α干扰素类似物的蛋白制备方法

摘要

本发明涉及一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，其包括步骤：(1)将编码α干扰素类似物蛋白的基因克隆到表达载体后所形成的重组质粒转化到宿主菌中构建成工程菌，再将所述工程菌进行发酵培养，所述编码α干扰素类似物蛋白的基因的核甘酸序列为SEQ ID NO1或者与SEQ ID NO 1的同源性不小于93％的核苷酸序列；(2)诱导所述发酵培养的工程菌表达目标蛋白；(3)纯化目标蛋白，所述纯化步骤为破碎经诱导的工程菌、离心破碎后菌体、稀释上清液和层析。由于本发明纯化过程中的层析在不同的条件下采用不同的多步层析顺序，有效地提高了蛋白的纯度和蛋白的活性总收率，降低了试验成本，减少了目标蛋白的损失。

权利要求

1.一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于包括步骤：

(1)将编码α干扰素类似物蛋白的基因克隆到表达载体后所形成的重组质粒转化到宿主菌中构建成工程菌，再将所述工程菌进行发酵培养，所述编码α干扰素类似物蛋白的基因的核甘酸序列为SEQ ID NO 1；

(2)诱导所述发酵培养后的工程菌表达目标蛋白；

(3)纯化所述目标蛋白，纯化步骤为破碎经诱导的工程菌、离心破碎后的菌体、稀释上清液、层析和收集含目标蛋白的样品，

所述层析前不对所述工程菌的蛋白酶进行处理，所述层析依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和高压液相色谱；或者所述层析前对所述工程菌的蛋白酶进行处理，采用灭活蛋白酶的方式处理宿主菌为蛋白酶不缺陷的工程菌，采用抑制蛋白酶活性的方式处理宿主菌为蛋白酶缺陷的工程菌，所述灭活蛋白酶的方式为酸化处理，经酸化处理后的所述层析依次为反相层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和凝胶层析或者依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和高压液相色谱，所述抑制蛋白酶活性方式为加入蛋白酶抑制剂，经蛋白酶抑制剂处理后的所述层析依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析、用于浓缩样品的阳离子交换层析和凝胶层析，所述蛋白酶抑制剂为EDTA、PMSF和TPCK的混合物或商品化的复合型蛋白酶抑制剂。

2.如权利要求1所述的α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于在所述层析前对所述工程菌的蛋白酶进行处理且采用灭活蛋白酶的方式处理宿主菌为蛋白酶不缺陷的工程菌的情况下，所述酸化处理的过程为在稀释上清液后加入6M盐酸酸化使PH值达到3-4，在4-8℃搅拌2小时酸化灭活蛋白酶，再用1M NaOH调节酸碱度至中性，最后用过滤膜过滤以除去变性沉淀蛋白。

3.如权利要求1所述的α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于在所述层析前不对所述工程菌的蛋白酶进行处理的情况下，所述疏水层析为HEA HyperCel疏水层析，所述用于除杂质的阳离子交换层析为POROS 50HS阳离子交换，所述螯合层析为Chelating Sepharose FF螯合层析，所述高压液相色谱为C5 Silica高效液相色谱。

4.如权利要求2所述的α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于所述疏水层析为HEA HyperCel疏水层析，所述用于除杂质的阳离子交换层析为POROS 50HS阳离子交换，所述螯合层析为Chelating Sepharose FF螯合层析，所述高压液相色谱为C5 Silica高效液相色谱，所述凝胶层析为Superdex75层析，所述反相层析为POROS 50R1层析。

5.如权利要求1所述的α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于在所述层析前对所述工程菌的蛋白酶进行处理且采用抑制蛋白酶活性的方式处理宿主菌为蛋白酶缺陷的工程菌的情况下，所述疏水层析为HEA HyperCel疏水层析，所述各阳离子交换层析均为POROS 50HS阳离子交换，所述螯合层析为Chelating Sepharose FF螯合层析，所述凝胶层析为Superdex75层析。

6.如权利要求1、2、3、4或5所述的α干扰素类似物的蛋白制备方法，其特征在于所述上清液采用1MNaCl进行稀释，稀释倍数为20-30，在步骤(1)中所述发酵培养用的培养基由发酵起始培养基和流加的补料构成，所述发酵起始培养基为M9培养基，所述补料包括作为碳源的葡萄糖和作为氮源的酵母粉，在步骤(2)中所述诱导为热诱导，所述热诱导的温度为39.0-43℃，所述热诱导的时间为3-4小时。

说明书

α干扰素类似物的蛋白制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及α干扰素类似物作为抗肿瘤蛋白的制备方法，主要涉及生物技术领域。

背景技术

[0002] 肿瘤的传统治疗分为三大类，即外科手术，放射疗法和化学疗法，前两种方法只对局限性肿瘤有效，对已经扩散的肿瘤则无法实施；化学疗法可以治疗肿瘤已经扩散的病人，但其毒副作用非常严重。近年来，在抗肿瘤药物的研究中，生物治疗药物异军突起，其作用针对性强、疗效好、不良反应较小，生物制剂研究已成为人们关注的焦点，并被认为是治疗肿瘤最有希望的方法，而其中干扰素是应用比较多的生物治疗药物。

[0003] 干扰素的生物学活性可以归纳为三个方面，即抗病毒、抗肿瘤和免疫调节。由于干扰素具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的生物活性，已经广泛应用于临床。1986年美国食品药品管理局(FDA)首次批准rhIFNα-2α、rhIFNα-2b临床用于治疗毛细胞白血病、慢性髓性白血病、乙型肝炎、丙型肝炎等疾病。1990、1993年IFN-β、IFN-y继IFN-α系列后相继上市，用于复发-缓解型多发性硬化症、慢性肉芽肿等的治疗。随着生物技术的发展，极大地促进了干扰素医药产品的生产和研发。继大肠杆菌表达的干扰素系列后，CHO细胞、酵母等不同表达系统制备的干扰素相继问世，并应用于临床。随着干扰素的广泛应用，人们发现干扰素作为抗肿瘤药物在临床上也存在着小剂量疗效不够好、加大剂量副作用大等缺点，而且抗瘤谱比较窄，如对血液系统肿瘤有效而实体瘤效果比较差。为了提高干扰素疗效、降低副反应，人们开始对干扰素进行各种改进，新型干扰素不断问世。

