酞酰亚胺衍生物在治疗疾病中的应用

摘要

本发明涉及具有一氧化氮供体属性的酞酰亚胺和/或磺酰胺衍生物的应用，其在提高γ-珠蛋白基因表露和抗炎和镇痛方面具有重要的活性，能有效的治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的血液系统疾病。更具体地说，本发明介绍这种酞酰亚胺和/或磺酰胺衍生物的治疗镰状细胞疾病的应用。本发明还具有一个新特性-披露利用分子杂化技术，合理的设计原型酞利度胺和羟基脲而开发出新官能酞酰亚胺衍生物，以治疗上述疾病。本发明更公开一种特定磺胺类衍生物的新颖制法，可用于制备药物用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病。

权利要求

1.一种通式(I)化合物或其任何药理上可接受盐的应用，其特征在于制备用于治疗镰状细胞疾病、发炎病症的药物或一种镇痛药剂：式中

W为H；

R对应C1-C7烷基、3-苄基、4-苄基、4-乙苄基；

-

R′对应O-NO2。

2.根据权利要求1所述的应用，其中化合物如式(IA)所示：

3.根据权利要求1所述的应用，其中化合物如式(IB)所示：

4.根据权利要求1所述的应用，其中化合物如式(IC)所示：

5.根据权利要求1所述的应用，其中化合物如式(ID)所示：

6.根据权利要求1所述的应用，其中化合物如式(IE)所示：

7.一种式(IIA)化合物或其任何药理上可接受盐的应用，其特征在于制备用于治疗镰状细胞疾病、发炎病症的药物或一种镇痛药剂：

8.一种用于治疗镰状细胞疾病或发炎病症或者作为一种镇痛药剂的药剂组合物，其特征在于含有根据权利要求1至7中任一项所述化合物或其任何的组合，并承载于药学上可接受的载体上。

9.一种获得化合物(IIA)的方法：其特征在于包括以下步骤：

a)在一个合适的容器中，混合羟胺盐酸盐、碳酸氢钠和水；

b)在步骤a所得混合物中加入乙醇；

c)在步骤b所得混合物中加入4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯磺酰氯。

10.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤a)所释放二氧化碳消除后，才进行步骤b)的乙醇添加。

11.根据权利要求9及10任一项所述的方法，其中在步骤c)后，溶剂蒸发，并以热二氯甲烷洗涤所得产物。

12.化合物(IC)：

13.化合物(IE)：

说明书

酞酰亚胺衍生物在治疗疾病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及利用具有一氧化氮供体属性的″酞酰亚胺″(邻苯二甲酰亚胺PHTHALIMIDE)衍生物，其在提高γ-珠蛋白基因表现、抗炎和镇痛作用具有重要的活性，有效地治疗需要降低″肿瘤坏死因子″(TNF：Tumor Necrosis Factor)-α浓度与一氧化氮外生源有关的血液系统疾病。更具体地说，本发明涉及使用这种酞酰亚胺衍生物在治疗″镰状细胞″(sickle-cell)疾病中的应用。

背景技术

[0002] 已知镰状细胞病是最常见的遗传性血液疾病，其特点是β-珠蛋白基因内的一个点突变，更具体而言，β-珠蛋白基因第六位密码子的一个单核苷酸改变(GTG变到GAG)，s导致β-珠蛋白链的变种(β-球蛋白)表面上的缬氨酸(valine)取代谷氨酸(SAFO，M.K等，医药化学期刊，47卷，4665-4676页，2004年(SAFO，M.K et al J.Med.Chem.v.47，pp.4665-4676，2004))。

[0003] 以缬氨酸替代谷氨酸对于血红蛋白的三维结构有重大影响。谷氨酸带负电，而缬氨酸是一种中性氨基酸，从而逼近血红蛋白分子，因此，脱氧化而聚合。在镰状细胞″血红蛋白″(hemoglobin：Hb S)脱氧构象中，存在于链上的缬氨酸会和包含来自邻近的血红蛋白S分子的疏水性氨基酸的小组织进行疏水相互作用，这在″血红素″(hemoglobin)氧合状态是不可能的，由于疏水小组织在这种情况下是无法进得去的(ADACHI，K等，医药化学期刊，263卷，n.12，5607-5610页，1988年(ADACHI，K.et al.J.Biol.Chem.v.263，n.12，pp.5607-5610，1988))。

[0004] 这些相互作用导致脱氧血红蛋白在代谢活性组织内典型的毛细血管床情况-低氧气压力下聚合(AVILA，C.M等氏，生物有机医药化学，14卷，6874-6885页，2006年(AVILA，CM.et al.Bioorg.Med.Chem.v.14，pp.6874-6885，2006))。

[0005] 血红蛋白Hb S的聚合是血管闭塞核心过程-镰状细胞病的特点(BUNN，H.F.，英格兰医学期刊，337卷，762-769页，1997年(BUNN，H.F.N Engl J Med v.337，pp.762-769，1997)；KAUL D.K等，血液综论，10卷，29～44页，1996年(KAUL D.K.et al Blood Rev.v.lO，pp.29-4，1996))；(a)FERRONE F.A.等，分子生物学期刊，183卷，591-610页，1985年(FERRONE，F.A.et al.J.Mol.Biol.v.183，pp.591-610，1985))，(b)FERRONE F.A等，分子生物学期刊，183卷，611-631页，1985年(FERRONE，F.et al.J.MoI.Biol，v.183，pp.611-631，
1985)；SAMUEL，R.E.等，血液，82卷，pp.3474-3481页，1993年(SAMUEL，R.E.，et al.Blood，v.82，pp.3474-3481，1993))。

[0006] 由于血红蛋白细胞内的聚合，且由于氧化-除氧周期，含有血红蛋白的细胞就有镰刀的形状。

[0007] 该红血细胞的镰状化与膜的可逆变化相关。重复镰状化/去镰状化周期，在膜功能的异常行为和结构日益突出，最终在膜中被固定成镰刀形状(LEE，G.R等，Manole期刊，I卷，1998年，1161-1163页(LEE，G.R.et al.Vol.I Manole，1998，pp.1161-1163))。

