一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；同源重组序列I的第1～972bp是rns的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；同源序列II的第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是rnl的5’部分。该同源重组序列使得通过电击法即可将表达载体导入海洋微藻叶绿体基因组中，方便了载体导入叶绿体基因组的途径并大大降低了转化成本，为实现利用海洋微藻叶绿体为生物反应器生产高附加值产品提供了技术支撑。

权利要求

1.一种海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于该海洋微藻叶绿体表达载体包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；

所述同源重组序列I如SEQ ID No.1所示，其中第1～972bp是编码16s核糖体RNA， ，小亚基基因的3部分，第973～1097bp是trnI的5部分；

，

所述同源重组序列II如SEQ ID No.2所示，其中第1～196bp是trnA基因的3部分，，第197～1483bp是编码23s核糖体RNA大亚基基因的5部分；

所述目的基因表达盒的启动子为CaMV 35S启动子；所述目的基因表达盒的终止子为NOS终止子；

所述的海洋微藻为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）。

2.根据权利要求1所述所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于：该海洋微藻叶绿体表达载体还包含抗性筛选表达盒或荧光蛋白表达盒。

3.根据权利要求2所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于：所述的抗性筛选表达盒由启动子、抗性筛选标记基因和终止子组成；所述的荧光蛋白表达盒由启动子、荧光蛋白基因和终止子组成。

4.根据权利要求3所述海洋微藻叶绿体表达载体，其特征在于：所述抗性筛选表达盒的抗性筛选标记基因为氯霉素抗性基因；所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。

5.权利要求1或2所述海洋微藻叶绿体表达载体的应用，其特征在于：所述海洋微藻叶绿体表达载体应用于在海洋微藻中表达外源蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包含以下步骤：通过基因转移技术将海洋微藻叶绿体表达载体转入海洋微藻中，然后筛选得到目的基因表达的海洋微藻。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述基因转移技术为电击法；

所述筛选的方式为通过抗性筛选或通过荧光蛋白筛选。

说明书

一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微藻基因工程领域，具体涉及一种海洋微藻叶绿体表达载体及其应用。

背景技术

[0002] 自从1984年首例转基因植物烟草问世以来，向植物细胞核中转化外源基因一直是植物基因工程的主要研究方向。但是由于外源基因在植物细胞核中表达量低下、在后代中表达不稳定、以及核基因容易随花粉扩散所带来的生态安全性等问题的存在。与传统的核转基因相比，叶绿体转化有着诸多优点：每个植物细胞中都存在大量的叶绿体拷贝，使得外源基因得到核基因转化很难实现的超量表达；外源基因通过同源重组定点整合在叶绿体基因组后不会产生位置效应和基因沉默现象；叶绿体遗传转化具有母性遗传的特点，有望解决核基因转化系统中因花粉扩散带来的生物安全性问题；大多数叶绿体基因以操纵子的形式存在，可实现多个外源基因在叶绿体基因组中同时转化和表达；在叶绿体中表达的蛋白质可以形成二硫键，人源蛋白表达后也可以被正确折叠。

[0003] 海洋微藻是海洋生态系统的初级生产者，约占海洋生物物种的40.86％，微藻还具有生长周期短，繁殖速度快，可塑性强，对营养要素要求简单，叶绿体占微藻细胞大部分体积等特点。硅藻是大量存在于海洋生态系统中单细胞浮游植物，因为其占地球初级生产力总量的25％并且和O2的生成密切相关从而被认为具体重要的作用。

[0004] 目前已经成功进行叶绿体转化的真核藻类仅有莱茵衣藻，该转化体系中利用叶绿体来源的启动子终止子来调控外源基因的表达，通过基因枪技术将载体导入叶绿体基因组中，获得了成功表达，但海洋微藻的叶绿体转化体系还未被建立，而且传统的叶绿体转化载体导入受体叶绿体基因组中都是通过基因枪技术来完成，操作复杂且成本较高。

