编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的应用

摘要

本发明公开了一种编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的应用。本发明提供的优化基因是序列表的序列2所示的DNA。所述基因的表达能力远高于现有基因，将该基因插入pET28b(+)的多克隆位点得到了重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21，得到了重组菌。该重组菌通过简单的诱导培养就可以制备出大量ChIFNα蛋白。本发明提供的基因、重组质粒和重组菌对于鸡α干扰素的生产极具经济价值，对于肉鸡养殖业也具有重大价值。

权利要求

1.序列表的序列2所示的DNA。

2.含有序列表的序列2所示的DNA的重组载体。

3.含有序列表的序列2所示的DNA的重组菌。

4.含有序列表的序列2所示的DNA的表达盒。

5.含有序列表的序列2所示的DNA的转基因细胞系。

6.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将序列表的序列2所示的DNA插入pET28b(+)的NdeI和EcoRI位点间得到的重组质粒。

7.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα，CGMCC No.4112。

8.一种制备鸡α干扰素的方法，包括如下步骤：将权利要求7所述重组菌进行IPTG诱导表达后破碎菌体，收集包涵体、洗涤包涵体、溶解包涵体并将其复性，得到得到含有鸡α干扰素的溶液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述诱导表达是在所述重组菌的菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度为1mmol/L，然后37℃培养4h。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述含有鸡α干扰素的溶液进行蛋白纯化的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述纯化的方法如下：将所述含有鸡α干扰素的溶液用Superdex 7510/300GL分子筛层析柱纯化；纯化所用的洗脱液pH为8.0，由Tris、NaCl和水组成，Tris的浓度为20mM，NaCl的浓度为150mM；洗脱液的流速为0.3ml/min；收集洗脱体积为12.8ml-15.1ml的洗脱液，即为鸡α干扰素溶液。

12.权利要求1所述DNA或权利要求2或6所述的重组载体、权利要求3或7所述重组菌、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述转基因细胞系在制备鸡α干扰素中的应用。

说明书

编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的应用。

背景技术

[0002] 干扰素(Interferon，IFN)最初于1957年由英国科学家Isaacs研究禽流感病毒的干扰现象时被发现，是一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，由病毒及其它种类的干扰素诱导剂刺激内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及体细胞所产生，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及诱导分化等活性。干扰素作用的发挥并不是直接作用于病毒，而是刺激细胞产生多种广谱抗病毒蛋白，可通过直接或间接途径发挥抗病毒作用。

[0003] 根据结构及受体的不同，可将IFN分为两类：I型IFN和II型IFN。哺乳动物I型IFN主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-ω和IFN-τ，对酸和热稳定，具有高效抗病毒活性，其中IFN-α主要由白细胞产生，IFN-β主要由成纤维细胞产生；II型IFN包括IFN-γ，由T细胞和NK细胞产生，对酸和热不稳定，主要是免疫调节作用，是哺乳动物主要的巨噬细胞活化因子。鸡及其它禽类IFN与哺乳动物IFN类似，也分为I型IFN和II型IFN，现已发现鸡I型IFN包括IFN-α、IFN-β，II型包括IFN-γ，目前在禽类中尚未发现IFN-ω和IFN-τ。