[0004] 我们研制的新型α干扰素类似物(又称重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白，英文名称：Novaferon)，是采用基因穿梭法，将12种人α干扰素基因通过酶切等方法产生切点不同、长短不一的核苷酸小片段，再将这些小片段混合，经多轮PCR扩增，不同分子的同源片段就会互相替换，随机组合，从而得到大量的同源基因分子间相互杂交的新分子；采用高通量筛选技术，对十多万个克隆株进行抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性鉴定，成功筛选出了高活性新型α干扰素类似蛋白(Novaferon)。该技术核心点是：同源片段随机组合，并进行大规模的功能筛选，以数量取胜。采用这一技术对人α干扰素进行改造，至今尚属首创。该高活性新型蛋白Novaferon，由498个核苷酸编码166个氨基酸组成，理论分子量为19314.28道尔顿。分子内含4个半胱氨酸，形成两对二硫键，无糖基化，等电点约为6.60.该蛋白与人rhIFN-α14在碱基和氨基酸序列上同源性分别为89％(445/498)和81％(135/166)。
初步体外实验表明，该重组蛋白Novaferon对Daudi细胞的生长抑制作用是rhIFNα-2b的
200-400倍；在WISH-VSV系统上，其抗病毒比活性是rhIFNα-2b的10倍以上。

[0005] 目前采用的纯化方法虽然可以达到较高的纯度，但是活性总收率较低，另外，培养基中的碳/氮比影响蛋白表达形成的形式，过高碳/氮比会使蛋白表达量下降，过低的碳/氮比会使表达的目标蛋白形成不溶形式，而不可溶的蛋白以包含体的形式存在，不具有生物活性，因此需要通过蛋白复性工艺，而干扰素类似物蛋白含有二对二硫键，势必使复性工艺复杂及成本增加。为了可以适用大规模的生产，提高蛋白的可溶性表达和增加活性蛋白的总收率成为急需解决的问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，可以提高有生物活性蛋白的收率，增加可溶性蛋白的表达量，省去蛋白复性的工艺。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0008] 一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，包括步骤：

[0009] (1)将编码α干扰素类似物蛋白的基因克隆到表达载体后所形成的重组质粒转化到宿主菌中构建成工程菌，再将所述工程菌进行发酵培养，所述编码α干扰素类似物蛋白的基因的核甘酸序列为SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO 1的同源性不小于93％的核苷酸序列；

[0010] (2)诱导所述发酵培养的工程菌表达目标蛋白；

[0011] (3)纯化目标蛋白，所述纯化步骤为破碎经诱导的工程菌、离心破碎后菌体、稀释上清液、层析和收集含目标蛋白的样品。

[0012] 步骤(1)中的同源性是指多个序列之间的相似程度，在本发明中也可以称为相同性。

[0013] 所述表达载体可以是真核表达载体或者原核表达载体等，优选原核表达载体pBVB，采用原核表达载体时的宿主菌株可以为大肠杆菌DH5α或者大肠杆菌BL21。

[0014] 在所述层析前可以不对所述工程菌的蛋白酶进行处理，所述层析可以依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和高压液相色谱，采用这样顺序的层析，前面的层析过程即为对后面的层析上样样品的预处理过程，前面层析后的样品可以直接进入后面的层析，这样节约了操作步骤，降低了成本和有效成分的损耗，其中HEA疏水层析是高盐上样，无盐低PH洗脱，且流速较高，适宜放在第一步捕捉粗目标蛋白；用于除杂质的阳离子交换层析需要低PH，最好无盐上样，与疏水层析衔接比较适合；金属螯合是小配体亲和层析，要求样品含盐，而用于除杂质的阳离子交换洗脱峰是含盐的，因此与用于除杂质的阳离子交换层析进行衔接；由于该样品中混和有完整的蛋白和降解的蛋白，因此最后采用分离能力强，测试灵敏度高的高压液相色谱层析，可以有效地提高分离效果，得到完整的目标蛋白。这种层析顺序可以可获得纯度大于95％，活性蛋白总收率约25％的目标蛋白。经所述螯合层析和所述高压液相色谱层析后的样品均要经质谱检测分析是否含有降解片段，以保证收集完整片段的目标蛋白，提高目标蛋白的纯度。在高压液相色谱层析后收集的样品又经用于除乙腈的POROS 50HS阳离子交换层析彻底去除乙腈，提高样品纯度。

[0015] 在所述层析前可以对所述工程菌的蛋白酶进行处理，对于采用蛋白酶不缺陷的宿主菌构建的工程菌，通常采用灭活蛋白酶的方式进行所述的蛋白酶处理，对于采用蛋白酶缺陷的宿主菌构建的工程菌，通常采用抑制蛋白酶活性的方式进行所述的蛋白酶处理。进行蛋白酶处理以防止目标蛋白降解，对于不同的宿主菌采用不同的蛋白酶处理方式，提高处理效果和纯化收率。

[0016] 可以采用酸化处理方式进行所述的蛋白酶灭活，经酸化处理后的所述层析可以依次为反相层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和凝胶层析或者可以依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和高压液相色谱。由于酸化处理成本较低，一般的宿主菌采用该方法灭活蛋白酶，使试验操作简单，成本降低。层析的顺序可以与未采用蛋白酶处理的层析顺序相同，且在高压液相色谱层析后收集的样品可以再经过用于除乙腈的POROS50HS阳离子交换层析法彻底去除乙腈，提高样品纯度，这样的层析顺序可获得纯度均大于95％，活性蛋白总收率约30％的目标蛋白。高压液相色谱层析成本较高，因此也可以采用依次为反相层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析和凝胶层析的顺序，反相层析可以替代疏水层析进行第一步捕捉粗蛋白，凝胶层析过程中不需要有机溶剂，可以替代高效液相色谱作为最后一步层析，从而降低试验成本。这样的层析顺序可获得纯度均大于95％，活性蛋白总收率约40％的目标蛋白。

[0017] 所述酸化处理的过程通常为在稀释上清液后加入6M盐酸酸化使PH值达到3-4，在4-8℃搅拌2小时酸化灭活蛋白酶，再用1M NaOH调节酸碱度至中性，最后用过滤膜过滤以除去变性沉淀蛋白。采用在稀释液体后加入6M盐酸，成本较低，可以使蛋白酶完全灭活，适合大规模生产。