发明内容

[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的不足之处和缺陷，提供一种海洋微藻叶绿体表达载体。

[0006] 本发明的另一目的在于提供所述海洋微藻叶绿体表达载体的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种海洋微藻叶绿体表达载体，包含同源重组序列I、目的基因表达盒和同源重组序列II；目的基因表达盒位于同源重组序列I和同源重组序列II之间；

[0008] 所述同源重组序列I如下所示，由rns(核糖体RNA小亚基基因，编码16s核糖体RNA小亚基)的3’部分和trnI的5’部分组成的，同源重组序列I中的第1～972bp是rns基因的3’部分，第973～1097bp是trnI的5’部分；

[0009] 1 ACTGGGCGTA AAGCGTCTGT AGGTGGTCCA ATAAGTCAAC TGTTAAATCT TGAGGCTCAA[0010] 61 CCTCGAAATC GCAGTCGAAA CTATTAGACT AGAGTATAGT AGGGGTAAAG GGAATTTCCA[0011] 121 GTGGAGCGGT GAAATGCGTA GAGATTGGAA AGAACACCGA TGGCGAAGGC ACTTTACTGG[0012] 181 GCTATTACTA ACACTGAGAG ACGAAAGCTA GGGTAGCAAA TGGGATTAGA TACCCCAGTA[0013] 241 GTCCTAGCCG TAAACAATGG ATACTAGATG TTGAACAGAT CGACCTGTGC AGTATCAAAG[0014] 301 CTAACGCGTT AAGTATCCCG CCTGGGAAGT ATGCTCGCAA GAGTGAAACT CAAAGGAATT[0015] 361 GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGATGCAACG CGAAGAACCT[0016] 421 TACCAGGGTT TGACATGATA CGAATTTCTT TGAAAGAAGG AAGTGCCTTT TGGAACGTAT[0017] 481 ACACAGGTGG TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA[0018] 541 ACGAGCGCAA CCCTCATTTT TAGTTGCCTT TTGGAACTCT AAAAAGACTG CCGGTTATAA[0019] 601 ACCGGAGGAA GGCGGGGATG ACGTCAAGTC AGCATGCCCC TTACACCCTG GGCTACACAC[0020] 661 GTGCTACAAT GGGCGAGACA ATGAGACGCA AATCTGCGAA GACAAGCTAA TCTATAAACT[0021] 721 CGCTCTAAGT TCGGATTGCA GGCTGCAACT CGCCTGCATG AAGTTGGAAT CGCTAGTAAT[0022] 781 CGCTGGTCAG CTATACAGCG GTGAATTCGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA[0023] 841 CCATGGAAGC TGGTTATGCC CGAAGTCGTT ACTCTAACCG CTTGGAGGAG GACGCCTAAG[0024] 901 GTAGAATTAG TGACTAGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTAACC GTACTGGAAG GTGCGGTTGG[0025] 961 ATCACCTCCT TTTAAAATTA TAAAATTTTA AAATTAACGG TCGATAAATA CTAAATAGAA[0026] 1021 ACGGGCTATT AGCTCAGTTG GTTAGAGCGC ACCCCTGATA AGGGTGAGGT CTCTGGTTCA[0027] 1081 AATCCAGAAT GGCCCAA

[0028] 所述同源重组序列II如下所示，由trnA的3’部分和rnl(核糖体RNA大亚基基因，编码23s核糖体RNA大亚基)的5’部分组成的，其中同源重组序列II的第1～196bp是trnA基因的3’部分，第197～1483bp是rnl的5’部分；