[0004] 鸡IFN基因最初于1994年由Sekellick从老化的鸡胚细胞cDNA文库中成功克隆，其与哺乳动物IFN的序列相似性较低(与哺乳动物I型IFN的氨基酸同源性约为20％，与II型IFN仅为3％左右)，但其半胱氨酸的位置及可由病毒诱导产生的特性相对保守，与哺乳动物I型IFN类似，因此推测其为鸡I型IFN。随后1995年，Schultz等人发现此种鸡IFN具有抗滤泡性口炎病毒的活性，且缺少哺乳动物IFN-γ相关的生物活性，从而证实了这一观点。1996年，Christine Sick等人对上文的cDNA文库进行Southern杂交分析和λ-噬菌体筛选，发现鸡的基因组至少含有10种IFN基因。其中一个基因家族的3个基因编码鸡IFN-α(ChIFN-α，又称ChIFNα)，另一单独基因的产物为鸡IFN-β(ChIFN-β)。ChIFN-α由193个氨基酸残基组成，其成熟肽大小为162aa，N-端31个氨基酸为信号肽。尽管ChIFN-α与哺乳动物IFN-α的氨基酸同源性仅为24％，但高度保守区的氨基酸同源性高达80％，两者二级结构中α-螺旋的位置也类似，且两者均可由咪喹莫特衍生物S-28463诱导产生，因此将其命名为ChIFN-α。ChIFN-β由203个氨基酸残基组成，其成熟肽大小为176aa。1999年，Plachy等人用重组ChIFN-α处理鸡胚成纤维细胞(CEF)后再用劳斯肉瘤病毒(RSV)攻毒，发现高剂量的干扰素有抗肿瘤的作用。同时，Marcus等人发现给1日龄雏鸡投喂高剂量ChIFN-α，可以显著降低新城疫病毒的发病率。2001年，Mo C W等人发现ChIFN-α可抑制传染性法氏囊病病毒(IBDV)形成空斑，并可提高感染IBDV鸡的成活率。Ellen等人发现ChIFN-α可抑制传染性支气管炎病毒(IBV)的复制，从而延迟疾病的发作，减弱临床病症，表明ChIFN-α可能是潜在的免疫增强剂。2001年，Jarosinski等人发现用ChIFN-α处理鸡后可显著降低NK细胞的细胞毒作用，用ChIFN-α处理CKC后可抑制马立克病毒(MDV)的复制，使MDV噬斑形成减少50％。

[0005] 2003年，夏春等人克隆鉴定了我国三种品系鸡的IFN-α基因：SH-鸡、WJ-鸡和AA-鸡。对三种鸡的IFN-α进行同源性分析，进而将ChIFN-α分为两个亚类：SH-ChIFN-α和WJ-ChIFN-α。并发现两者均具有抗VSV活性，高剂量的SH-ChIFN-α能够抑制40％的鸡胚感染H9N2，100％抑制1日龄到5日龄雏鸡感染。2009年，陶胜利等人发现混饮低剂量ChIFN-α可提高肉鸡外周血白细胞总数，可提高肉鸡的免疫功能，对健康肉鸡的生长无显著影响。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种编码鸡α干扰素的优化基因及其在制备鸡α干扰素中的应用。

[0007] 本发明提供的编码鸡α干扰素的优化基因为序列表中序列2所示的DNA。

[0008] 含有序列表中序列2所示的DNA的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。

[0009] 所述重组载体可为将序列表中序列2所示的DNA插入pET28b(+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组载体具体可为将序列表的序列2所示的DNA插入pET28b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点间得到的重组质粒。

[0010] 所述重组菌可为将序列表中序列2所示的DNA导入大肠杆菌BL21得到的重组菌；所述重组菌具体可为将权利要求3所述重组载体导入大肠杆菌BL21得到的重组菌。所述重组菌优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα，已于2010年08月
23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4112。

[0011] 本发明还保护一种制备鸡α干扰素的方法，包括如下步骤：将所述重组菌进行IPTG诱导表达后破碎菌体，收集包涵体、洗涤包涵体、溶解包涵体并将其复性，得到含有鸡α干扰素的溶液。

[0012] 所述诱导表达具体可为在所述重组菌的菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPT6)诱导剂，使其终浓度为1mmol/L，然后37℃培养4h。

[0013] 所述方法还可包括将所述含有鸡α干扰素的溶液进行蛋白纯化的步骤。

[0014] 所述纯化的方法具体如下：将所述含有鸡α干扰素的溶液用Superdex 7510/300GL分子筛层析柱纯化；纯化所用的洗脱液pH＝8.0，由Tris、NaCl和水组成，Tris的浓度为20mM，NaCl的浓度为150mM；洗脱液的流速为0.3ml/min；收集洗脱体积为
12.8ml-15.1ml的洗脱液，即为鸡α干扰素溶液。

[0015] 所述方法制备得到的鸡α干扰素也属于本发明的保护范围。

[0016] 所述DNA、重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系均可用于制备鸡α干扰素。

[0017] 本发明发现了一种优化的ChIFNα基因，所述基因的表达能力远高于现有基因，将该基因插入pET28b(+)的多克隆位点得到了重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21，得到了重组菌。该重组菌通过简单的诱导培养就可以制备出大量ChIFNα蛋白。本发明提供的基因、重组质粒和重组菌对于鸡α干扰素的生产极具经济价值，对于肉鸡养殖业也具有重大价值。