[0008] 该镰刀红细胞对血管内皮、单核细胞和巨噬细胞呈正常粘着性(DUITS，A.J等，临床免疫病理学，81卷，96-98页，1996年(DUITS，A.J.et al.Clin Immunol Immunopathol v.81，pp.96-98，1996)；OKPALA，I.等，欧 洲血 液 学期 刊，69卷，135-144页，2002 年(OKPALA，I.et al J.Eur.J.Haematol.v.69，pp.135-144，2002))。

[0009] 变形镰刀细胞赋予镰刀形血液的属性，但不是得自不可逆的镰刀形细胞，也许是因为僵化的细胞不能和内皮细胞形成多个表面接触。这一事实表示和疼痛病危期的频率和严重程度有强烈的正相关。毛细血管的动荡区是主要的粘着位置。

[0010] 血管阻塞主要导致镰状细胞病的临床情况，引发疼痛病危和器官衰竭。因为镰刀细胞被困，因此血管闭塞性危机在小静脉微循环开始出现。血管阻塞至关重要的主要活动包括红血细胞(网织红细胞及变形致密细胞)粘附于微静脉内皮细胞。这种粘附导致异形细胞(白血细胞和镰刀细胞)的聚集，这也促成阻塞，导致局部缺氧，增加血红蛋白Hb S聚合物的形成和邻近血管阻塞的传播。中性粒细胞通过内皮细胞间隙汇合处，将增加微血管炎症(OKPALA，I.等，欧洲血液学期刊，69卷，135-144页，2002年(OKPALA，I.etal Eur.J.Haematol，v.69，pp.135-144，2002)：OKPALA，I.等，血液综论，18卷，65～73页，2004年(OKPALA，I.Blood Rev.v.18，pp.65-73，2004))。

[0011] 镰状红细胞群重复阻塞微循环的血管，导致痛苦的血管闭塞危机。由于微循环血管堵塞，5％至10％的儿童或青年镰刀细胞病患显示中风症状情境，由于重要脑动脉狭窄或动脉瘤样扩张，造成渗出或出血。

[0012] 据报导，胎儿血红蛋白增加，有利于患者的镰状细胞病，提高其存活率和减少疼痛发作(CHARACHE，S等，血液，79卷，2555至2565页，1992年(CHARACHE，S.et al Blood，v.79，pp.2555-2565，1992))。

[0013] 最近有报导，镰状细胞病患者表现出显著增加细胞因子(包括肿瘤坏死因子-α)的循环浓度( I.等，文献Acta Haematol，90卷，172-176页，1993年( I.et al Acta Haematol，v.90，pp.172-176，1993)；FRANCIS，R.Jr.，
等，国家医学协会期刊，84卷，611-615页，1992年(FRANCIS，R.Jr.，et al J.Natl.Med.Assoc，v.84：611-615，1992)；BUCHANAN等，血 液 学，35-47页，2004 年 (BUCHANAN et al Hematology，pp.35-47，2004))，及增加其对直接关系到不同炎症起源病状的表露(MAKHATADZE，N.，人类免疫学期刊，59卷，571-579页，1998年(MAKHATADZE，N.J.Hum.Immunol，v.59，pp.571-579，1998))。

[0014] 肿瘤坏死因子(TNF)-α具有亲炎作用，增加化学趋性，由于粘附分子的增加，而使中性粒细胞能粘附在血管内皮细胞，又刺激自由基产生和其它炎症介质(如IL-1和PGE2)的合成。肿瘤坏死因子-α也诱导凝血和抗凝血性能的变化，并增加一些急性药剂的肝内合成。此外，它是感染性综合征候及内毒素休克的重要调解剂，能够在脂肪组织中抑制脂蛋白脂肪酶和脂肪合成酶的生物合成，削弱在脂肪细胞上储存脂肪。

[0015] 肿瘤坏死因子TNF-α有能力改变血管内皮细胞的抗凝性能和对内皮细胞表面诱导亲凝血活性，刺激生产的″血小板活化因子″(platelet-activating factor：PAF)，并增加白血球粘附到血管内皮细胞，结果增加血液流动的阻力，使流通困难，因而加剧微血管淤滞和血红蛋白Hb S的脱氧。

[0016] 因此，在镰状细胞病患血液中增加对肿瘤坏死因子-α浓度，可能加重血管闭塞危机，并导致传染病发生和炎症发作( I等，文献Acta Haematol，90卷，172-176页，1993年( I.et al.Acta Haematol，v.90，pp.172-176，1993))。

[0017] 事实上，Malavé等( I.等，文献Acta Haematol，90卷，172-176页，1993年( I.et al Acta Haematol，v.90，pp.172-176，1993))报告有趣的胎
儿血红蛋白(Hb F)百分率和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的血清浓度呈负相关。这些作者发现，具有较高的血浆中TNF-α患者表现出血红蛋白Hb F浓度相应减少。虽然考虑到血红蛋白Hb F有一个有利的影响，其可改善组织氧合，但减少血红蛋白Hb S的聚合，这样的逆相关性会增加中风的风险，同时加深镰状细胞疾病的相关症状。此外，肿瘤坏死因子TNF-α在周围痛觉过敏扮演重大的角色，其抑制已经与慢性和急性疼痛的减轻有相关连，这可对″酞利度胺″(thalidomide)的镇痛效果做出解释，该酞利度胺系在药物疗法最早介绍的抗TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的药物(RIBEIRO，R.A.等，欧洲药理学期刊，391卷，
97-103页，2000年(RJBEIRO，R.A.et al.Eur.J.Pharmacol.，v.391，pp.97-103，2000))。

[0018] 基于这些原因，抑制肿瘤坏死因子-α已作为防止与镰状细胞疾病有关的血管和发炎并发症的一种重要策略。

[0019] 已报告的各种物质有直接的抑制肿瘤坏死因子-α的药效。这些物质包括肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE)抑制剂，″中和抗体″(neutralizing
antibodies-infliximab)，以及与酞利度胺结构有关的药剂。

[0020] 许多实验室和研究小组已报告酞利度胺的抗炎和免疫调节性能，表明其对下列病变的治疗潜力：例如多发性骨髓瘤、精神萎顿、肺结核及关节炎等(MIYACHI，H.等，生物有机医药化学，5卷，n11，2095-2102页，1997年(MIYACHI，H.et al Bioorg.Med.Chem.v.5，n.11，pp.2095-2102，1997))。

[0021] 在这方面，发展新颖的酞利度胺类似物，其中包含主要抑制肿瘤坏死因子的药效活性，且不含致畸胎性亲毒物基团，如此可发展新的治疗方法以对付血浆中肿瘤坏死因子浓度增加有关或恶化的病症(例如镰状细胞疾病)，而实现独特的目标。