[0029] 1 CGGGGGTATA GCTCAGTTGG TTAGAGCGCA CCCCTGATAA GGGTGAGGTC TCTGGTTCAA[0030] 61 ATCCAGAATG GCCCAACGGG GGTATAGCTC AGTTGGTAGA GCACCGCCTT TGCACGGCGG[0031] 121 TTGTCAGCGG TTCGAATCCG CTTACCTCCA CATGAAAAAT TTTAACATTT TTTAATCATA[0032] 181 AGATTAAATA AGTCTTAAAT TCAAGGAATT AAGAGTTTAT GGGGGATACC TTGGCATTCA[0033] 241 GAAGCGATGA AGGACGTGGT TACCGACGAA ACGCTTCGGG GAGCTGGAAA CAAGCTATGA[0034] 301 TCCGGAGATC TCCGAATGAG GAAACTCTAA TACTACTTAT TGAATACATA AATAAGAAAG[0035] 361 AGCGAACCTA GGGAACTGAA ACATCTTAGT ACCTAGAGGA AAAGAAAGTA AAAACGATTC[0036] 421 CCTTAGTAGC GGCGAGCGAA ATGGGAACAG CCTAAACTTA ATTTTAAGGG TAGCGGGACA[0037] 481 ATTATTAATG ATTAAATGTG ACAATTAGAC GAACTTAGAT GGAATGCTAA ACCAAAGAGA[0038] 541 GTGATAGTCT CGTAGTCGAA AATTGAAACA ATCAAATTGT ATCCCAAGTA GCATGGAGCA[0039] 601 CGTGAAATTC CGTGTGAATC AGCGAGGACC ACCTCGTAAG GCTAAATATT CCTGAATGAC[0040] 661 CGATAGTGAA ATAGTACCGT GAGGGAAAGG TGAAAAGAAC CCCGGGAGGG GAGTGAAAAG[0041] 721 AACATGAAAC CATAAACTTA CAACCAGTAG GAGGACGACT AAAACGTCTG ACTGCGTGCC[0042] 781 TGTTGAAGAA TGAGCCGGCG ACTTATAAGT AGTGGCAGGT TAAGGTAGAG AATACCGGAG[0043] 841 CCATAGTGAA AGCGAGCCTG AATAGGGCGT TTGTCACTGG TTATAGACCC GAACCCGGAT[0044] 901 GATCTAACCA TGGCCAGGTT GAAGCTTAGG TAATACTAAG TGGAGGACCG AACCGACTGA[0045] 961 TGTTGAAAAA TCAGCGGATG AGTTGTGGTT AGGGGTGAAA TGCCAATCGA ATTCGGAGCT[0046] 1021 AGCTGGTTCT CCCCGAAATG CGTTTAGGCG CAGCGATGAA TGTTATAGCT TAGGGGTAAA[0047] 1081 GCACTGTTAC GTATGCGGGC TGGTAATTCG GTACCAAATC GTTGCAAACT AAGAATACTA[0048] 1141 AGTGTACAGT TCATCAGTGA GACTGTGGGG GATAAGCTCC ATTGTCAAGA GGGAAACAGC[0049] 1201 CCAGAGCACC AGTTAAGGCC CCTAAATAAT TGCTAAGTGA TAAAGGAGGT GGGAGTGCAT[0050] 1261 AGACAATCAG GAGGTTTGCT TAGAAGCAGC AATCCTTTAA AGAGTGCGTA ATAGCTCACT[0051] 1321 GATCGAGTAA ACCTGCGCCG AAAATGTACG GGACTAAGTA ATTTGCCGAA ACTGTGCGAT[0052] 1381 ATATAAAATA TATCGGTAGG GGAGCGTTCT GTTGTAGGTT GAAGTATTAG CGGAAGCGGA[0053] 1441 TATGGACGAA GCAGAAGTGA GAATGTCGGC TTGAGTAACG AAA

