细胞发酵液上清液毛细管点样于薄层层析TLC分析硅胶板上，展开剂为氯仿∶甲烷∶乙酸(V/VV)＝65∶15∶2于层析缸中，将点样的硅胶板放入层析缸，待展开剂距离硅胶板顶部1cm时取出，待展开剂挥发后用玻璃喷雾器向硅胶板均匀喷洒显色剂(显色剂：2g蒽酮溶解到80％H2SO4中，以80％H2SO4定容到
1000ml)110℃下加热5min显色。选择硅胶板上显色后会出现棕黄色斑点且颜色浓重的菌种零下80℃甘油保存。

[0042] (3)铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6的鉴定

[0043] 本实施例中，从所筛选的菌落中挑选出一株发酵液具有较高表面活性的菌株，命名为SLQT-6。

[0044] SLQT-6的菌落特征：在普通铜绿假单胞菌培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径＜2mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。该菌产生水溶性色素，使培养基被染成蓝绿色或黄绿色。在血琼脂平板上菌落较大，有金属光泽和生姜气味，菌落周围形成透明溶血环。在肉汤中形成菌膜，肉汤澄清或微混浊，菌液上层呈绿色。显微镜下观察形态为直或稍弯、两端钝圆的杆菌，大小0.5～0.8μm×1.5～2.0μm。有1根单端鞭毛，运动活泼。该菌生理生化特征如下表1所示。

[0045] 表1 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6生理生化特征

[0046]试验项目 结果 试验项目 结果
葡糖糖 + 革兰氏染色 -
蔗糖 + 淀粉水解 -
木糖 + 明胶液化 +
利用葡萄糖产气 + 接触酶 +
利用柠檬酸盐 + 氧化酶 +
硝酸盐还原 + PHB -
自养H2 + 厌氧生长 -
脂酶 +- 生长温度 5-45

[0047] 注：”+”表示生长或反应阳性；”-”表示不生长或反应阴性

[0048] 菌株SLQT-6的16S rDNA基因序列特征：SLQT-6接种于LB培养基(牛肉蛋白胨0.5％、酵母粉1％、氯化钠0.2％，pH7.0～7.2)，37℃摇床(200rpm)培养18小时，10000rpm离心收集细胞，重新悬浮，用大连宝生物公司生产的DNA快速提取试剂盒提取(操作按照说明书进行)总DNA，进行PCR扩增，得到菌株SLQT-6的16SrDNA片段，DNA测序(大连宝生物公司测序)长度为1613bp，具体序列参见SEQ ID NO.1。在Genbank数据库中BLAST比对，将ClusterX软件与MEGA软件结合，用neighbor-joining法构建以16S rDNA序列为基础的系统发育树，菌株与pseudomonas aeruginosa菌株的最高同源性为99.0％。

[0049] 参考《常见系统系统鉴定手册》，根据SLQT-6的生理生化特征，以及16S rDNA基因序列在Genbank数据库中BLAST比对的结果，鉴定SLQT-6为pseudomonas aeruginosa铜绿假单胞菌，本发明中称其为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6，该菌株已于2010年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.4002。

[0050] Pseudomonas aeruginosa SLQT-6可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以各种碳源例如各种烷烃油或原油、植物油甚至废气油为碳源生长。菌株在5～40℃之间的适宜温度下好氧生长。

[0051] 实施例2 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以废弃油为碳源生产表面活性剂

[0052] 本发明的铜绿假单胞菌SLQT-6，其具有高产包括鼠李糖脂在内的生物表面活性剂的性质，特别是在以废弃油为碳源进行发酵生产生物表面活性剂方面，产生了预料不到的技术效果。

[0053] 废弃油又名废油，主要可分为生产和生活用废弃油。生产性废弃油主要指工业生产中常见的柴油、汽油、机油和化工油脂等剩下的脚油渣，包括生产机械洗涤油、传动润滑油等，均属于生产性废油；而生活废弃油主要指常见的植物油、动物油两大剩余和排放的废弃油渣和泔脂水，包括煎炸废油、餐饮废油和地沟油。