附图说明

[0018] 图1为ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的比对。

[0019] 图2为ChIFNα-1基因PCR扩增图；M：marker；1、2：ChIFNα-1基因。

[0020] 图3为ChIFNα-1的SDS-PAGE检测结果；C：未诱导对照；I：诱导后对照；S：诱导后上清；P：诱导后沉淀；箭头所指为诱导表达的目的蛋白，约20kD，与实际大小(21.2kD)相符。

[0021] 图4为ChIFNα-1的western blot检测结果；C：未诱导对照；S：诱导后上清；P：诱导后沉淀。

[0022] 图5为ChIFNα-2的SDS-PAGE检测结果；1：marker；2：未诱导对照；3：诱导后沉淀。

[0023] 图6为蛋白溶液甲和蛋白溶液乙的ChIFNα蛋白含量比较；2：蛋白溶液乙；3：蛋白溶液甲。

具体实施方式

[0024] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。pET28b(+)：购自Novagen公司产品，货号为69865-3。大肠杆菌DH5α：购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0808。大肠杆菌BL21：购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0809。DF-1细胞(鸡成纤维细胞)：购自北京中原公司(ATCC细胞系编号为：CRL-12203)。VSV病毒(水泡性口炎病毒)：购自中国兽医药品监察所。所有引物合成及测序工作均由上海生工公司完成。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0025] 实施例1、鸡ChIFNα-1基因的发现

[0026] 1、鸡总RNA的提取

[0027] 根据invitrogen公司的DNA提取试剂盒，从鸡(品种为青脚麻鸡，购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平动物实验基地)全血中提取鸡的基因组DNA。

[0028] 2、特异引物对的设计

[0029] 参照现有鸡干扰素α基因序列，设计引物对如下：

[0030] 上游引物：5’-GGAATTCCATATGTGCAACCACCTTCGCC-3’(下划线标注NdeI酶切位点)；

[0031] 下游引物：5’-CCGGAATTCCTAAGTGCGCGTGTTGC-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。

[0032] 3、ChIFNα基因的扩增

[0033] 以步骤1的基因组DNA为模板，用步骤2设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0034] 将PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表的序列2所示。

[0035] 已公开的鸡ChIFNα基因如序列表的序列3所示(GENBANK ACCESSION NO.DQ226094)。序列2所示基因和序列3所示基因的比对见图1，两者存在5个不同核苷酸，均编码序列表的序列1所示的ChIFNα蛋白。将序列表的序列2所示的DNA命名为ChIFNα-1基因，将序列表的序列3所示的DNA命名为ChIFNα-2基因(现有基因)。

[0036] 实施例2、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达

[0037] 一、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的制备

[0038] 1、ChIFNα-1基因的制备

[0039] 制备序列表的序列2所示的DNA，将其作为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(ChIFNα-1基因)。

[0040] PCR扩增引物对如下：

[0041] 上游引物：5’-GGAATTCCATATGTGCAACCACCTTCGCC-3’(下划线标注NdeI酶切位点)；

[0042] 下游引物：5’-CCGGAATTCCTAAGTGCGCGTGTTGC-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。

[0043] PCR条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃50s，30个循环；72℃10min。

[0044] 将步骤2的PCR扩增产物进行电泳，电泳结果见图2。图2中，箭头所指为目的基因，约500bp，与实际大小(492bp)相符。

[0045] 2、ChIFNα-2基因的制备

[0046] 制备序列表的序列3所示的DNA，将其作为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(ChIFNα-2基因)。PCR扩增引物对和PCR条件同步骤1，将PCR扩增产物进行电泳。

[0047] 二、重组质粒的构建

[0048] 1、重组质粒pET28b-ChIFNα-1的构建

[0049] ①切胶回收步骤一的ChIFNα-1基因，用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后，回收酶切产物。

[0050] ②用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切pET28b(+)，回收载体骨架。

[0051] ③用T4DNA连接酶将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。

[0052] ④将步骤③的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单克隆进行PCR鉴定，阳性克隆提质粒进行测序鉴定，测序结果表明，得到了重组质粒pET28b-ChIFNα-1。pET28b-ChIFNα-1中，在pET28b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的ChIFNα-1基因。