[0054] 所述海洋微藻叶绿体表达载体还包含抗性筛选表达盒或荧光蛋白表达盒；

[0055] 所述的表达盒是指含有启动子、基因和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列；

[0056] 所述的目的基因表达盒由启动子、目的基因和终止子组成；

[0057] 所述目的基因表达盒的启动子优选为CaMV 35S启动子；

[0058] 所述目的基因表达盒的终止子优选为NOS终止子；

[0059] 所述的抗性筛选表达盒由启动子、抗性筛选标记基因和终止子组成；

[0060] 所述抗性筛选表达盒的抗性筛选标记基因优选为氯霉素抗性基因；

[0061] 所述的荧光蛋白表达盒由启动子、荧光蛋白基因和终止子组成；

[0062] 所述荧光蛋白基因优选为绿色荧光蛋白基因；

[0063] 所述海洋微藻叶绿体表达载体应用于在海洋微藻中表达外源蛋白；

[0064] 所述的应用，包含以下步骤：通过基因转移技术将海洋微藻叶绿体表达载体转入海洋微藻中，然后筛选得到目的基因表达的海洋微藻；

[0065] 所述的海洋微藻优选为三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)；

[0066] 所述基因转移技术优选为电击法(或称为电穿孔法)；

[0067] 所述电击法包含以下步骤：

[0068] (1)用培养基为f/2培养基(无Si)培养三角褐指藻，温度为21±1℃，光照强度为4000lx，光暗比为12h∶12h；

[0069] (2)离心收集1.0×107～108个三角褐指藻细胞，3000rpm离心10min；

[0070] (3)加150μl 1.0mol/L NaCl悬浮三角褐指藻细胞；

[0071] (4)加150ul 0.1mol/L甘露醇，混匀，冰上放置30min；

[0072] (5)将步骤(4)制备的藻细胞液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400μl为宜，同时加质粒pPtc-GFP(0.4μg)混匀；

[0073] (6)将电激杯放置好，调电穿孔仪(美国BIO-RAD公司MicroPulserTM电穿孔仪)电容至10F，电阻为400，电压为1.5kv，进行电击；

[0074] (7)将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗处理2h，再正常培养24h(12L∶12D)；

[0075] 所述筛选的方式优选为通过抗性筛选或通过荧光蛋白筛选。

[0076] 本发明的原理：本发明采用海洋微藻的叶绿体基因组中的反向重复区(IR)内的trnI序列及trnA序列作为同源重组片段，两段序列位于叶绿体基因组反向重复区，具有2个拷贝，可以增加外源基因的整合效率，提高外源基因的表达水平。

[0077] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0078] (1)本发明的同源重组序列使得通过电击法即可将表达载体导入海洋微藻叶绿体基因组中，方便了载体导入叶绿体基因组的途径并大大降低了转化成本，为实现利用海洋微藻叶绿体为生物反应器生产高附加值产品提供了技术支撑。

[0079] (2)本发明首次采用非叶绿体来源的原核生物的启动子和终止子来调控外源基因的表达，使外源基因在海洋微藻叶绿体中获得高效表达。

[0080] (3)本发明能成功得到叶绿体转基因微藻，叶绿体转基因微藻作为生物反应器能够生产重组疫苗、哺乳动物抗体、营养价值高的复合物及工业原料如β-胡萝卜素、多不饱和脂肪酸、氢气或生物燃料等，这预示着本发明将为生产以上高附加值产品提供了有效保障。

附图说明

[0081] 图1是重组质粒ptrnI的结构图。

[0082] 图2是重组质粒ptrnI-trnA的结构图。

[0083] 图3是重组质粒ptrnI-trnA-cat的结构图。

[0084] 图4是重组质粒pPtc-GFP的结构图。

[0085] 图5是观察成功转化重组质粒pPtc-GFP的三角褐指藻叶的荧光图，其中：

[0086] A是阳性三角褐指藻细胞经488nm激发光激发后观察到的GFP绿色荧光图；

[0087] B是阳性三角褐指藻细胞经543nm激发光激发后观察到的叶绿体自发的红色荧光图；

[0088] C是激光共聚焦显微镜明场下观察到的阳性三角褐指藻细胞图；

[0089] D是A、B、C、三幅图的叠加效果图。

[0090] 图6是对图5的GFP荧光进行的平均荧光强度分析图。

具体实施方式

[0091] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0092] 实施例1

[0093] (1)设计引物：

[0094] 同源重组序列I的上游和下游引物分别是P1和P2

[0095] P1：5’-CGAGCTCACTGGGCGTAAAGCGTCTGT-3’

[0096] SacI

[0097] P2：5’-GGGGTACCTTGGGCCATTCTGGATTTG-3’