[0018] 可以采用加入蛋白酶抑制剂处理方式进行所述的蛋白酶灭活，经蛋白酶抑制剂处理后的所述层析可以依次为疏水层析、用于除杂质的阳离子交换层析、螯合层析、用于浓缩样品的阳离子交换层析和凝胶层析。采用凝胶层析可以降低试验成本，而在螯合层析后又经过用于浓缩样品的阳离子交换层析是为了减小最后层析的上样体积，节约操作时间。对于蛋白酶缺陷宿主菌的处理则采用蛋白酶抑制剂进行针对性处理，提高蛋白酶处理的有效程度，这样的层析顺序可获得纯度大于95％的纯品，蛋白总收率约40％的目标蛋白。

[0019] 所述蛋白酶抑制剂可以为EDTA、PMSF和TPCK的混合物或商品化的复合型蛋白酶抑制剂，用于构建所述工程菌的所述蛋白酶缺陷宿主菌株可以为E.coli BL21[hsd S gal(λcI ts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV-5-T7)]。采用蛋白酶抑制剂的混合物或者复合型蛋白酶抑制剂，可以抑制工程菌中各种类型的蛋白酶的活性，抑制选择性高，提高了蛋白酶处理效果。

[0020] 所述疏水层析可以为HEA HyperCel疏水层析，所述螯合层析可以为Chelating Sepharose FF螯合层析，所述高压液相色谱可以为C5 Silica高效液相色谱，所述凝胶层析可以为Superdex75层析，所述反相层析可以为POROS 50R1层析。这些层析介质或者填充物是根据目标蛋白的自身结构和特性进行选择，可以有效地提高目标蛋白的提纯效果，增加目标蛋白的收率。

[0021] 所述上清液可以采用1MNaCl进行稀释，稀释倍数为20-30，如20、22、25、27或30等，优选的稀释倍数为25，合理的稀释倍数可以增加目标蛋白的收率。在步骤(1)中所述发酵培养用的培养基通常由发酵起始培养基和流加的补料构成。所述发酵起始培养基可以为M9培养基，且所述M9培养基为改进的M9培养基，所述补料可以包括作为碳源的葡萄糖和作为氮源的酵母粉，碳源和氮源分别可以为质量比为50％葡萄糖溶液和质量比为30％酵母粉溶液。采用了改进的M9培养基作为发酵起始培养基，并采用一定比列的葡萄糖和酵母提取物作为补料，通过控制合适比例的培养物碳/氮比，大大提高目标蛋白的可溶性表达。其中流加的补料是指采用不断加入方式加入的补料。

[0022] 在步骤(2)中所述诱导可以为热诱导，所述热诱导的温度可以为39.0-43℃，如：39℃、40℃、41℃、42℃或43℃，其中优选41℃，所述热诱导时间可以为3-4小时，如：3小时、3.5小时或4小时，优选3.5小时。合适的诱导温度和诱导时间可以增加目标蛋白的表达量。

[0023] 由于本发明纯化过程中的层析在不同的条件下采用不同的层析顺序，有效地提高了活性蛋白的总收率(可以达到30％-50％的收率)和蛋白的纯度(可以达到95％)，每一种层析的顺序中前面的层析过程即为对后面的层析上样样品的预处理过程，前面层析后的样品可以直接进入后面的层析，这样节约后面的层析前样品的预处理，降低了试验成本，减少了目标蛋白的损失，适于大规模生产。同时采用了经过反复筛选确定的改进的M9培养基作为发酵起始培养基，并采用一定比列的葡萄糖和酵母提取物作为补料，通过控制合适比例的培养物碳/氮比，大大提高目标蛋白的可溶性表达，使可溶性目标蛋白的含量约占菌体总蛋白的30％，减少了蛋白的复性工艺和成本。根据申请人的试验，本发明的实施方案中的所述编码α干扰素类似物蛋白的基因的核苷酸序列可以选自核苷酸序列为SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO 1的同源性不小于93％的核苷酸序列中的任意一种，且均可达到以上表达和纯化的效果。

附图说明

[0024] 图1是本发明中含有编码α干扰素类似物蛋白的基因的重组质粒的构建示意图；

[0025] 图2是本发明d干扰素类似物的蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；

[0026] 图3是本发明干扰素类似物抗肿瘤活性检测图谱。

具体实施方式

[0027] 干扰素类似物的蛋白又为干扰素样蛋白，是指与已知干扰素所表现的功能和/或结构特征相似的蛋白，在本文中是指α干扰素类似物的蛋白。

[0028] 破菌是指采用超声破碎等手段对菌株进行破碎，使在菌株的细胞内或细胞间的蛋白分离出来，利于后期的电泳或者纯化处理。

[0029] 目标蛋白是指试验方案所要得到的蛋白，在本专利中指的是α干扰素类似物的蛋白。

[0030] 本发明的实施方案中SEQ ID NO 1的序列以序列表的形式列在说明书后面。

[0031] 如图1、2和3所示，本发明提供了一种α干扰素类似物的蛋白制备方法，具体过程如下：

[0032] (1)表达工程菌的构建

[0033] 从来源于人外周血细胞提取总mRNA，克隆获得12种人α干扰素基因，而后根据每个HuIFN-α的核苷酸序列，分别设计了5’和3’端引物。以上述克隆的带有12种人α干扰素基因为模板，通过标准的PCR反应扩增出12种HuIFN-α的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，酶切后与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，最后进行序列分析，验证构建的带12种人α干扰素基因的质粒。

[0034] 具体过程如下：总mRNA来源于人外周血白细胞，IFN a的eDNA通过PCR方法扩增，扩增条件如下：2.5μl 10倍扩增缓冲液，0.75μl的10mM dNTPs，0.5μl 25mM硫酸镁，0.25μl多聚合酶，0.75μl mRNA，0.75μl的5′端引物(10μM，IFN a 05：5′-tggtgctcagct(a/g)caagtc-3′)，0.75μl的3’引物混合物(1.7μm/each；IFN a
03-1：5′-aatcatttccatgttg(a/g)accag-3′；

[0035] IFN a 03-2：5′-aatcatttcccggttgtaccag-3′；

[0036] IFN a 03-3：5′-aatcatttccatgttgaaacag-3′；

[0037] IFN a 03-4：5′-aatcatttcaagatgagcccag-3′；

[0038] IFN a 03-5：5′-aatgattttcatgttgaaccag-3′；

[0039] IFN a 03-6：5′-aatcattt(c/g)(c/g)atgttgaaccag-3′；

[0040] IFN a 03-7：5′-atgcccctgtccttttctttac；

[0041] IFN a 03-8：5′-gagtcgtttctgtgttggatcag-3′)。

[0042] 扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分离，凝胶纯化，并根据制造商的建议克隆到pCRII-TOPO或pCR-4-TOPO载体中。利用ABI自动测序仪进行插入片段的DNA序列分析。