[0054] 本实施例中，分别以地沟油、煎炸废油、餐饮废油、葵籽油废料、石油、0#柴油、汽油作为碳源，分别进行发酵生产鼠李糖脂。具体方法如下：

[0055] 将本发明的菌株SLQT-6接种于LB培养基，100ml三角瓶，装液量30ml，34℃200r/min培养；10h后菌液接种于发酵一级培养基(酵母膏0.3％、硝酸钠0.6％、氯化钠0.5％，pH调到7.2-7.5)中，250ml三角瓶，装液量100ml，34℃200r/min摇床培养；10h后转入发酵二级培养基(酵母膏0.5％、硝酸钠1.0％、氯化钠0.5％、氯化钙0.01％、硫酸亚铁0.004％、钼酸钠0.05％。pH调到7.2-7.5)中，2L三角瓶，装液量500ml，34℃200r/min摇床培养；10h后转入发酵三级培养基(碳源80g/L、NaNO3 10g/L、酵母膏1.5g/L；K2HPO40.3％、CaCl20.010％、MgSO40.024％、FeSO40.01％、Na2MO40.01％、pH7.0～7.5)中，10L智能发酵罐，装液量5L，前10h为34℃300r/min，后期为37℃200r/min培养。90h后，取出发酵液
60℃水浴加热10min，10000*g离心20min去掉菌体，取发酵液上清液，采用比色法检测得鼠李糖脂含量。本实施例中，分别以地沟油、煎炸废油、餐饮废油、葵籽油废料、石油、0#柴油、汽油为碳源发酵合成鼠李糖脂含量检测数据分别为54.88、45.25、60.86、49.57、13.48、
10.05、9.68(g/L)(请结合参见图1)。

[0056] 本实施例的结果可表明，尽管本发明的铜绿假单胞菌SLQT-6在以汽油、柴油、石油为碳源发酵生产表面活性剂中鼠李糖脂含量不是很高，但在以废弃油为碳源进行发酵生产生物表面活性剂方面产生了预料不到的技术效果，据此，应用本发明的菌种，可以以废弃油为碳源发酵生产鼠李糖脂，可以降低成本和变废为宝。

[0057] 实施例3 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在处理废水中重金属方面的应用

[0058] 本实施例中，利用本发明的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6发酵去除废水中的重金属铅。

[0059] 1.实验材料

[0060] 含铅废水：根据实际工业废水参数，本实验用铅酸二氢钾模拟含铅废水浓度在10～200mg/L之间。加入适当的营养剂，以供菌体代谢活动。含铅废水参数(g/L)：Pb(NO3)2
0.01～0.2、NaNO3 3.0、Na2HPO4 1.0、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 1.5、FeCl2 0.5、酵母粉0.3、葡萄糖5，pH7.2～7.5。

[0061] 微生物：铜绿假单胞菌SLQT-6，在LB(牛肉蛋白胨0.5％、酵母粉1％、氯化钠0.2％，pH7.0～7.2)培养基中，100ml三角瓶，装液量30ml，34℃200r/min培养10h，发酵菌液作为液态铜绿假单胞菌制剂备用。

[0062] 2.铅的测定方法

[0063] 采用国家标准GB 5009.12-2010分析方法。

[0064] 3.生化处理方法

[0065] 取一定体积含铅废水置于250mL锥形瓶中，加入菌液制剂，调节废水pH，置于振荡器上振荡，充分接触。培养5天后取适量培养液中测定铅的含量，计算其去除率。去除率可用生化去除效率来表示。

[0066] 生化去除效率E可用下式计算：

[0067] E＝G/G0，其中：E-生化去除效率，％；G-生化去除量，mg；G0--初始质量，mg。

[0068] 4.不同接种量对含铅废水的处理效果实验

[0069] 在盛有100mL含铅浓度为100mg/L的废水的锥形瓶中，调节废水pH为中性，加入不同接种量的菌液，置于振荡器上振荡37℃ 200rpm摇床培养5天，计算其去除率。