[0053] 2、重组质粒pET28b-ChIFNα-2的构建

[0054] ①切胶回收步骤一的ChIFNα-2基因，用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切后，回收酶切产物。

[0055] ②用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切pET28b(+)，回收载体骨架。

[0056] ③用T4DNA连接酶将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。

[0057] ④将步骤③的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑单克隆进行PCR鉴定，阳性克隆提质粒进行测序鉴定，测序结果表明，得到了重组质粒pET28b-ChIFNα-2。pET28b-ChIFNα-2中，在pET28b(+)的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的ChIFNα-2基因。

[0058] 三、重组菌的制备

[0059] 将pET28b-ChIFNα-1转化大肠杆菌BL-21(表达菌)，在含卡那霉素的LB琼脂平板上挑取含重组质粒的单个重组菌菌落，将其中一个重组菌命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21/pET28b-ChIFNα，已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.4112。

[0060] 采用相同的方法将pET28b-ChIFNα-2转化大肠杆菌BL-21，得到对照菌。

[0061] 四、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达

[0062] 1、ChIFNα-1基因的表达

[0063] ①将重组菌E.coli BL21/pET28b-ChIFNα接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜活化。

[0064] ②按1∶100的体积比将活化菌接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养约2h至对数生长期(D600nm值达0.5～0.8)，取出少量作未诱导对照，剩余部分加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达4h。

[0065] ③用500μl PBS(8g NaCl、0.2g KCl、1.38g Na2HPO4、0.2g KH2PO4溶于1l ddH2O，调pH至7.4)重悬细菌，小号探头超声裂解(超声2s，停4s，20次)，取出少量作为诱导后对照；然后12，000rpm离心10min；取上清(诱导后上清)，用500μl PBS(8gNaCl、0.2g KCl、1.38g Na2HPO4、0.2g KH2PO4溶于1L ddH2O，调pH至7.4)重悬沉淀(诱导后沉淀)。

[0066] 分别将未诱导对照、诱导后对照、诱导后上清和诱导后沉淀进行12％SDS-PAGE，结果见图3。

[0067] 因为重组蛋白上带有His标签，用Anti-His的抗体进行Western Blot验证，结果见图4。图4表明，所表达的确实是目的蛋白，以包涵体的形式表达。

[0068] 2、ChIFNα-2基因的表达

[0069] 将对照菌代替重组菌E.coli BL21/pET28b-ChIFNα，其它完全同步骤1。

[0070] 分别将未诱导对照和诱导后沉淀进行12％SDS-PAGE，结果见图5。

[0071] 因为重组蛋白上带有His标签，用Anti-His的抗体进行Western Blot验证，结果表明，所表达的确实是目的蛋白，以包涵体的形式表达。

[0072] 五、蛋白的纯化

[0073] 分别将步骤四的1的②的菌液和步骤四的2的②的菌液提取纯化蛋白，步骤如下：

[0074] ①取2L诱导后的菌液，离心收集菌体，超声破碎(超声6s，间隔12s，99次，300W)，离心收集沉淀(包涵体)。

[0075] ②依次用washing buffer(0.5％Triton-100，50mM Tris pH＝8.0，300mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)、resuspension buffer(50mM Tris pH＝8.0，100mM NaCl，10mMEDTA，
10mM DTT)洗涤包涵体，离心收集沉淀。

[0076] ③用dissolution buffer(6M Gua-HCl，10％甘油，50mM Tris pH＝8.0，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)完全溶解包涵体，离心弃沉淀。

[0077] ④稀释 法进 行复性：上 清加 入5mL注射 器内，缓 慢滴入 refolding buffer(100mMTris pH＝8.0，400mM L-Arg HCl，2mM EDTA，5mM GSH，0.5mM GSSG)，4℃低速搅拌12-24h。

[0078] ⑤将步骤④的溶液用浓缩杯于4℃进行浓缩，浓缩至20ml左右时加分子筛缓冲液(20mM Tris pH＝8.0，150mM NaCl)至100ml继续浓缩，重复2次再次浓缩至20ml左右时移至浓缩管浓缩至4ml。