[0043] 克隆的所有12种人α干扰素基因都分别于GeneBank中的序列比较，这些基因的GeneBank登录号分别为NM_024013(IFN-α1)，NM_000605(IFN-α2)，NM_010504(IFN-α4)，NM_010505(IFN-α5)，NM_008335(IFN-α6)，NM_008334(IFN-α7)，NM_008336(IFN-α8)，NM_002171(IFN-α10)，NM_002172(IFN-α14)，NM_002173(IFN-α16)，NM_021268(IFN-α17)，NM_002175(IFN-α21)一致。

[0044] 为构建穿梭(shuffling)质粒，根据每个HuIFN-a的核苷酸序列，分别设计了5’和3’端引物，其中5’端引物带BamHI切点，3′端引物带EcoRI切点。以上述克隆的带有干扰素a基因的为模板，通过标准的PCR反应扩增出12种HuIFN-a的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，BamHI和EcoRI酶切后，与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，最后进行序列分析，验证构建的带人干扰素a基因的质粒。

[0045] 分别以前述构建的12种带人干扰素a基因的质粒为模板，以BVF4：5′-agggcagcattcaaagcag-3′和BVR3：5′-tcagaccgcttctgcgttctg-3′为引物，进行PCR扩增，并将扩增的产物等量混合。随后按照文献(Stemmer WPC.DNAshuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for Mecular evolution.PNAS vol：91：10747-10751，1994)介绍的方法进行DNase I酶解和PCR组装。

[0046] 以PCR组装的产物为模板，用引物BVF：5′-gaaggctttggggtgtgtg-3′和BVR：5′-aatcttctctcatccgc-3′，进行二次扩增。二次扩增产物用BamHI和EcoR I与相同酶切的大肠杆菌表达载体pBVB连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α(supE44ΔlacU169 hdsR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)或BL21[hsd S gal(λcIt s857 ind1 Sam7 nin5 lac UV-5-T7)]，即为人α干扰素基因分子的杂交文库，并对此杂交文库进行筛选。

[0047] 在以上所有PCR扩增和PCR组装中，都使用普通的DNA聚合酶(NewEngland Biolab，USA)，而不是高保真DNA聚合酶。

[0048] 新鲜转化的大肠杆菌DH5a直接涂布接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并于37℃下过夜。挑单个菌落接种于96孔板，每孔内有100μl含50μg/ml的氨苄青霉素LB培养基(LBA)，37℃震荡培养过夜。次日，取10μl饱和生长的细菌培养物依次接种于96孔板(复制板)，每孔内有100μl LBA培养基；原细菌培养板，暂时贮存于4℃(储存板)。将复制板置于30℃，震荡培养至OD600＝0.4，然后快速升温至42℃。经过4小时的热诱导，细菌培养板直接移入-80℃冰箱，并冻融两次。然后，再将细菌裂解物液稀释至所需的浓度，吸样加至Daudi细胞培养体系内测试抗肿瘤细胞增殖活性，或加至Wish细胞的培养体系内测试抗病毒活性。

[0049] 每一轮大约筛选10,000菌落，初步筛选出100个抗肿瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，进入进一步验证性测试：依据上述选定的活性最高的细菌培养物编号，从储存板上将保存的细菌划线接种于LBA平板，37℃下培养过夜，次日挑单菌落接种于1ml的LBA液体培养基，30℃、250rpm震荡过夜。然后，将40μl经培养的细菌接种在另一组试管之一中，试管中含有1ml加了氨苄青霉素(50μg/ml)的LB。然后，按上文中介绍的初筛步骤，让样品经历以下步骤：42℃诱导表达、收集细菌培养物、冷冻-解冻循环处理，测试每一个细菌裂解物液抗肿瘤细胞增殖活性和抗病毒活性。

[0050] 每一轮筛选过程中，经过验证性测试后选取约20个抗肿瘤细胞增殖或抗病毒活性最高的菌落，提取质粒，用BVBF：5′-accatgaaggtgacgctc-3′为引物对质粒及其插入片段进行自动DNA序列分析。在序列分析的基础上，剔除个别DNA序列完全相同的克隆，然后用表达载体pBVB的多克隆位点上游和下游的侧翼序列，设计引物BVBF：5′-accatgaaggtgacgctc-3′和BVR：5′-aatcttctctcatccgc-3′进行PCR扩增，产物用于下一轮改组文库的构建，然后重复上述筛选步骤。

[0051] 从上述五轮筛选中得到的抗病毒和抗肿瘤细胞增殖活性最高的大肠杆菌克隆，提取质粒并测序，其所带的、编码新型蛋白的多核苷酸序列命名为SEQID NO 1，上述含多核苷酸序列(SEQ ID NO 1)的质粒用于下一步构建重组表达质粒和工程菌。

[0052] 将人工添加起始密码子ATG的SEQ ID NO 1的多核苷酸序列克隆入温度可诱导的pBVB载体中，位于入PRPL启动子的调控之下，重组表达质拉名称分别为pNOVAFERON(图1所示为该质粒的构建流程图)。将重组表达质粒分别转化到大肠杆菌DH5a或者BL21中，得到表达工程菌E.coli-DH5α-509或者E.coli-BL21-509，将表达工程菌菌株冻存。

[0053] (2)工程菌的发酵表达

[0054] 将冻存的表达工程菌按1∶100比例接种于含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，在30℃、180rpm下摇瓶培养约10小时，为一级种子液。将一级种子液按1∶100比例接种于含适量抗生素的LB培养基，在30℃、250rpm下摇瓶培养约12-13小时为二级种子。OD600＝2.0-3.0时，菌体处于对数生长期初期，这个时期的菌种生长旺盛，此时的种子更容易适应新的生长环境。二级种子液接种比例为1∶10接种入发酵起始培养基中，在30℃、180rpm下摇瓶培养约13-15小时为发酵种子。

[0055] 发酵种子也按1∶10体积加入到发酵罐中，发酵罐中为发酵起始培养基，培养温度控制在30℃，氨水调节PH至6.98±0.02，溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30％以上。所述的发酵起始培养基为经过反复筛选确定的改进型M9，所述改进的M9培养基的配方为：1.0L培养基包括Na2HPO412.0g、K2HPO43g、NaCl 0.5g、Trytone 10.0g、Yeast Extract15.0g、Glucose 3.75g、NH4Cl 1.0g和MgSO40.3g，所述改进型M9培养基中的葡萄糖是单独高压灭菌后加入，NH4Cl和MgSO4是配置后过滤除菌加入。