[0022] 不过，至今仍没有镰状细胞病的具体疗法。治疗这种遗传疾病基于使用能尽量减少或对抗镰状细胞疾病的症状的药物。在市场上可购得的有益对症治疗药物包括去铁胺 抗肺炎球菌疫苗、预防性青霉素、叶酸(每日剂量)和羟基脲(Hydroxyurea )。

[0023] 羟基脲(Hydroxyurea：HU)是一个已知合成核苷酸还原酶的抑制剂，该酶是核苷酸变成脱氧核苷酸的转化酶，其可干扰DNA(脱氧核糖核酸)的合成，从而限制DNA的合成(YARBRO，J.M，肿瘤学研讨会，19卷，1～10页，1992年(YARBRO，J.M.Semin.Oncol，v.19，pp.1-10，1992)；HANFT，V.N.等，血液，95卷，n.11，3589-3593页，2000年(HANFT，V.N.et al Blood，v.95，n.11，3589-3593，2000))。

[0024] 虽然羟基脲是美国食品与药物管理局(FDA)批准的治疗镰状细胞病主要药物，但它须长期使用而产生各种不利影响，其中有许多是由于它会阻断细胞在S和G1阶段的周期(BUCHANAN，G.R.等，血液学，35-47页，2004年(BUCHANAN，G.R.et al Hematology pp.35-47，2004)；STUART，M.J.及NAGEL，R.L等，柳叶刀，364卷，1343～1360页，2004年(STUART，MJ.and NAGEL，RX.Lancet，v.364，pp.1343-1360，2004))，其中描述它可作为细胞抑制剂和抗肿瘤剂。

[0025] 最近的研究表明用羟基脲(HU)治疗，可降低与镰状细胞病相关的死亡率40％。羟基脲治疗效益的基础是提高胎儿血红蛋白(Hb F)的浓度，此基因明显的血红蛋白能够抑制脱氧镰状细胞血红蛋白(Hb S)的聚合和防止或阻碍与此有关的病理所发生的症状。
(STEINBERG，M.H.等，JAMA，289卷，1645-1651页，2003年(STEINBERG，M.H.et al.JAMA，v.289，pp.1645-1651，2003)；CHARACHE，S等，医学，75卷，300-326页，1996年(CHARACHE，S.et al，Medicine v.75，pp.300-326，1996))。

[0026] 除了抑制核苷酸还原酶，羟基脲还发挥自身的行动机制，作为一氧化氮(NO)的供体药物，一种维持正常的血液流量和压力的重要调节剂。据了解，羟基脲可和氧-和脱氧-血红蛋白发生反应形成高铁血红蛋白，然后与另一个羟基脲分子发生反应，从而形成铁亚硝基血红蛋白(HbNO)。亚硝基血红蛋白的形成涉及多方面的羟胺基团的反应，以形成一氧化氮(COKIC，V.P.等，血液，108卷，n1，184-191页，2006年(COKJC，V.P.et al.Blood，v.108，n.1.pp.184-191，2006))。

[0027] 以一氧化氮(NO)治疗镰状细胞病的效益是基于其通过可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)途径，可刺激生产胎儿血红蛋白(Hb F)的能力。鸟苷酸环化酶sGC的活化可增加γ-珠蛋白在红白血病细胞和基本的人类红细胞的表露。sGC的抑制可防止这种增加，这表明sGC途径可调控γ-球蛋白的表露，因此，调控胎儿血红蛋白(Hb F)的合成。研究工作已经证明这一假说，显示羟基脲活化sGC，也诱导和mRNAγ-球蛋白的表露，提高胎儿血红蛋白(Hb F)在红白血病细胞K562细胞和人类干细胞中的浓度(CONRAN，N.等，英国血液病学期刊，124卷，547-554页，2004年(CONRAN，N.et al.Br.J.Haematol，v.124，pp.547-554.2004))。

[0028] 这些结果表明，利用一氧化氮诱导血红蛋白sGC的活化，而可支持以一氧化氮治疗镰状细胞疾病患者的策略。

[0029] 此外，一氧化氮有血管扩张作用，这有利于病理生理学聚集疗效和治疗镰状细胞疾病。(KING，S.B，自由基生物医学37卷，n6，737-744页，2004年(KING，S.B.Free Rad.Biol.Med.v.37，n 6，pp.737-744，2004))。

发明内容

[0030] 本发明涉及酞酰亚胺衍生物和磺胺类衍生物在制备非传统的药物以治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子浓度，且需要外部来源的一氧化氮的疾病的新颖应用。此处所述的发明披露一种需要减少TNF-α肿瘤坏死因子浓度且需要外部来源的一氧化氮的相关疾病药物治疗的主要限制的解决方案，并提供非传统的途径以减少常用化合物的副作用和不良反应。

[0031] 本发明还提供两种新的酞酰亚胺衍生物，用于制备以治疗前述疾病所需的药物；以及一种特定磺胺类衍生物的新工艺以获取治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮所用的药物。在一个更具体的内涵中，本发明克服传统上用于治疗镰状细胞疾病的药物治疗的主要限制和并发症的相关问题，从而改善镰状细胞疾病患者的生活质量。

[0032] 本发明提供非传统的方法用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病。

[0033] 在本发明的一个方面，治疗镰状细胞病通常采用的药物治疗的主要限制和并发症的是可以克服或尽量减少，其方法是使用一氧化氮供体和能调节TNF-α的酞酰亚胺和磺胺类衍生物，从而改善镰状细胞疾病患者的生活质量。

[0034] 本发明是有关通式(I)化合物或其任何药理上可接受的盐在制备用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮疾病的药物的应用：

[0035]

[0036] 式中

[0037] W为氢、卤素、二氧化氮、氨基、羟基、C1-C6烃氧基、C1-C6卤烃氧基、C1-C6卤烷基；

[0038] R对应C1-C7烷基、2-苯基、3-苯基、4-苯基、2-芐基、3-芐基、4-芐基、2-乙芐基、3-乙芐基、4-乙芐基、芐基、噻吩、呋喃、吡咯、2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶、吡嗪、嘧啶、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、萘、CH2-2-噻吩、CH2-3-噻吩、CH2-2-呋喃、CH2-3-呋喃、CH3CH2-2-噻吩、CH3CH2-3-噻吩、CH3CH2-2-呋喃、CH3CH2-3-呋喃；