[0070] 本实施例中，不同菌体接种量对处理浓度为100mg/L含铅废水效果的影响请参见图2。结果表明：在浓度为100mg/L的实验室模拟含铅废水实验中，菌体接种量为0.5％时，去除率约53％；菌体接种量为2％时，铅去除率为58.06％；随着接种量的增加，含铅废水的去除率有所增加。

[0071] 5.不同浓度废水的处理效果实验

[0072] 在盛有100mL铅浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L的含铅废水的锥形瓶中，调节废水pH为中性，依次加入10％菌液，置于振荡器上振荡37℃ 200rpm摇床培养5天，计算其去除率。

[0073] 本实施例中，废水中铅不同浓度对去除效果的影响请参见图3所示。结果表明，当含铅培养液的浓度由40mg/L增加到200mg/L时，去除率由62.64％逐渐缓慢减少到60.09％，当含铅废水的浓度由30mg/L降低到10mg/L时，去除率由62.64％急剧增大到
82.16％。可见，SLQT-6对含铅培养液的处理有良好效果。在本实验中微生物对铅的去除率存在一个临界生化去除量(critical absorption)，做曲线的两条切线交于一点如图所示，此点对应的浓度为35.2mg/L，去除率为62.5％，临界生化去除量为35.2mg/L×62.5％＝22mg/L。

[0074] 实施例4 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6及发酵液在降解原油中的应用

[0075] 为了研究菌株SLQT-6降解原油的性质，本实施例利用该菌株对新疆、中岔口、大庆江桥、蒙古林等油田的不同粘度的原油进行了微生物降解实验，分析了细菌降解对原油饱和烃、芳烃以及胶质、沥青质各组分在原油中相对含量和内部组成的影响。

[0076] 表面活性剂分析

[0077] 从4种不同原油(新疆六中区稠油(20.6℃黏度80mPa·s)、华北中岔口(58℃黏度18.5mPa·s)、大庆江桥(50℃黏度307.2mPa·s)、蒙古林稠油(37℃黏度116mPa·s))降解液(原油10，NaNO3 1.0，K2HPO4 1.0，NaH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，FeSO4·7H2O
0.01，CaCl2 0.01，ZnCl2 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，pH 7.2～7.5，37℃ 200rpm培养96小时)中得到的表面活性剂分别为BS-1、BS-2、BS-3、BS-4。

[0078] 通过TLC和显色发应定性定量分析(参见表2)可知：BS-1、BS-2、BS-3、BS-4的组分以及每个组分的含量不一样。有研究报道，不同的营养基质，微生物就刻能有不同的底物代谢方式，从而形成不同的代谢产物。不同粘度的原油，其中的饱和烃、芳香烃、胶质沥青质、非烃的组成和含量是不一样的，使得菌株SLQT-6对不同的原油具有不同的代谢方式，从而使得BS-1、BS-2、BS-3、BS-4的组分特别是鼠李糖脂的含量差异很大。从表2可知4种不同原油中以蒙古林原油为碳源所合成的鼠李糖脂含量较高。

[0079] 表2 不同原油下表面活性剂分析

[0080]

[0081] 原油族组成变化

[0082] 分别对菌株SLQT-6处理前后的新疆六中区、蒙古林、大庆江桥、辽河油田等地区的原油进行族组成分析。由于原油中的胶质沥青质90％以上由非烃类组分，所以在分析数据中，将原油中非烃类、胶质沥青质合并成非烃类一起考虑。微生物处理后，原油的饱和烃、芳烃、沥青质和胶质的含量都有不同的变化(表3)，这是由于细菌选择性消耗原油不同组分的结果。菌种SLQT-6处理不同油井的原油，原油族组成变化趋势不一致。总体上，微生物降解后使得原油非烃类、胶质、沥青质含量相对降低地最明显，饱和烃含量却相对增加，原油物性得到明显改善。芳烃含量变化波动较大。因此，微生物采油必须根据不同油藏及其原油特性筛选有效的MEOR菌。

[0083] 表3 微生物作用前后原油组分分析

[0084]