[0056] 根据发酵过程中各培养阶段工程菌生长补料(即流加补料)。补料用的碳源为50％(质量比)葡萄糖溶液，氮源为30％(质量比)酵母粉溶液，用25％(体积比)的氨水调节PH值，用20％(体积比)的泡敌溶液做消泡剂。由于过高碳/氮比会使蛋白表达量下降，过低的碳/氮比会使表达的目标蛋白形成不溶形式，因此采用葡萄糖和酵母提取物作为补料，50L的发酵罐大约加入1800ml 50％葡萄糖溶液，2300ml 30％酵母粉溶液，用
500ml 25％的氨水调节PH值，通过控制培养物碳/氮比，获得适当的工程菌生长速率和蛋白表达速率，使目标蛋白的含量约占菌体总蛋白的30％。

[0057] 在发酵罐设备的技术配置允许的条件下，可以采用自动流加补料方式，设计单位时间的补料量，由设备程序控制补料泵，自动限量流加补料，发酵罐的参数值变化控制平稳，细菌的生长状态很稳定。补料量的多少则是根据发酵罐容量的大小，发酵液的体积量及发酵过程中的菌密度、最终的菌密度(OD600值)来确定补料量。

[0058] 工程菌生长达合适密度时，通过从培养温度30℃升温到诱导42℃诱导蛋白表达。在升温诱导过程中加快补料以提供较为充分的营养，通过加大搅拌速度和通气量维持溶氧率在20％以上，诱导表达3.5小时终止发酵离心收菌。

[0059] 在50L工作体积的发酵罐上发酵起始体积为45L，培养至OD600＝7.0-8.0时升温诱导，在30分钟内，将温度升至42.0℃，维持41℃，诱导3.5小时。发酵终OD600为17.0-19.0。在此条件下，发酵菌达到2100g细菌湿重/45L发酵液以上，目标蛋白的表达量在33.0％左右。通过对发酵菌体破菌后电泳分析证明，以上方式实现α干扰素类似物的可溶性蛋白表达。在此时间段和该温度范围内可以获得高比例可溶性的高效目标蛋白表达。
过低的诱导温度会使阻逆蛋白活性保留而减少目标蛋白表达量，过高的诱导温度比会增加目标蛋白形成不溶形式的比例。

[0060] 与之结构相似的蛋白在大肠杆菌中高效表达时，多数呈现包含体的形式，而包含体形式的蛋白不具有生物活性，因此需要通过蛋白复性工艺。该干扰素样蛋白质含有两对二硫键，势必使复性工艺复杂及成本增加，同时因复性效率低而影响蛋白收率。可溶性表达可以省去蛋白复性的工艺而直接纯化得到具有生物活性的蛋白。

[0061] (3)目标蛋白的纯化工艺

[0062] 两种工程菌表达目标蛋白都是以可溶形式表达在胞周质腔中，菌体破碎后，目标蛋白的含量约占菌体总蛋白的30％。目标蛋白的理论分子量为19314.28Da，等电点6.60，疏水性氨基酸的比例为33.73％。

[0063] 根据对工程菌蛋白酶的不同处理方式，目标蛋白的纯化方式分别为以下四种纯化工艺。

[0064] 目标蛋白纯化工艺一：(层析前不对所述工程菌的蛋白酶进行处理的纯化工艺)[0065] 纯化工艺研究初期是采用E.coli-DH5α-509工程菌表达的蛋白上清液。经多步纯化后获得的目标蛋白电泳级纯品，但经质谱检测，纯化样品中除大部分分子量接近19314.28Da的完整蛋白外，尚存有分子量分别为18622.15Da和18578.89Da的降解蛋白，该两种降解蛋白比完整蛋白的分子量分别小692Da和736Da，可能为蛋白C端氨基酸残基被蛋白酶降解所致，造成氨基酸缺失。

[0066] 按照上述蛋白性质预测，通过对纯化方案探索，确定了如下纯化工艺：细菌破碎(用1∶10比例用磷酸缓冲盐PH8.0溶液制成匀浆后超声破碎)→离心取上清→用1M NaCl稀释(稀释10倍)→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析得到目的完整蛋白与降解蛋白的混合物。用螯合层析得到的样品为电泳纯，需要质谱分析方可发现有部分氨基酸残基降解蛋白质存在。因为混合物中三种分子形式的蛋白在分子量、等电点、疏水性等方面相差不大，所以试用C5Silica高效液相(HPLC)层析分离方法。C5 Silica HPLC分离该样品，用质谱分析各分部收集样品，降解蛋白位于HPLC洗脱峰的后1/3，不应收集入最终样品中。

[0067] 实施例1为目标蛋白纯化工艺一的具体实施例

[0068] 将冻存表达菌种接种于50ml含50ug/mg氨苄青霉素的LB培养基，在30℃、180rpm下摇瓶培养约10小时，为一级种子液。将一级种子液按1∶100比例接种于4000ml含适量抗生素的LB培养基，分12瓶摇瓶在30℃、250rpm下摇瓶培养约12-13小时为二级种子。OD600＝2.0-3.0小时1∶10接种入发酵起始培养基中。

[0069] 发酵罐中已经预高压灭菌40L发酵起始培养基液，加入种子液后温度控制在30℃，氨水调节PH至6.98±0.02，溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30％以上，根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。用25％的氨水调节PH值，用20％泡敌溶液做消泡剂。
采用自动流加补料方式，补充50％葡萄糖溶液为碳源，30％酵母粉溶液为氮源，补料量根据发酵参数及发酵过程中的菌密度确定。工程菌密度生长达OD600＝7.0-8.0时，通过从培养温度升温到诱导41℃诱导蛋白表达。在升温诱导过程中加快补料以提供较为充分的营养，通过加大搅拌速度和通气量维持溶氧率在20％以上，诱导表达3.5小时终止发酵，终体积约为45L，OD600为17.0-19.0.离心收菌约得到2100g细菌湿重，目标蛋白的表达量在
33.0％左右。