[0039] R′为O-NO2-或SO2NHOH或呋喃噁烷基。

[0040] 本发明还涉及利用通式(II)化合物或其任何药理上可接受的盐在制备用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮疾病的药物：

[0041] W-R1-SO2NHR2 (II)

[0042] 式中

[0043] W为氢、卤素、二氧化氮、氨基、羟基、C1-C6烃氧基、C1-C6卤烃氧基、C1-C6卤烷基；

[0044] R1对应2-苯基、3-苯基、4-苯基、2-芐基、3-芐基、4-芐基、2-乙芐基、3-乙芐基、4-乙芐基、芐基、噻吩、呋喃、吡咯、2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶、吡嗪、嘧啶、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、萘、CH2-2-噻吩、CH2-3-噻吩、CH2-2-呋喃、CH2-3-呋喃、CH3CH2-2-噻吩、CH3CH2-3-噻吩、CH3CH2-2-呋喃、CH3CH2-3-呋喃；

[0045] R2为OH、H、C(＝O)NHOH、C(＝S)NHOH、C(＝O)NOH(C6H5)。

[0046] 本发明还涉及到治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮疾病的医药组合物，其中包含式I及/或式II化合物或其和药学上可接受的载体的组合物。

[0047] 本发明还提供化合物IIA的制法：

[0048]

[0049] 包括下列步骤：

[0050] a)在合适的容器中混合羟胺盐酸盐、碳酸氢钠和水，

[0051] b)在步骤a)所得混合物中加入乙醇，

[0052] c)在步骤b)所得混合物中加入4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯磺酰氯。

[0053] 本发明还涉及到化合物(IC)：

[0054]

[0055] 以及化合物(IE)

[0056]

附图说明

[0057] 图1-腹腔注射衍生物(300μmol/公斤)对辣椒素诱导小鼠耳肿胀的抑制效果试验。数值表示5只动物的均值和标准差(采用学生T-检验，在95％信赖水平下，*p＜0.05被认为是重要的)。

[0058] 图2-口服衍生物(300μmol/公斤)，对3％巯乙酸盐水溶液诱导小鼠腹膜炎的效果试验。数值表示4只动物的均值和标准差(采用学生T-检验，在95％信赖水平下，*p＜0.05被认为是重要的)。

[0059] 图3-不在血红素存在下，在不同浓度化合物IE存在下，γ-珠蛋白mRNA在24小时、48小时、72小时和96小时的表露。

[0060] 图4-化合物IIA在5μM(μmol浓度)、30μM、60μM及100μM，但不在血红素存在下，于24小时、48小时、72小时和96小时的剂量反应曲线。

[0061] 图5-所设计的化合物的细胞存活率。

[0062] 图6-间接途径(亚硝酸盐)的一氧化氮加药。

具体实施方式

[0063] 目前，还没有治疗基因来源的血液系统疾病的具体方法，但在市场上针对征候治疗的药物，其可改善这些疾病患者的生活质量。

[0064] 本发明具有主要新的特征，即提供功能化酞酰亚胺和/或磺胺类衍生物在制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的应用。本发明还具有一个新特征，即披露由原型酞利度胺和羟基脲利用分子杂化技术合理设计出新官能化酞酰亚胺衍生物以治疗上述疾病。本发明还包括另一个新特征，即制备特定磺胺类衍生物的新方法，其可用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外源的一氧化氮的疾病的所需药物。

[0065] 从商业上可用的化合物通过几个合成步骤的方法，可得良好至极佳化学产率的新衍生物，如此这种方法有资格工业化。

[0066] 本发明涉及通式(I)化合物或其任何药学上可接受的盐于制备用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物的应用；优选为所述通式(I)化合物用来制备治疗镰状细胞疾病的药物：

[0067]

[0068] 式中

[0069] W为氢、卤素、二氧化氮、氨基、羟基、C1-C6烃氧基、C1-C6卤烃氧基、C1-C6卤烷基；

[0070] R对应C1-C7烷基、2-苯基、3-苯基、4-苯基、2-芐基、3-芐基、4-芐基、2-乙芐基、3-乙芐基、4-乙芐基、芐基、噻吩、呋喃、吡咯、2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶、吡嗪、嘧啶、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、萘、CH2-2-噻吩、CH2-3-噻吩、CH2-2-呋喃、CH2-3-呋喃、CH3CH2-2-噻吩、CH3CH2-3-噻吩、CH3CH2-2-呋喃、CH3CH2-3-呋喃；

[0071] R′对应O-NO2-或SO2NHOH或呋喃噁烷。

[0072] 在本发明优选的具体实施方式中，由指定的化合物(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)甲基硝酸盐用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(IA)：

[0073]

[0074] 而且优选是用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0075] 在本发明另一优选的具体实施方式中，由指定的化合物2-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)乙基硝酸盐用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(IB)：

[0076]

[0077] 而且优选是用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0078] 在本发明又一优选的具体实施方式中，由指定的化合物3-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苄基硝酸盐用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(IC)：

[0079]

[0080] 而且优选是用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0081] 在本发明又一优选的具体实施方式中，由指定的化合物4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苄基硝酸盐用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(ID)：

[0082]

[0083] 而且优选是用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0084] 在本发明又一优选的具体实施方式中，由指定的化合物2-[4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯]乙基硝酸盐用于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(IE)：

[0085]

[0086] 而且优选是用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0087] 本发明还涉及到通式(II)化合物或其任何药学上可接受的盐于制备用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物的应用：

[0088] W-R1-SO2NHR2 (II)

[0089] 式中

[0090] W为氢、卤素、二氧化氮、氨基、羟基、C1-C6烃氧基、C1-C6卤烃氧基、C1-C6卤烷基；

[0091] R1对应2-苯基、3-苯基、4-苯基、2-芐基、3-芐基、4-芐基、2-乙芐基、3-乙芐基、4-乙芐基、芐基、噻吩、呋喃、吡咯、2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶、吡嗪、嘧啶、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、喹啉、异喹啉、萘、CH2-2-噻吩、CH2-3-噻吩、CH2-2-呋喃、CH2-3-呋喃、CH3CH2-2-噻吩、CH3CH2-3-噻吩、CH3CH2-2-呋喃、CH3CH2-3-呋喃；