[0098] KpnI

[0099] 同源重组序列II的上游和下游引物分别是P3和P4

[0100] P3：5’

[0101] -ACGCGTCGACAACTGCAGCGGGGGTATAGCTCAGTTGG-3’

[0102] SalI

[0103] P4：5’

[0104] -AACTGCAGACATGCATGCTTTCGTTACTCAAGCCGACATT-3’

[0105] PstI

[0106] (2)PCR扩增：以三角褐指藻基因组DNA为模板，其中三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)购自武汉水生所，三角褐指藻基因组DNA的提取过程按照大连宝生物公司的Universal GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书进行操作。

[0107] 同源重组序列I的反应体系如下：

[0108] 基因组DNA 2ul

[0109] dNTP Mixture 3.2μl

[0110] 10×PCR Buffer(含Mg2+) 4μl

[0111] trnI上游引物P1 0.8μl

[0112] trnI下游引物P2 0.8μl

[0113] Takara LA Taq 0.4μl

[0114] ddH2O 28.8μl

[0115] Total 40μl

[0116] 同源重组序列II的反应体系如下：

[0117] 基因组DNA 2.0μl

[0118] dNTP Mixture 3.2μl

[0119] 10×PCR Buffer(含Mg2+) 4.0μl

[0120] trnA上游引物P3 0.8μl

[0121] trnA下游引物P4 0.8μl

[0122] Takara LA Taq 0.4μl

[0123] ddH2O 28.8μl

[0124] Total 40μl

[0125] 同源重组序列I和同源重组序列II PCR反应条件为：反应条件为：94℃4min；94℃50s，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。

[0126] (3)克隆：

[0127] A、将步骤(2)得到的同源重组序列I PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收1100bp片段，进行TA克隆，使用大连宝生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行回收，回收片段与pMD19-T进行连接，连接体系根据大连宝生物公司的pMD19-T载体使用说明书进行，其中使用DH5α感受态细胞(购自广州鼎国生物有限公司)，整个TA克隆过程根据DH5α感受态细胞使用说明书进行)；挑选阳性克隆，得到TA-trnI重组质粒。再用SacI和KpnI同时双酶切TA-trnI重组质粒和环状载体pMD19-T(T购自大连宝生物公司)，所有限制性内切酶及所需的酶切Buffer均购自大连宝生物公司，TA-trnI重组质粒酶切体系：TA-trnI 10μl，SacI 7μl，KpnI 7μl，1×L Buffer 2.5μl，ddH2O 1μl，共
25μl；载体pMD19-T的酶切体系：49μl，SacI 2.5μl，KpnI 2.5μl，1×M Buffer 6μl，共60μl；酶切时间为11.5h；回收trnI片段和线性的pMD19-T载体，通过T4DNA连接酶(T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司，其中连接体系和时间根据说明书进行)；将trnI连入载体pMD19-T中，得到含有trnI的重组质粒ptrnI(如图1所示)。

[0128] B、将步骤(2)得到的同源重组序列II PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收1500bp的片段，进行TA克隆，使用大连宝生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行回收，回收片段与pMD19-T进行连接的体系根据大连宝生物公司的pMD19-T载体使用说明书进行，其中使用DH5α感受态细胞(购自广州鼎国生物有限公司)，整个TA克隆过程根据DH5α感受态细胞使用说明书进行)；挑选阳性克隆，得到TA-trnA重组质粒。再用SalI和PstI进行双酶切，所有限制性内切酶及所需的酶切Buffer均购自大连宝生物公司；TA-trnA重组质粒酶切体系：TA-trnA 19μl，SalI 4.0μl，PstI 4.0μl，1×H Buffer 3.0μl，ddH2O 4.0μl，共30μl；重组质粒ptrnI的酶切体系：22μl，SalI
7.0μl，PstI 7.0μl，1×H Buffer 4.0μl，共40μl；酶切时间为11.5h；同时双酶切TA-trnA重组质粒和步骤A制备的重组质粒ptrnI，回收trnA片段和线性的ptrnI载体，通过T4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)，其中连接体系和时间根据说明书进行)将trnA连入载体ptrnI中，得到重组质粒ptrnI-trnA(如图2所示)。