[0079] ⑥取1ml上述浓缩液12000rpm，10min离心，用Superdex 7510/300GL分子筛层析柱纯化(柱体积为24ml；填充物为葡聚糖凝胶；洗脱液：20mM Tris pH＝8.0，150mMNaCl；流速：0.3ml/min)，收集洗脱体积为12.8ml-15.1ml的洗脱液，即为目的蛋白溶液。

[0080] 用步骤四的1的②的菌液纯化得到的蛋白溶液作为蛋白溶液甲(批次2009001)。用步骤四的2的②的菌液纯化得到的蛋白溶液作为蛋白溶液乙(批次2009001)。

[0081] 六、蛋白溶液甲和蛋白溶液乙的ChIFNα蛋白含量比较

[0082] 分别将步骤五得到的蛋白溶液甲和蛋白溶液乙进行Western Blot，一抗为Anti-His抗体(购自Santa Cruz公司，货号为：SC-8036)，结果见图6。结果表明，蛋白溶液甲中ChIFNα蛋白的含量远高于蛋白溶液乙中ChIFNα蛋白的含量。

[0083] 实施例3、ChIFNα-1基因和chiIFNα-2基因的表达

[0084] 一、重组菌和对照菌的制备

[0085] 将实施例2的步骤二制备的pET28b-ChIFNα-1转化大肠杆菌BL-21，得到重组菌。将实施例2的步骤二制备的pET28b-ChIFNα-2转化大肠杆菌BL-21，得到对照菌。

[0086] 二、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达

[0087] 1、ChIFNα-1基因的表达

[0088] ①将重组菌接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜活化。

[0089] ②按1∶100的体积比将活化菌接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养约2h至对数生长期(D600nm值达0.5～0.8)，取出少量作未诱导对照，剩余部分加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达4h。

[0090] 2、ChIFNα-2基因的表达

[0091] ①将对照菌接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜活化。

[0092] ②按1∶100的体积比将活化菌接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养约2h至对数生长期(D600nm值达0.5～0.8)，取出少量作未诱导对照，剩余部分加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达4h。

[0093] 三、蛋白的纯化

[0094] 1、蛋白溶液甲的制备

[0095] 将步骤二的1的②得到的菌液进行纯化，方法同实施例2的步骤五，得到蛋白溶液甲(批次2009002)。

[0096] 将步骤二的2的②得到的菌液进行纯化，方法同实施例2的步骤五，得到蛋白溶液乙(批次2009002)。

[0097] 实施例4、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达

[0098] 一、重组菌和对照菌的制备

[0099] 将实施例2的步骤二制备的pET28b-ChIFNα-1转化大肠杆菌BL-21，得到重组菌。将实施例2的步骤二制备的pET28b-ChIFNα-2转化大肠杆菌BL-21，得到对照菌。

[0100] 二、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达

[0101] 1、ChIFNα-1基因的表达

[0102] ①将重组菌接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜活化。

[0103] ②按1∶100的体积比将活化菌接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养约2h至对数生长期(D600nm值达0.5～0.8)，取出少量作未诱导对照，剩余部分加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达4h。

[0104] 2、ChIFNα-2基因的表达

[0105] ①将对照菌接种于3ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜活化。

[0106] ②按1∶100的体积比将活化菌接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养约2h至对数生长期(D600nm值达0.5～0.8)，取出少量作未诱导对照，剩余部分加入IPTG诱导剂(终浓度为1mmol/L)，37℃诱导表达4h。

[0107] 三、蛋白的纯化

[0108] 1、蛋白溶液甲的制备

[0109] 将步骤二的1的②得到的菌液进行纯化，方法同实施例2的步骤五，得到蛋白溶液甲(批次2009003)。

[0110] 将步骤二的2的②得到的菌液进行纯化，方法同实施例2的步骤五，得到蛋白溶液乙(批次2009003)。

[0111] 实施例5、ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达能力比较

[0112] 比较实施例2至实施例4制备的三个批次的蛋白溶液甲和蛋白溶液乙中的蛋白量差异，以比较ChIFNα-1基因和ChIFNα-2基因的表达能力，方法如下：

[0113] 按50∶1的体积比取BCA蛋白定量试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0014)中的溶液A和溶液B混合成工作液，并将BSA标准品梯度稀释至500mg/ml，400mg/ml，300mg/ml，200mg/ml，100mg/ml，50mg/ml，25mg/ml，取各个浓度的标准品或待测蛋白样品20μl，加200μl的工作液混合，用保鲜膜封好37℃孵育30min，恢复至室温后用酶标仪读OD565吸光值。根据标准品浓度和吸光值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算待测蛋白样品中的蛋白浓度。