[0092] R2为OH、H、C(＝O)NHOH、C(＝S)NHOH、C(＝O)NOH(C6H5)。

[0093] 优选为使用前面描述的通式化合物用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0094] 在本发明一优选的具体实施方式中，以指定的4-氨基-N-羟苯磺酰胺制备用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物。该化合物具结构式(IIA)：

[0095]

[0096] 并优选为用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0097] 本发明还提供用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮疾病的医药组合物，其中含有化合物I及/或II或其组合物。本发明的组合物包括通式I和/或II化合物或药学上可接受的盐类，配合药学上可接受的赋形剂。

[0098] 本发明的医药组合物可依照各种剂型服用，如口服的锭片、胶囊、糖或覆膜锭片，液态溶液或悬浮液；直肠栓剂；肠外用剂，即用于肌内注射，灌输或静脉点滴及/或脊髓膜内注射及/或椎管内注射的针剂。

[0099] 本发明的医药组合物通常按照常规方法制备，并以合适的剂型服用。

[0100] 固体口服剂型可含有，连同活性成分，不同的稀释剂：如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它合适的稀释剂；润滑剂：如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙及/或聚乙二醇或其它药学上可接受的润滑剂；粘合剂：如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮，或其它合适的粘合剂；崩解剂：如淀粉、褐藻酸、藻酸盐或淀粉或乙醇酸钠，或其它合适的崩解剂；泡沫混合物；染料；含糖材料；润湿剂，如凝集素、聚山梨醇酯、硫酸月桂酯；和，一般用于医药制剂的无毒药理惰性物质。医药组合物的制备可依照已知的方法进行，如混合、造粒、压成锭片、糖衣覆盖、薄膜涂层工艺或其它合适的工艺。

[0101] 口服用液体分散液可包括，例如，糖浆、乳液和悬浮液。糖浆可含有载体，例如，蔗糖或蔗糖掺配甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇或其它药学上可接受的载体。悬浮液和乳液可含有载体，例如，天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇或其它合适的载体。

[0102] 肌内注射用悬浮液或溶液可包含，连同活性化合物，药学上可接受的载体，即无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇类(如聚乙二醇)或其它药学上可接受的载体，而且如果需要的话，适量的盐酸″利多卡因″(lidocaine)。静脉注射或输液用溶液可含有载体，例如，无菌水(或优选为，呈无菌盐的形式)，或等渗水溶液，或可含有作为载体的丙二醇或其它药学上可接受的载体。

[0103] 栓剂可含有，连同活性化合物，药学上可接受的载体，如可可脂、聚乙二醇、山梨醣聚氧乙烯、脂肪酸酯表面活性剂、卵磷脂，或其它药学上合适的载体。

[0104] 本发明还涉及到获得式(IIA)化合物：4-氨基-N-羟苯磺酰胺的新方法：

[0105]

[0106] 通过以下的步骤：

[0107] a)在合适的容器中混合羟胺盐酸盐、碳酸氢钠和水，

[0108] b)在步骤a)所得混合物中加入乙醇，

[0109] c)在步骤b)所得混合物中加入4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯磺酰氯。

[0110] 在本发明的优选具体实施方式中，4-氨基-N-羟苯磺酰胺的合成包含在10毫升圆底烧瓶中，加入21.6毫克羟胺盐酸盐(0.31毫摩尔)、26.1毫克碳酸氢钠(0.31毫摩尔)和0.1毫升蒸馏水。当二氧化碳停止逸出，添加2毫升乙醇。接下来加入100毫克4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯磺酰氯(0.31毫摩尔)。采用薄层层析(TLC)(洗提液：100％二氯甲烷)观察该反应，直到显示反应终止。反应45分钟后，减压下蒸发溶剂，用热的二氯甲烷清洗所得产物，以便不移除没有反应的4-(1，3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯磺酰氯，而得大约82毫克(80％)的4-氨基-N-羟苯磺酰胺，为白色粉末，具有熔点范围高于275℃(C14H8ClNO4S；PM＝318.306)。采用所述方法获得的化合物(4-氨基-N-羟苯磺酰胺)用于治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病。优选为，采用所得到的化合物(4-氨基-N-羟苯磺酰胺)用于制备治疗镰状细胞疾病的药物。

[0111] 本发明还涉及到一个新的酞酰亚胺衍生物：3-(1-3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)芐基硝酸盐，如下式所示(IC)：

[0112]

[0113] 和如前面所述于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物的应用。

[0114] 本发明还涉及到另一酞酰亚胺衍生物：2-[4-(1-3-二氧代-1，3-二氢-2H-异吲哚-2-基)苯]乙基硝酸盐，如下面通式(IE)所示：

[0115]

[0116] 和如前面所述于制备治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的药物的应用。

[0117] 本发明所描述的化合物经多方面测试，以确保具有所欲治疗需要减少TNF-α肿瘤坏死因子的浓度，及需要外部来源的一氧化氮的疾病的活性。特别是，这些化合物接受检验，以确保他们在治疗症状镰状细胞病作为辅助剂的活性。进行的试验和取得的成果说明如下。

[0118] 致突变(诱导有机体突变)活性测试

[0119] 首先，将这些化合物进行AMES试验评价，以鉴定可能的致突变性。这个测试对于获取具有较低遗传毒性轮廓的化合物很重要，还指导获得更安全的化合物的分子改变。使前面描述的化合物通式IA、IB、IC、ID、IE、及IIA进行这些试验，并将结果记载于下列表01、02和03。

[0120] 表01：在和不在化合物IA的代谢活化(S9)下，评估鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA102菌株的致突变性

[0121]

[0122] *细胞死亡

[0123] 表02：在和不在化合物IB、IC及IIA的代谢活化(S9)下，评估鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA102菌株的致突变性

[0124]

[0125] *细胞死亡

[0126] 表03：在和不在化合物ID及IE的代谢活化(S9)下，评估鼠伤寒沙门氏菌TA100和TA102菌株的致突变性

[0127]