[0070] 纯化工艺：细菌破碎→离心取上清→用1M NaCl稀释10倍→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析得到目的完整蛋白与降解蛋白的混合物。因为混合物中三种分子形式的蛋白在分子量、等电点、疏水性等方面相差不大，所以使用C5 Silisca HPLC分离方法。完整蛋白位置在洗脱峰的前2/3部，之后是三种分子量蛋白的混合区，因此仅收集前2/3部分。收集后经用于除乙腈的POROS 50HS阳离子交换层析法彻底去除洗脱液中的乙腈，可获得纯度大于95％的纯品。活性总收率约25％，其生物活性比氨基酸缺失的蛋白(降解蛋白)高。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，目标蛋白的分子量与理论分子量相符合(如图2所示)。

[0071] 目标蛋白纯化工艺二：(层析前对所述工程菌的蛋白酶进行酸化处理的一种纯化工艺)

[0072] 能降解蛋白氨基酸的物质是酶，抑制降解的第一种方法是加入酶特异性抑制剂，优点是选择性高，缺点是抑制剂价格贵，第二种方法是使酶变性失去活性，优点是成本低，缺点是选择性差。考虑大规模生产成本，我们选择了第二种方法，采用用6M盐酸酸化灭活蛋白酶而目标蛋白有较好的抗酸变性能力。为了防止目标蛋白的降解，在将目标蛋白破菌释放出来后，立即用6M盐酸酸化达PH3-4。为防止上清中部分酸变性蛋白沉淀时目标蛋白的共沉淀作用，对酸化前上清用盐溶液进行稀释，而且立即加入，可以避免上清液又产生新的沉淀，从而影响蛋白酶的处理效果。先将上清液用1M NaCl稀释液作了1∶10、1∶20或1∶30三个稀释度，然后酸化，对比目标蛋白回收率，蛋白活性二项数据，1∶30倍稀释收率可达收率为80.5％，结果表明1∶30的稀释比例最佳。再比较1∶25、1∶30二个稀释度，1∶25的回收率为80.16％，与1∶30基本接近且可以减少稀释倍数，更适合于工业化生产，如低于1∶20影响蛋白收率，过高使样品体积偏大，增加层析时间和造成浪费，而蛋白回收率未见增加，因此最终确定稀释倍数为1∶25。

[0073] 将发酵获得的E.coli-DH5α-509工程菌破碎(用1∶10比例用磷酸缓冲盐PH8.0溶液制成匀浆后超声破碎)→蛋白上清稀释→酸化→POROS 50R1反相层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析→Superdex75凝胶层析，可获得纯度大于95％的纯品，活性总收率约30％。在Superdex75凝胶层析之前可经过用于浓缩样品的POROS 50HS阳离子交换层析，减少最后凝胶层析的上样量和层析时间。获得的目标蛋白经质谱检测，分子量为19313.07Da，与理论分子量相符合。

[0074] 实施例2为目标蛋白纯化工艺二的具体实施例

[0075] 菌种活化、种子液制备、发酵过程同实施例1。

[0076] 将发酵获得的E.coli-DH5α-509工程菌破碎，将上清液用1M NaCl稀释液作1∶25稀释，上清稀释液立即用6M盐酸酸化达pH3-4，在4-8℃放置2小时酸化灭活蛋白酶，用0.45μM囊式过滤器过滤除去固体杂质。过滤蛋白上清液→POROS 50R1反相层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析→用于浓缩样品的POROS 50HS阳离子交换层析→Superdex75凝胶层析，可获得纯度大于95％的纯品，活性总收率30％左右。获得的目标蛋白经质谱检测，分子量为19313.07Da，与理论分子量相符合，且生物活性比氨基酸缺失的目标蛋白高。

[0077] 目标蛋白纯化工艺三：(层析前对所述工程菌的蛋白酶进行酸化处理的另一种纯化工艺)

[0078] 酸化工艺同目标蛋白纯化工艺二，将发酵获得的E.coli-DH5α-509工程菌破碎(用1∶10比例用磷酸缓冲盐PH8.0溶液制成匀浆后超声破碎)→蛋白上清稀释→酸化→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析→C5 Silica高效液相色谱→用于去除乙腈的POROS 50HS阳离子交换层析，可获得纯度大于95％的纯品，活性总收率约40％。获得的目标蛋白经质谱检测，分子量为19313.07Da，与理论分子量相符合，且目标蛋白生物活性比前两种纯化方法获得的目标蛋白高。

[0079] 实施例3为目标蛋白纯化工艺三的具体实施例

[0080] 菌种活化、种子液制备、发酵过程同实施例1。

[0081] 将发酵获得的E.coli-DH5α-509工程菌破碎，将上清液用1M NaCl稀释液作1∶25稀释，上清稀释液立即用6M盐酸酸化达PH3-4，在4-8℃搅拌2小时酸化灭活蛋白酶，再用1M NaOH调节酸碱度至弱碱性(PH＝7.2-7.4)，用0.45μM囊式过滤器过滤除去固体杂质。过滤蛋白上清液→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析→Chelating Sepharose FF螯合层析→C5 Silica高效液相色谱→用于除乙腈的POROS 50HS阳离子交换层析，可获得纯度大于95％的纯品，活性总收率约40％。
如果C5 Silica高效液相色谱前的样品的体积较大，也可以先用用于浓缩样品的POROS
50HS阳离子交换层析以浓缩样品，减少操作时间。获得的目标蛋白经质谱检测，分子量为
19313.07Da，与理论分子量相符合，且目标蛋白生物活性比前两种纯化方法获得的目标蛋白高。

[0082] 目标蛋白纯化工艺四：(层析前对所述工程菌的蛋白酶进行加入蛋白酶抑制剂处理的纯化工艺)

[0083] E.coli BL21[hsd S gal(λcI ts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV-5-T7)]是 一种蛋白酶缺陷型工程宿主菌，蛋白酶含量较低，仅需要少量蛋白酶抑制剂就可以抑制其对目标蛋白的降解。采用蛋白酶缺陷宿主菌株加特异性蛋白酶抑制剂条件下破菌的方法可以避免蛋白酶对目标蛋白的降解，简化纯化步骤，提高蛋白收率。细菌蛋白酶从作用机理上分，一般包含有金属蛋白酶(如羧肽酶A/B，内肽酶N等)、丝氨酸蛋白酶(如内肽酶C、羧肽酶Y、蛋白酶K)、疏基蛋白酶(如组织蛋白酶C)和混合型酶，可以分别EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)、PMSF(Phenylmethanesulfony fluoride)、TPCK(Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)等抑制剂抑制酶活性。我们分别使用上述三种类型的抑制剂筛选抑制剂，结果均不够满意，所以考虑是多种作用类型的酶同时少量存在，使用复合型酶抑制剂后，效果良好，所以采用复合型蛋白酶抑制剂。