[0129] C、以质粒pLysS(含有质粒pLysS的BL21(DE3)菌株购自上海今迈生物科技有限公司，使用广州东盛公司的DsbioDW01-1质粒小量提试剂盒提取质粒pLysS，提取过程根据说明进行)为模板PCR扩增氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因以及该基因前面约260bp长度的启动子和后面约150bp长度的终止子，氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达盒的上游和下游引物分别是P5和P6：

[0130] P5：5’-CGGGATCCCGGGATCCAGCATCACCCGACGCACT-3’

[0131] BamHI

[0132] P6：5’-GCTCTAGAGCTCTAGATAACGACCCTGCCCTGAAC-3’

[0133] XbaI

[0134] PCR反应体系如下：

[0135] 质粒pLysS 2μl

[0136] dNTP Mixture 3.2μl

[0137] 10×PCR Buffer(含Mg2+) 4μl

[0138] CAT表达盒上游引物P5 0.8μl

[0139] CAT表达盒下游引物P6 0.8μl

[0140] Takara LA Taq 0.4μl

[0141] ddH2O 28.8μl

[0142] Total 40μl

[0143] 反应条件为：94℃4min；94℃50s，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。

[0144] PCR产物经电泳、回收后进行TA克隆，使用大连宝生物公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行回收，回收片段与pMD19-T进行连接的体系根据大连宝生物公司的pMD19-T载体使用说明书进行，其中使用DH5α感受态细胞(购自广州鼎国生物有限公司)，整个TA克隆过程根据DH5α感受态细胞使用说明书进行，挑选阳性克隆，得到TA-CAT重组质粒；用BamHI和XbaI同时双酶切TA-CAT重组质粒和载体ptrnI-trnA，回收CAT片段和线性的ptrnI-trnA载体，通过T4DNA连接酶将trnA连入载体ptrnI-trnA中，得到重组质粒ptrnI-trnA-CAT(如图3所示)。

[0145] D、以质粒pBI121-GFP，质粒pBI121为模板PCR扩增GFP基因以及该基因前面830bp长度的CaMV 35S启动子和该基因后面带有的250bp长度的NOS终止子，其中质粒pBI121-GFP通过如下步骤得到：含有GFP基因的质粒pGEM(购自广州瑞真生物技术有限公司)，以质粒pGEM为模板，设计了PCR引物上游和下游引物分别为P7和P8：

[0146] P7：5’-GCTCTAGAGGATCCCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3’[0147] P8：5’-AGTGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATTGAGCTCC-3’

[0148] PCR的反应体系如下：

[0149] 质粒pGEM 2μl

[0150] dNTP Mixture 3.2μl

[0151] 10×PCR Buffer(含Mg2+) 4μl

[0152] GFP上游引物P9 0.8μl

[0153] GFP下游引物P10 0.8μl

[0154] Takara LA Taq 0.4μl

[0155] ddH2O 28.8μl

[0156] Total 40μl

[0157] 反应条件为：94℃4min；94℃50s，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。

[0158] PCR出来GFP，以XbaI和SacI双酶切PCR产物和pBI121质粒(购自金维克(中国)生物技术中心)，再将GFP片段和pBI121载体连接，这样就把GUS替换成了GFP，得到了质粒pBI121-GFP。

[0159] GFP表达盒的上游和下游引物分别为P9和P10：

[0160] P9：5，

[0161] -GGACTAGT CTCGAGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3’

[0162] SpeI NotI XhoI

[0163] P10：5’-ACGCGTCGACCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3’