[0128] *细胞死亡

[0129] 化合物IA对TA100菌株而言，无代谢活化(112nmol/培养板)条件下，致突变比率(RM)为2.45；而对TA102菌株而言，有代谢活化条件下(56nmol/培养板)，致突变比率(RM)为2.34。对TA102菌株(+S9)而言，在浓度高于56nmol，可以观察到毒性，同时减少每培养板″回复突变体″(revertant)的数量(表01)。化合物IA是一种烷基衍生物，具有反应性亚甲基碳，即由于更具负电α基团而移除的电子密度，使得该碳原子具有部分的正电荷。亚甲基的存在促进碳被生质亲核剂攻击，导致硝酸盐的消除，它容易分解成一个自由基物种，而对原核生物DNA产生许多不利的影响，该DNA没有像真核生物那样具有有效的修复系统。此外，还有可能出现生质亲核剂加入亚甲基碳，导致形成共价加成物，不可逆转地改变了该生质亲核剂原有的结构。

[0130] 化合物IB在代谢活化存在下，所有测试浓度及下列致突变比率(MR)的条件下，显示TA100菌株有致突变性：(MR)：0.01μmol(3.4)、0.021μmol(3.22)、0.042μmol(3.8)、0.085μmol(3.8)及0.17μmol(2.5)(见表02)。其中所测试烷基系列，具有最高的MR。当化合物IB和化合物IA比较，可以清楚地看到后者对亚甲基碳的攻击具有较低的障碍，可促进生质亲核剂的进入。化合物IA的障碍较大是由于在α位置存在庞大的基团。这可以解释化合物IB的较高致突变性，使我们能够预测亚甲基化合物比亚乙基化合物致突变性会减少。利用化合物的ID和IE的测试结果，更好分析这个假设。

[0131] 化合物IC虽然不在代谢活化下测试TA100菌株，并在浓度为3.58μmol/培养板，它显示致突变比1.8，即有致突变性迹象(表01)，但在使用浓度没有显示致突变性。当化合物IA和化合物IC相比，可以观察到后者-内亚苯衍生物-具有较低的致突变性，因为信号只有在3.58μmol/培养板才出现，而化合物IA致突变在112μmol/培养板，MR为2.45(TA100；-S9)。此外，当化合物IC和化合物IB比较，可以观察到内亚苯衍生物具较低的致突变性。这些数据表明，芳基衍生物，也就是那些有一个芳香环键合于酞酰亚胺基团者(化合物IC、ID、IE及IIA)，致突变性低于烷基衍生物，也就是那些有烷基链直接键合于酞酰亚胺基团者(化合物IA和IB)；支持这一假设，即空间位阻因素阻碍生质亲核剂接触调节合成衍生物的致突变性的反应性位置。

[0132] 化合物IA是磺胺类衍生物，和所有其它化合物一样，不具备硝酸基团。文献报导羟胺衍生物或异羟肟酸衍生物显示致突变性，主要是由于从这个基团产出的主要发毒性(ZHU，X.等，诱变性简述Mut.Res.，425卷，153-167页，1999年(ZHU，X.et al.Mut.Res.v.425，pp.153-167，1999))。在很长一段时间已指出，羟胺基团为在硝基还原时产生一主要代谢产物，负责硝基化合物(如氯霉素、甲硝唑、和硝基呋喃)的致突变性。不过，已经发现，他们是在还原前所形成的自由基物种，该还原步骤会产生突变产物，而不是羟胺衍生物本身(TOCHER，J.H.，通用药物学(Gen.Pharma)，28卷，n 4，485-487页，1997年(TOCHER，J.H.Gen.Pharmac.v.28，n.4.pp.485-487，1997))。

[0133] 因此，评估含羟胺基团的化合物IIA，以便核查在所合成化合物的该基团的发毒性。此衍生物随后再与酞酐反应而获得酞酰亚胺衍生物。

[0134] 在TA100菌株浓度为15.7μmol/培养板及有代谢活化的条件下，化合物IIA的致突变比为2.74。上述15.7μmol/培养板，每个细胞毒性的回复突变体数量上有减少。化合物IIA的可能致突变性只发生在有代谢活化的条件下，从这种化合物可以形成自由基和/或氧化衍生物。在比较用于测试的化合物IIA浓度与芳基衍生物(化合物IC、ID和IE)，可以看出虽然有致突变作用，但观察到化合物IIA只在比化合物IE(0.12μmol/培养板)高达125倍(摩尔数)以上的高浓度，才有致突变作用。

[0135] 在TA100菌株中，化合物ID在代谢活化存在及在浓度3.58μmol/培养板的条件下，显示致突变比(MR)2.03；而在缺乏代谢活化下，在相同的浓度，它显示MR值1.94的致突变性迹象。在浓度为1.8μmol/培养板，但无S9的情况下，在TA100菌株中，它显示MR值1.87的致突变性迹象(见表03)。化合物ID为化合物IC的部位异构体，和化合物IC比较起来，我们观察到化合物ID具更高的致突变性和/或致突变性信号的离散轮廓。

[0136] 在TA100菌株中及代谢活化存在下，化合物IE(一种化合物IB的内亚苯衍生物)，及化合物IB均在0.12、0.25、0.5、1及2μmol/培养板浓度下，显示MR(致突变比)值分别为2.8；3.7；4.86；5.72及5.79(见表03)。虽然化合物IE的MR值高于化合物IB，但后者是在一个较低的摩尔浓度。化合物IE需要更高浓度以显示致突变性，在结构上来看，已经发现的化合物IA和IC之间：苯基键接在酞酰亚胺基团可降低化合物的致突变性。

[0137] 当比较均在对位被取代的化合物IE和化合物ID时，我们也可以确认化合物IA和IB之间，即和甲基相比，乙基间距较大而增加致突变性。如前所述，这个因素可能是相关的，除了电子因素，主要是空间位阻因素，由于亲核试剂较易亲近硝酸盐基团的α-碳。

[0138] 当所得到的化合物与酞利度胺和羟基脲模式相较，我们观察到在实施例中AMES试验的敏感度。虽然观察到所合成化合物的结构规划模式表明较高致突变性，但仍不能定论，并需要更多的测试来验证这样的声明。此外，酞利度胺，羟基脲和所合成化合物的结构不同，而且，由于这种化学的特殊性，可以显示不同致突变形象。

[0139] 从AMES试验取得一串结果，我们可以推断：烷基衍生物(化合物IA和IB)比芳基衍生物(化合物IIA、IC和ID)，如回复突变体的平均数目/培养板所表露的，表现出较高的致突变性；