[0084] 我们选用三种不同作用机制的蛋白酶抑制剂：EDTA、PMSF和TPCK。因三种化合物的溶解条件不同，三种化合物分别配制储存液，EDTA易溶于水，用磷酸缓冲盐PH8.0溶液配制100mM/L溶液，PMSF和TPCK易溶于有机溶剂，配制成50mM/L的异丙醇溶液。使用液的终浓度分别达到1.0-10.0mM/L、0.1-1.0mM/L、0.1-1.0mM/L。

[0085] 将发酵获得的E.coli-BL21-509工程菌用1∶10比例用磷酸缓冲盐PH8.0溶液制成匀浆，同时加三种特异性蛋白酶抑制剂混匀后0-10℃破碎菌→离心获得蛋白上清加1M NaCl稀释10倍→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换→Chelating Sepharose FF螯合层析→用于浓缩样品的POROS 50HS阳离子交换层析→Superdex75凝胶层析，可获得纯度大于95％的纯品，总收率40％左右。获得的目标蛋白经质谱检测与理论分子量相符合，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测也与理论分子量相符合。该方法用于治疗药品的制备，在原液检测中需要额外增加蛋白酶抑制剂残留量的检测以及成品中异丙醇残留量的检测。同时无法去除同分异构体。

[0086] 实施例4为目标蛋白纯化工艺四的具体实施例

[0087] 菌种活化、种子液制备、发酵过程同实施例1。

[0088] 将发酵获得的E.coli-DH5α-509工程菌用1∶10比例用磷酸缓冲盐PH8.0溶液制成匀浆，同时加三种特异性蛋白酶抑制剂混匀后0-10℃破碎菌破碎，这三种特异性蛋白酶抑制剂分别为EDTA、PMSF、TPCK，其终浓度分别为2.0mM/L、0.4mM/L、0.4mM/L→蛋白上清加1M NaCl稀释10倍→HEA HyperCel疏水层析→用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换→Chelating Sepharose FF螯合层析→用于浓缩样品的POROS 50HS阳离子交换层析→Superdex75凝胶层析，可获得纯度大于95％的纯品，活性总收率40％左右。获得的目标蛋白经质谱检测与理论分子量相符合。

[0089] 以上各种层析的试验参数如下：

[0090] 1、疏水层析参数：

[0091] 平衡层析柱：平衡液为由终浓度20mM的PB、0.02％的Tween80(质量体积比)和终浓度1M NaCl配成的溶液(溶液PH＝7.5-8)，终浓度20mM的PB具体配方为总体积为1000ml的溶液中含有6.23g的Na2HPO4·12H2O和0.41g的NaH2PO4·2H2O。

[0092] 平衡流速200ml/min，平衡时间为15min；

[0093] 上样：上样流速200-260ml/min；

[0094] 洗脱：洗脱前用平衡液平衡15min，再用由20mM的PB和0.02％Tween80配成的洗脱液(洗脱液的PH＝6-6.5)进行洗脱，洗脱杂质及部分色素；洗脱流速为180-200ml/min；

[0095] 收集：由终浓度20mM的Na2HPO4-柠檬酸和0.02％的Tween80(质量体积比)配成的收集液(收集液的PH＝3.5-4)收集主峰，终浓度20mM的Na2HPO4-柠檬酸的具体配方为总体积为1000ml的溶液中含有2.3g的Na2HPO4·12H2O和1.42g的柠檬酸。

[0096] 收集时流速200ml/min。最后将收集的液体用PH＝4.4的稀释液稀释1倍，稀释液为由终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液，终浓度25mMAAB的具体配方为总体积为1000ml的溶液中含有1g的无水乙酸钠和0.73ml的冰乙酸。

[0097] 2、用于除杂质的POROS 50HS阳离子交换层析参数：

[0098] 平衡：平衡液为终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80的配成的溶液(PH＝4-4.5)；平衡流速为20ml/min，平衡时间为10min；

[0099] 上样：上样流速20ml/min；

[0100] 洗脱和收集：洗脱前用平衡液平衡10min，采用梯度洗脱，先用洗脱液I进行第一次洗脱，洗脱流速18-20ml/min，再用洗脱液II进行第二次洗脱并收集主峰，洗脱流速约为18-20ml/min，最后主峰用6MNaOH调PH到7.6-8.0。洗脱液I为由终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液，且PH＝4-4.5；洗脱液II为由终浓度25mM AAB、终浓度为
1.2M的NaCl和0.02％的Tween80配成的溶液，且PH＝4-4.5。

[0101] 3、Chelating Sepharose FF螯合层析参数：

[0102] 平衡：平衡液为终浓度20mM的PB、0.02％的Tween80和终浓度0.5M NaCl配成的溶液(溶液的PH＝7.5-8)；平衡流速20ml/min，平衡时间为15min；

[0103] 上样：上样流速20ml/min；

[0104] 洗脱和收集：洗脱前用平衡液平衡10min，用洗脱液I和洗脱液II分别洗脱，洗脱液I为终浓度25mM AAB、0.02％的Tween80和终浓度0.5M NaCl配成的溶液(其PH＝4.5-5)，洗脱流速20ml/min，洗杂质峰；洗脱液II为终浓度20mM的Na2HPO4-柠檬酸、0.02％的Tween80和终浓度为0.5M NaCl配成的溶液(其PH＝3.8)，洗脱流速20ml/min，再次洗杂质峰；再用收集液洗脱目的蛋白，收集液为终浓度20mM的Na2HPO4-柠檬酸、0.02％的Tween80和0.5MNaCl配成的溶液(其PH＝3.6)，收集时流速约为15ml/min，收集后样品用PH＝4.4的稀释液稀释3倍，所述稀释液为终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液。

[0105] 4、用于浓缩样品的POROS 50HS阳离子交换层析参数

[0106] 平衡：平衡液为终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液(其PH＝4-4.5)，平衡流速20ml/min，平衡时间为5min；

[0107] 上样：上样流速20ml/min；

[0108] 收集：用收集液收集全峰，收集液为终浓度20mM的PB、0.02％的Tween80和0.5M NaCl配成的溶液(其PH＝7.5-8)，收集时流速约为20ml/min。