[0114] 蛋白溶液甲(批次2009001)的蛋白浓度为3.6mg/ml，蛋白溶液乙(批次2009001)的蛋白浓度为2.3mg/ml。蛋白溶液甲(批次2009002)的蛋白浓度为3.7mg/ml，蛋白溶液乙(批次2009002)的蛋白浓度为2.2mg/ml。蛋白溶液甲(批次2009003)的蛋白浓度为3.55mg/ml，蛋白溶液乙(批次2009003)的蛋白浓度为2.35mg/ml。

[0115] 结果表明，虽然只相差5个核苷酸，但本发明提供的ChIFNα-1基因的表达能力远远高于现有的ChIFNα-2基因。

[0116] 实施例6、用本发明的方法制备的ChIFNα-1蛋白的干扰素活性

[0117] 将实施例2至实施例4制备的三个批次的蛋白溶液甲分别分成两组：第一组：4℃-8℃保存，分别于6个月、12个月、18个月和24个月取样检测干扰素活性；第二组：25℃保存，分别于1个月、3个月和6个月取样检测干扰素活性。

[0118] 干扰素活性检测方法如下：

[0119] 1、细胞制备

[0120] 取生长良好的DF-1细胞，消化后用含10％FBS的DMEM制备细胞悬液；对细胞进5
行计数，调整细胞浓度为5×10 个/mL的悬液，然后加入到96孔细胞培养板上(100μl/孔)，37℃、5％CO2培养8-10h使其成为单层细胞。

[0121] 2、加入干扰素处理细胞

[0122] 将蛋白溶液甲用含10％FBS的DMEM预稀释至终浓度为0.001mg/ml，作为母液，再将母液进行4倍梯度稀释，稀释6个梯度，得到各种稀释液。

[0123] 3、步骤1的细胞培养板每孔中的培养液吸出；细胞培养板中的6个孔(3个阳性对照孔，3个阴性对照孔)加入100μl/孔的细胞培养液，其余孔分别加入步骤2的稀释液(100μl/孔，每个梯度三个重复)；37℃、5％CO2培养12-15h。

[0124] 4、病毒感染

[0125] 取VSV病毒，用无血清DMEM稀释成终浓度为1000TCID50/ml的病毒稀释液；阳性对照孔每孔加入100μl病毒稀释液，阴性对照孔每孔加入100μl无血清DMEM培养液，其余各孔每孔加入100μl病毒稀释液；培养24h。

[0126] 5、结晶紫染色

[0127] 弃细胞培养液，于每孔中加入结晶紫染色液100μl，室温放置30min。

[0128] 6、脱色

[0129] 弃染料，并用自来水或双蒸水冲洗未着色染料，然后在每孔中加入脱色液100μl，室温放置10min。

[0130] 7、利用酶标仪测定OD570值并记录。

[0131] 8、数据处理

[0132] 以能抑制50％细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50％细胞病变的稀释倍数，结果见表1。

[0133] 表1运用Reed-Muench法计算干扰素效价

[0134]

[0135]

[0136] X：阴性对照(无病毒对照)的OD570平均值；

[0137] Y：阳性对照(病毒对照)的OD570平均值。

[0138] 根据上表计算各项值，最后根据G项按照如下公式计算干扰素效价(假设上述计算中G4项计算值大于0.5，而G5项计算值小于0.5)：

[0139] 待检测干扰素效价(U/0.001mg)＝预先稀释倍数×4(4+(G4-0.5)/(G4-G5))。

[0140] 干扰素效价检测结果见表2。

[0141] 表2干扰素效价检测结果

[0142]

[0143]

[0144] 结果表明：采用本发明的方法制备的蛋白溶液甲在4℃-8℃存放24个月，25℃存放3个月，生物活性无明显变化。