[0140] 亚乙基衍生物间距比亚甲基化合物大，故表现出较高的致突变作用；

[0141] 这套的结果使我们得出这样的结论：芐基间距更适合获得较低的致突变性的化合物。

[0142] 此外，即使是致突变剂，致突变比MR 2被认为是比较低的，因为如果用药物疗法，如甲硝唑，其在TA 100菌株中及无代谢活化存在下，以58.4μmol/培养板浓度测试时，MR有14.9。(SILVA，A.T.A.等，Mini Rev.Med.Chem.，5卷，.893-914页，2005年(SILVA，A.T.A.et al.Mini Rev.Med.Chem.，v.5，pp.893-914，2005))。这使我们得出结论，尽管化合物有致突变性的迹象，它仍是太低，这些结果可能无法反映在真核细胞中。

[0143] 辣椒素诱导小鼠耳肿胀法

[0144] 此法的特点是耳朵的急性炎症浮肿反应，它是为了评估所合成化合物的抗炎活性。

[0145] 在此试验中，100μmol/公斤吲哚美辛消炎剂是作为对照标准，而首先评估腹腔注射300μmol/公斤的酞酰亚胺衍生物。从表4可以发现，化合物IC和IE显示出耳肿胀抑制率大于64％。在所作的试验中，化合物IC呈约64.09％的抑制率。但是考虑到标准错误，和吲哚美辛消炎剂相比，其它化合物显示类似的活性(见图1)。这些结果表明，所合成的化合物显示在急性期抗炎活性，可能是由于细胞因子TNFα的抑制，因为如众所周知，酞酰亚胺衍生物有这个活性。

[0146] 表4-腹腔注射辣椒素引起耳肿胀试验

[0147]

[0148] *动物比对照组具有较高的值

[0149] 腹膜炎检测6

[0150] 在第二次检测中，测定总白血球数目(10/毫升)，以评估他们抑制炎症渗透进展的能力。考虑到标准差，所有具有类似活性轮廓的酞酰亚胺衍生物显示抑制白细胞渗透的活性(图2，表5)。这些结果表明这些化合物的抗炎潜力。

[0151] 表5-检测结果的腹膜炎

[0152]

[0153] #该动物在流血

[0154] ·P＜0.05(学生的T检验)

[0155] 醋酸引起的腹部蠕动

[0156] 为了评估化合物的周边镇痛活性，进行醋酸引起的腹部蠕动研究(表6)。在这个实验中，我们可以推断，化合物ID有重要的镇痛活性，抑制66％腹部蠕动。其它化合物，如IA、IIA、和IE，也有显著抑制醋酸引起的腹部蠕动，表明这些化合物的镇痛潜力。镇痛活性可能与这些化合物抑制TNFα细胞因子能力有关，因为这将是解释已知的分子(例如酞利度胺)具有镇痛效果的机制之一。

[0157] 表6-醋酸引起的腹部蠕动试验

[0158]

[0159] 评估在K562细胞培养基中的PCR引起的γ-珠蛋白增加

[0160] 从评估在K562红白血病细胞培养基中化合物诱导的基因表露，并通过实时PCR技术的结果，我们可以获得如下结论：

[0161] 在此模型中化合物IE有活性，在或不在氯化血红素存在下，有越来越多的γ-球蛋白基因表露；

[0162] 和空白对照比较起来，化合物IE在氯化血红素存在下并没有显示出比不在氯化血红素存在时具有明显更高的活性(图3)；

[0163] 显然，化合物IE在低浓度(5μmol～30μmol)对γ-珠蛋白的表露有效果；

[0164] 化合物IE在或不在氯化血红素存在下，表现出较高百分率的细胞活性(高于90％)，显示出在使用的浓度下无毒性作用；

[0165] 对γ-珠蛋白的表露而言，化合物IIA比空白对照具有较高的活性(图4)。

[0166] 化合物IIA诱导γ-球蛋白表露的增加高于化合物IE，表明化合物IIA对于增加γ-球蛋白的基因表露更有效。

[0167] 比较在文献资料中化合物IIA和羟基脲，发现化合物IIA在48个小时内5μM显示活性，而10μM羟基脲在同一时间也产生类似的活性。

[0168] 在0小时细胞存活率为97％，并到完成检测时均维持在这一模式，表明没有化合物IIA的毒性(图5)。

[0169] 用于药理实验的方法：

[0170] 致突变活性评估步骤(AMES试验)

[0171] MARON，D.M.及AMES，B.N首先开发该步骤(MARON，D.M.及AMES，B.N，致突变性研究、.113卷，173-215页，1983年(MARON，D.M.and AMES，B.N.Mut.Res.v.113，pp.173-215，1983))。

[0172] 用于检测的菌株：

[0173] 有许多转基因鼠伤寒沙门氏菌株用于检测流行的突变类型，其中包括：TA97、TA98、TA100和TA102菌株。以TA100和TA102菌株检测会造成基本成双替换的突变，而TA98及TA 97菌株可探测DNA阅读框架中缺口的变化(MARON & AMES，1983)。

[0174] 这个试验使用致突变性实验室(“Faculdade de-UNESP Araraquara”)的鼠伤寒沙门氏菌-TA100和TA102菌株。这些菌株具有以下特点：
(AMES，1983)

[0175] 1-具有组氨酸的营养缺陷；

[0176] 2-有各种不同的组氨酸操纵子的突变，这些是扭转突变的目标；

[0177] 3-检测许多致突变剂，其会造成DNA阅读框转变，可恢复正确的阅读框，供组氨酸合成；

[0178] 4-在hisG基因的阅读框中hisG46基因突变，它编码第一酶供组氨酸的合成-特定的TA100；

[0179] 5-基因hisD3052突变，该基因由8个重复-GC-残基构成，接近hisD基因阅读框移位突变位点，其可编码特定TA 98-组氨醇脱氢酶；

[0180] 6-突变(rfa)，这将导致脂多醣屏障的部分损失，增加细胞壁的渗透，促进大分子扩散进入细胞；

[0181] 7-突变(urvB)，其切除将导致修复系统的损害，造成不同致突变剂检测灵敏度提高。它也导致细菌成为依赖生物素生长；

[0182] 8-原核质体pKM101-其增强对氨芐青霉素的抗性，也通过刺激容易出错的DNA修复系统，增加自发的和化学致突变性。

[0183] 菌株的维护和储存

[0184] 存放鼠伤寒沙门氏菌株烧瓶冻结于-80℃冰箱，在瓶内有0.9毫升培养基和0.1毫升作为抗冻剂的二甲基亚砜，以维持所有的遗传特征不变。

[0185] 冻结之前，确认所有菌株的基因类型(组氨酸营养缺陷型、rfa突变型、pKM101质粒型、uvrb删除型、及自发的回归率)。

[0186] 培养基介质和溶液的制备

[0187] 沃格尔-邦纳介质E(Vogel-Bonner medium：VB)