[0109] 5、C5 Silica高效液相色谱参数

[0110] 平衡：平衡液为纯水和0.02％的TFA(三氟乙酸的体积比)配成的溶液(其PH＝3-4)，平衡流速6ml/min，平衡时间为20min；

[0111] 上样：上样样品用30％TFA调PH＝3-4，上样流速6ml/min；

[0112] 洗脱和收集：用纯水与0.02％的TFA配成的缓冲溶液I(其PH＝3-4)和用35％乙腈(体积比)与0.07％TFA配成的缓冲溶液II(PH＝3-4)分别过柱20分钟，然后用35％乙腈与0.07％TFA配成的缓冲溶液III(PH＝3-4)和用55％乙腈与0.08％TFA配成的缓冲溶液IV(PH＝3-4)进行梯度洗脱，收集主峰；洗脱后主峰立即用PH＝4.4的稀释液稀释5倍，稀释液为由终浓度的25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液。

[0113] 6、用于除乙腈的POROS 50HS阳离子交换层析参数：

[0114] 平衡：平衡液为由终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的溶液(其PH＝4.4)，平衡时间3min，平衡流速20ml/min；

[0115] 上样：上样流速20ml/min；

[0116] 洗脱和收集：首先用终浓度25mM AAB和0.02％的Tween80配成的缓冲溶液一(其PH＝4.4)洗脱以降低乙腈的残留，再用终浓度20mM的PB、0.02％的Tween80和0.5M NaCl配成的缓冲溶液二(其PH＝4.4)洗脱，再次降低乙腈的残留，最后用终浓度为20mM的PB、0.02％的Tween80和0.5M NaCl配成的收集液(PH＝7.6)收集全峰，蛋白浓度控制在1.0-1.5mg/ml。

[0117] 7、凝胶层析参数

[0118] 平衡：平衡液为终浓度为20mM的PB和0.15M NaCl配成的混合溶液(PH＝7-8)，平衡流速为6ml/min；

[0119] 上样：上样流速6ml/min；

[0120] 洗脱和收集：用终浓度为20mM的PB和终浓度0.15M NaCl配成的洗脱液(PH＝7-8)进行洗脱，洗脱流速为6ml/min，收集洗脱下来的溶液。

[0121] 8、反相层析POROS 50R1参数

[0122] 平衡：平衡液为纯水(调PH为3-4)，平衡流速为15ml/min，平衡时间为5min；

[0123] 上样：上样流速15ml/min；

[0124] 洗脱和收集：用15％乙腈(调PH为3-4)的溶液洗脱杂质峰，再用40％乙腈(调PH为3-4)的溶液洗脱收集目标峰。

[0125] (4)抗肿瘤活性的定量测定

[0126] 抗细胞增殖活性(antiproliferation activity)是重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液的主要功能之一。但不同细胞有不同的抗增殖活性，目前没有统一的细胞系用于检测人干扰素的抗肿瘤增殖活性，国际上采用Daudi细胞进行人干扰素的抗肿瘤细胞增殖活性。因重组人抗肿瘤抗病毒蛋白与I型干扰素有同源性，由此，我们选择目前最通用的细胞系Daudi细胞。用Daudi(ATCC CCL-213)细胞进行抗肿瘤细胞增殖活性测定，有三种检测方法。直接细胞计数法、同位素渗入方法及WST-1方法。经过大量的实验比较，WST-1方法是最优的选择。

[0127] 与我公司合作的Novagenetics Inc.公司，采用Daudi细胞检测抗肿瘤增殖活性，经过大量预实验，其目的是确定最佳细胞接种密度及此方法的稳定性与准确性；确定了初步的实验方法后，在进一步建立与完善的过程中与《中国药品生物制品标准化研究中心》进行合作，展开了稳定性、重现性、准确性和回收率的方法学研究，经过近2个月的实验，双方共同建立了标准规范的方法。用此方法检测多批次重组高效抗肿瘤抗病毒蛋白注射液原液，其抗肿瘤细胞增殖比活性不低于2.0×106U/mg。

[0128] 实施例5新型α干扰素类似物抗肿瘤活性的定量测定

[0129] (1)铺板：取培养的细胞离心收集，用完全培养液制备成每1mL含4.0×103个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。于温度为36.5℃、5％二氧化碳培养箱条件下培养2小时左右。

[0130] (2)活性测定参考品的制备：用完全培养液稀释至每1ml含15000U，在无菌条件下操作。

[0131] (3)供试品的制备：将新型α干扰素类似物按蛋白含量用完全培养液预稀释。

[0132] (4)制备样本梯度：于96孔细胞培养板中每孔加入180*1完全培养液，在B行相应的孔中加入20*1/孔4.2制备的参考品或4.3制备的供试品。自B行取20*1/孔至C行做10倍稀释，同理由C行取20*1/孔至D行依次往下做10倍稀释，共6个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔留180*1余液。

[0133] (5)加样：取出4.1制备的细胞培养板，将(4)制备的样本梯度对应移入该细胞培养板，每孔100*1。于温度为36.5℃，5％二氧化碳培养箱条件下培养6天。

[0134] (6)染色：培养后第七天，在细胞培养板中加入染色液WST-1，每孔20*1，于培养箱内温度为36.5℃，5％二氧化碳条件下放置4小时。

[0135] (7)比色：用酶标仪以450nm为测定波长，690nm为参比波长检测吸光度，并记录结果。

[0136] (8)实验结果

[0137] 抗肿瘤细胞增殖活性为1.7×107U/mL，抗肿瘤细胞增殖比活性为1.5×107U/mg，原始数据见图3。

[0138] 序列表

[0139] <110>杰华生物技术(北京)有限公司

[0140] <120>α干扰素类似物的蛋白制备方法

[0141] <130>zh20100126

[0142] <160>1

[0143] <170>PatentIn version 3.3

[0144] <210>1

[0145] <211>498

[0146] <212>DNA

[0147] <213>人工序列

[0148] <400>1

[0149] tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60[0150] atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttga atttccccag 120[0151] gaggagtttg atggcaacca gttccaaaag gctgaaacca tccctgtcct ccatgagatg 180[0152] atccagcaga tcttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc 240[0153] ctcctagaca aattctacac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgtgtg 300[0154] atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg cggactccat cctggctgtg 360[0155] aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgatggaga agaaatacag cccttgtgcc 420[0156] tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccctctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480[0157] agattaaggg ggaaggat 498