[0085] 原油饱和烃、芳烃气相色谱分析

[0086] 为了进一步了解微生物降解原油的情况，将分离获得的饱和烃、芳烃进行气相色谱分析。原油饱和烃气相色谱分析结果(见图4A～图4D)表明：4种不同原油经细菌SLQT-6作用后，原油的饱和烃分布发生了明显变化(表4)，短链正构烷烃含量相对增加，而长链正构烷烃含量则相对减少。不同粘度原油的w(nC21-)/w(nC22+)值由作用前1.31、1.2、1.22、1.13上升到1.64、1.5、1.43、1.35，分别增加了25.19％、25％、17.21％、19.46％，说明SLQT-6优先降解高碳链烷烃，改善原油的流变性，从而有利于提高采收率。姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)是原油中的生物标志化合物，结构比较稳定，细菌作用一般不影响它的含量。
从气相色谱结论看，4种原油经SLQT-6降解后w(pr)/w(nC17)、w(pr)/w(nC18)、w(pr)/w(nC27)、w(pr)/w(nC28)值发生了不同程度的变化。w(pr)/w(nC17)、w(pr)/w(nC18)值减少，说明原油饱和烃中低碳链的正构烷烃在增加；w(pr)/w(nC27)、w(pr)/w(nC28)值在增加，说明说明原油饱和烃中高碳链的正构烷烃在减少，异构烷烃相对增多；由此可见SLQT-6作用后低碳链烷烃含量增加，高碳链烷烃含量减少；正构烷烃减少，异构烷烃增加，结果使得原油的物理性质发生改变，流动性增强。

[0087] 表4 原油饱和烃气相色谱

[0088]

[0089] 经微生物降解后，原油芳烃中菲系列的含量和组成都产生了较大的变化(表5)。SLQT-6选择性地降解了菲系列中的不同组分，引起MPI、DPI指数变化。原油中的菲系列一般认为是来自甾萜化合物的裂解。由于烷基在菲环上位置不同，稳定性也有差异，一般处在β位的甲基，如3-基和2-甲基菲较稳定，在α位的1-甲基、4-甲基菲以及处于中位的
9-甲基菲比较活跃，二甲基菲也有相似规律，从α-α型、α-β型至β-β型，稳定性依次增高。细菌SLQT-6作用后，原油的MPI和DPI指数值均有较大提高，说明菲系列中化学性质较为活跃的组分易被降解。

[0090] 表5 微生物作用前后芳香烃GC分析

[0091]

[0092] 原油物性变化

[0093] 经微生物处理后，原油物性变化较明显，实验采用Brook-VISCO粘度仪测定原油菌解前后的粘度(参见表6)。参照SY/T0541-94方法测定原油凝固点。结果表明：4种原油经SLQT-6细菌作用后，粘度和凝固点降低显著，原油中重质组分减少，很好地改善原油物性，增强了原油流动性。这与前面的结论均吻合。

[0094] 表6 微生物作用后原油物性f分析

[0095]

[0096] 结论：在以不同粘度原油为碳源，SLQT-6降解实验中，通过对降解前后代谢产物表面活性剂含量测定、原油族组分以及气相色谱分析，结果表明SLQT-6以降解长碳链烷烃、胶质沥青质为主要的代谢途径，使得原油的短链饱和烃、异构烷烃相对含量增加，改善原油物理性质，增强了原油的流动性，进一步有利于微生物提高原油采收率。同时，实验结果也表明：同一菌种降解原油、改变原油的程度和代谢产物的含量不一样，这是由于原油本身的物性不同，即不同的营养物基质引起不同的代谢方式。所以要针对不同油藏条件选择不同的微生物，针对性选择性地提高微生物采油效率。

[0097] 实施例5 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6以原油为碳源产生表面活性剂性能研究

[0098] 1.产生生物表面活性剂的条件

[0099] 通过培养基种类和成分及培养条件(温度、Ph、通气量、转速等)单因素分析和正交实验，获得该Pseudomonas aeruginosa SLQT-6菌株产生生物表面活性剂的室内最佳培养基为：原油8，NaNO3 1.0，K2HPO4 1.0，NaH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2 0.01，ZnCl2 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，pH 7.2～7.5。最佳培养条件下，初始pH值7.5，37℃200rpm培养96小时。