[0164] SalI

[0165] PCR的反应体系如下：

[0166] 质粒pBI121-GFP 2μl

[0167] dNTP Mixture 3.2μl2+

[0168] 10×PCR Buffer(含Mg ) 4μl

[0169] GFP表达盒上游引物P9 0.8μl

[0170] GFP表达盒下游引物P10 0.8μl

[0171] Takara LA Taq 0.4μl

[0172] ddH2O 28.8μl

[0173] Total 40μl

[0174] 反应条件为：94℃4min；94℃50s，60℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。

[0175] PCR产物经电泳、回收后进行TA克隆，同上，挑选阳性克隆，得到含有GFP表达盒的TA-GFP重组质粒。用SalI和SpeI双酶切TA-GFP重组质粒，回收GFP表达盒片段，用SalI和XbaI双酶切载体ptrnI-trnA-cat，通过T4DNA连接酶将GFP表达盒连入载体ptrnI-trnA-cat中，得到重组质粒pPtc-GFP。

[0176] (4)转化：利用电击法将转化载体pPtc-GFP导入三角褐指藻叶绿体基因组中，具体实施方式如下：用培养基为f/2培养基(无Si)培养三角褐指藻，温度为21±1℃，光照强度为40001x，光暗比为12h∶12h的人工智能气候培养箱中；7 8

[0177] ①离心收集1.0×10 ～10 个三角褐指藻细胞，3000rpm离心10min。

[0178] ②加150μl 1.0mol/LNaCl悬浮三角褐指藻细胞。

[0179] ③加150μl 0.1mol/L甘露醇，混匀，冰上放置30min。

[0180] ④将步骤③制备的藻细胞液转移到0.4cm电激杯内，电激杯内藻液以不超过400μl为宜，同时加质粒pPtc-GFP(0.4μg)混匀。

[0181] ⑤将电激杯放置好，调电穿孔仪(美国BIO-RAD公司MicroPulserTM电穿孔仪)电容至10F，电阻为400，电压为1.5kv，进行电击。

[0182] ⑥将电击后的藻液转移到50ml三角瓶中，加新鲜的f/2培养基10ml，暗处理2h，再正常培养24h(12L∶12D)。

[0183] (5)筛选：电击法将载体pPtc-GFP导入三角褐指藻叶绿体基因组后，在平板上进行氯霉素抗性筛选，具体实施方式：设置氯霉素筛选浓度为400μg/ml，固体培养基中除氯霉素外，还加了氨苄和卡那抗生素以纯化藻株，氨苄和卡那抗生素的最终浓度为100μg/ml，将电击后培养24h的全部藻液1000rpm离心5min，用f/2培养基悬浮藻细胞，涂板培养，设一个对照和两个实验组。

[0184] 经过7～10天的抗性筛选后，在固体培养基上长出肉眼可见的藻苔，挑取藻苔置于液体的f/2培养基中扩大培养，液体培养基中也加入相同浓度的氯霉素、氨苄和卡那，经过10～15天的扩大培养后，取20μl左右藻液制成玻片，通过激光共聚焦显微镜观察是否有荧光发出。经过氯霉素抗性筛选后长出藻苔，图5为叶绿体基因转化GFP报告基因的confocal图(共聚焦图)，报告基因的表达水平很高(如图5a所示)，且定位于叶绿体内表达，与叶绿体的红色自发荧光(如图5b所示)完全共定位(如图5d所示)，图5c是激光共聚焦显微镜明场下观察到的阳性三角褐指藻细胞，图5说明报告基因成功表达，利用三角褐指藻叶绿体作为生物反应器的方法被成功建立。

[0185] 图6是对图5上的GFP荧光进行的平均荧光强度(Meanfluorescence intensity)分析，利用AxioVision Rel.4.7(Zeiss，Germany)软件进行，从图中可以看出成功转化了GFP的藻细胞的Meanfluorescence intensity都很高，平均每个转基因藻细胞的值为100.41，没有转GFP的三角褐指藻的值仅为20.37，从图中可以看出成功转化了GFP的藻细胞的Mean fluorescence intensity都很高，说明外源基因在海洋微藻叶绿体中获得高效表达(Grey是指荧光转成黑白时的灰度，也就是荧光强度)。

[0186] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。