[0100] 2.菌体亲油性测定

[0101] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在最佳培养基和培养条件下，200rpm摇床培养7天，用BATH方法对菌细胞表面的疏水性进行测定：取定量菌株发酵液
10ml，8000rpm下离心得到菌体配制成5mL菌悬液(测定OD600定量)中加入200μL正十六烷，混匀2min，静置25min，测定600nm的OD值计算出下层水相中的菌浓从而计算亲油性系数CSL。

[0102] CSL(cell surface lipophilicity)＝[(a-b)/a]×100％

[0103] a：初始菌液细胞浓度的OD值

[0104] b：终止时菌液细胞浓度的OD值

[0105] 经测定得，菌株发酵过程中菌体表面亲油性先上升，70h后到达最高点CSL＝[(0.195-0.016)/0.195]×100％＝91.7％，随后又开始下降，这说明细胞在不同的生长阶段可能采取不同的模式摄取烃，这种疏水性的变化可能与其生长过程中细胞壁含有疏水性成分变化和代谢的表面活性剂附着在细胞壁上有关。

[0106] 3.发酵液表面表面张力分析

[0107] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在最佳培养基和培养条件下，200rpm摇床培养7天，所得到的生物表面活性剂，可以显著的降低水溶液的表面张力，采用POWEREACH JK99C型自动表面张力仪板法检测，表面张力从71.59±0.3mN/m降至
21.58±0.3mN/m。表面活性剂稀释不同10倍、100倍、1000倍的情况下，仍保持水溶液低表面张力30mN/m(参见图5)。这说明在SLQT-6菌株可以很好地代谢产生具有表面活性的生物表面活性剂，有效改善了界面活性，降低界面张力。

[0108] 4.排油圈测定

[0109] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在最佳培养基和培养条件下，200rpm摇床培养7天，所得到的生物表面活性剂配制成一定浓度的溶液，取一直径为150mm培养皿，加入20mL去离子水，加入液体石蜡形成油膜。在油膜中心加0.1ml表面活性剂水溶液，中心油膜被挤向四周形成排油圈，记录排油圈的直径。排油圈直径从0.1cm增加至
14.6cm，这说明SLQT-6产生的表面活性剂具有很好的表面活性。

[0110] 5.乳化系数E96的测定

[0111] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在含有NaNO3 3.5、Na2HPO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 1.5、FeCl2 0.5、酵母粉0.3、植物油10。pH7.2～7.5的培养基中，37℃，200rpm摇床培养7天后，在带刻度的试管中，加入6mL测试烃(煤油)和4mL乳化活性物质溶液，涡旋振荡器充分振荡2min，静置96h，以乳化指数(Emusification index，EI96)表示乳化剂的乳化活性。EI96为油水界面上层高度占总高度的百分数，结果可以看到SLQT-6发酵液的乳化系数高达99％，这说明在SLQT-6菌株发酵液中含有表面活性物质，对非水溶性有机物具有分散乳化的作用，大大提高了菌体与非水溶性有机物之间的接触面积。

[0112] 5 生物表面活性剂的提纯纯化及定性分析

[0113] (1)生物表面活性的初步鉴定

[0114] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在最佳培养基和培养条件下，200rpm摇床培养7天，将发酵液在转速为10000r/min、温度为4℃的条件下离心20min除去菌体。将上清液用质量分数10％的硫酸调pH至2.0以下，并加入质量浓度为320mg/L的硫酸铵，放入4℃的冰箱中静置12h。再用V(氯仿)∶V(甲醇)＝2∶1的萃取液等体积萃取上清液，静置分层后，取下层。将中层再萃取，静置使白色沉淀层压缩，再取下层。合并下层萃取液，置于旋转蒸发器中，在真空度为0.05～0.07MPa、温度为40℃的条件下蒸干溶剂得表面活性剂粗产品，得到的粗产品进行TLC薄层层析及显色反应。结果表明，SLQT-6菌株产生的生物表面活性剂，经酸水解后的样品稀释液，用硫酸-蒽酮显色后呈蓝绿色，说明表面活性剂样品中含有糖类成分；用茚三酮显色呈紫黄色，说明表面活性剂样品中含有蛋白质组分；表面活性剂样品的丁酮抽提物用钼酸铵-高氯酸显色呈蓝-黑色斑点，说明表面活性剂样品中含有脂类物质。采用苯酚-硫酸法，用鼠李糖作为标准品制备标准曲线，经过多次测定糖类含量(％，w/w)为78.26；采用韩菊等所述二氯甲烷/甲醇法，经过多次测定脂类含量(％，w/w)为8.49；采用结晶牛血清蛋白作为标准品制备标准曲线，经过多次测定蛋白质含量(％，w/w)为8.25。可见SLQT-6代谢产生的表面活性剂主要以糖脂类为主。

[0115] (2)生物表面活性剂的红外光谱分析

[0116] SLQT-6提纯后得到的物质红外光谱如图6所示，分析表明：2954cm-1、2925cm-1、2855cm-1和1464cm-1是亲油的碳氢链中C-H伸缩振动所致，表明分子中存在-CH2-；
1054cm-1和3370cm-1处的宽吸收峰为糖-OH伸缩振动所致；1736cm-1及1601cm-1是典型的与饱和脂肪链相连接的C＝O伸缩振动峰；1459cm-1和1378cm-1是由C-H或O-H变形振动引起；1283cm-1处宽峰是典型的酯吸收峰。进一步确定该生物表面活性剂为鼠李糖脂类表面活性剂。通过硫酸-蒽酮法测得糖脂含量高达48.4g/L，具有很好的工业化生产和用前景。

[0117] (3)cmc(临界胶束浓度)测定

[0118] 将所得纯化后的生物表面活性剂配置成不同浓度比例的溶液，含量为：0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8(g/L)，采用POWEREACH JK99C型自动表面张力仪板法检测其表面张力，绘制表面活性剂浓度与表面张力关系曲线，从而确定cmc。结果见图7。
随着该生物表面活性剂(粗品)浓度的增加，表面张力越来越小，当浓度增加到一定值时，表面张力不再有显著变化，图中拐点处即为表观CMC值，为12mg/L。此浓度比现有的关于微生物发酵产生的鼠李糖脂的CMC要低很多。

[0119] 实施例6 物模实验驱油效果评价

[0120] (1)实验仪器与材料

[0121] 2PB20C平流泵，FY-3型恒温箱，0.1MPa压力表，ZXZ-0.5型旋片式真空泵，岩芯管、各种大小的石英砂。

[0122] 石英砂、大庆油田某区块地层水及原油、菌株SLQT-6发酵液。

[0123] (2)实验方法

[0124] ①使用的三根岩芯直径为2.5cm，管长20cm，其中3#为对照岩芯。石英砂模拟地层状况按比例混合均匀，人工压制、填实；

[0125] ②将制备好的三根岩芯管通氮气测气相渗透率；

[0126] ③三根岩芯管用大庆油田某区块地层水中抽真空饱和24小时，比较饱和地层水前后的岩芯管质量差以确定孔隙体积PV，然后算出孔隙度；

[0127] ④测量在恒定流速下整个岩芯段的压差，通过达西定律来确定绝对渗透率；

[0128] ⑤用大庆油田某区块原油驱替岩芯管中的水直至出口产出液中含水小于2％，计量驱出水体积即原油饱和体积，计算出原始含油饱和度；

[0129] ⑥用经过灭菌的培养基，加入SLQT-6菌液，注入到1#和2#岩芯的同时注入空气，和3#空白岩芯一起然后放在37℃的恒温箱中静置7d；

[0130] ⑦用地层水后续水驱。

[0131] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa SLQT-6在含有(g/L)NaNO3 3.5、Na2HPO41.0、KH2PO4 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、NaCl 1.5、FeCl2 0.5、酵母粉0.3、大豆油10、pH7.2～
7.5的培养基中，37℃，200rpm摇床培养7天后，将其发酵液进行物理模拟驱油实验，结果见表7，表明注入SLQT-6菌液后岩心的驱油效率为9.06％。可见SLQT-6发酵液可有效提高原油采收率。

[0132] 表7 注SLQT-6菌液和聚合物的物理模拟参数

[0133]