[0188] 在45℃于16.75毫升的蒸馏水中，溶解0.25克硫酸镁、2.5克柠檬酸、12.5克磷酸氢二钾，4.375克磷酸铵和钠(足够形成25毫升VB溶液)。在121℃压热釜中将溶液消毒15分钟。

[0189] 40％葡萄糖

[0190] 制备50毫升40％葡萄糖溶液，在121℃压热釜中消毒15分钟。

[0191] 最低糖基化的琼脂(GMA)

[0192] 在465毫升的蒸馏水中，溶解7.5克琼脂，随后在121℃压热釜中消毒15分钟。接着加入10毫升的VB和25毫升40％葡萄糖的无菌层流。

[0193] 顶层琼脂

[0194] 在100毫升的蒸馏水中溶解0.5克氯化钠和0.6g琼脂。在121℃压热釜中消毒所得溶液15分钟。

[0195] 0.05mM(毫摩尔浓度)生物素/组氨酸溶液(10毫升/100毫升的顶层琼脂)：在10毫升蒸馏水中溶解0.00123克生物素和0.00096克组氨酸。在121℃压热釜中消毒所得溶液15分钟。

[0196] 琼脂糖营养肉汤n.2.

[0197] 于30毫升蒸馏水中溶解0.75克琼脂糖培养基。在121℃压热釜中消毒所得溶液15分钟。

[0198] 阳性和阴性对照

[0199] 阴性对照为用于溶解样品的溶剂，用量为标准量，测试样品最高量为100微升，这也是溶解最高使用浓度的药物所需要的量。

[0200] 阳性对照是指每种菌株在测试条件下的致突变性化合物，其中就TA100和TA102菌株而言，不在代谢活化存在下，阳性对照为25微升/培养板的叠氮化钠(1.25微克/培养板)和100μl的丝裂霉素(0.5微克/培养板)。对具有代谢活化的检测而言，TA100菌株的阳性对照为50微升的2-窦胺(2-antramine)(1.25微克/培养板)，而TA102菌株则为50微升的2-胺芴(1.25微克/培养板)。

[0201] 无代谢活化系统的检测过程(-S9)

[0202] 采用预孵育法

[0203] 第1天

[0204] 制备先前描述的所有的溶液和培养基。在无菌材料(GMA)中以层流方式加入10毫升VB和25毫升40％葡萄糖溶液(预先制备的)，其次是搅拌均化，以及将约25毫升的GMA分发到每个培养板中。

[0205] 将分发到每个培养板中GMA在37℃炉中放置48小时，才作后续使用。

[0206] 第2天

[0207] 在层流状态下，鼠伤寒沙门氏菌(TA100和TA102)菌株以铂环分别单独接种各自9 9
的营养汤汁，并维持在37℃，不断搅拌(160转/分钟)14小时，以达到密度为1x10 至2x10细菌/毫升。

[0208] 第3天

[0209] 不同浓度的化合物分别加入100微升0.2M(摩尔浓度)pH值7.4磷酸盐缓冲液(或500微升代谢活化的混合物S9)，并在37℃孵育20-30分钟。含化合物的溶液以二甲基亚砜为溶剂。此后，添加2毫升顶层琼脂，辅以痕量组氨酸和生物素，搅拌均化及在最低糖基化介质中涂覆(plated)。顶层琼脂固化后，使培养板在37℃孵育48小时。然后，计数每培养板回复突变体菌落的数目。所有测试浓度的阳性和阴性对照试验均作三次。

[0210] 第5天

[0211] 48小时后，手动计数回复突变体菌落，而阳性对照为下列系统：protoCOL菌落计数器版本3.15.630(1998-2001年)SYNBIOSIS有限公司系统。

[0212] 评价和解释结果

[0213] 最后从实验获得的数据进行分析，所用软件为统计软件“Salanal”(沙门氏菌检测分析)版本1.0，三角研究所，RTP，美国北卡罗莱纳州。这种软件允许利用变异数分析(ANOVA测试F)评估剂量反应效果；测量在不同的测试浓度(剂量)的回复突变体的数目和阴性对照加以计算，随后用线性回归分析。分析数据所选用的软件模型是伯恩斯坦氏模型(Bernstein，L等，致突变性研究97卷，267-281页，1982年(BERNSTEIN，L.et al.Mutat.Res.v.97，p.267-281，1982))。该软件也提供剂量反应曲线的线型部分的直线斜率，其对应着分析样品中每测量单位引起的回复突变体的数目。

[0214] 从结果的数据，并以下列方程式计算每种化合物的各种分析剂量的致突变比(MR)：

[0215] MR＝每次测试皿回复突变体的平均数(自发+诱导的回复突变体)/阴性对照每次测试皿回复突变体的平均数(自发的回复突变体)。

[0216] 自发性的成长就是说在培养板回复突变体的数目，无论有或没有诱发，只要数值高于或等于2就被认为是一个积极的响应(VALENT，G.V.等，环境毒理学-水质，8卷，371-381页，1993年(VALENT，G.V.et al.Env.Toxicol.Water Quality，v.8，p.371-381，
1993))。

[0217] 具有代谢活化系统的检测步骤(+S9)

[0218] 代谢活化系统的致突变性测试系利用SD大鼠肝均化所得S9微粒部份(S9配制剂)，预先用阿罗克尔(Aroclor)1254处理，并以冻干形式进行测试。

[0219] 使用以下表7所示溶液制备50毫升S9配制剂：

[0220] 表7-用于制备S9配制剂的溶液

[0221]无菌水 19.75毫升
磷酸盐缓冲液0.2M(摩尔浓度) 25毫升
NADP 0.1M(摩尔浓度) 2毫升(冷冻室)
G-6-P 1M(摩尔浓度) 250微升(电冰箱)
MgCl 氯化镁0.4M(摩尔浓度) 500微升(电冰箱)
KCl氯化钾 1.65M(摩尔浓度) 500微升
S9部份 溶解于2毫升无菌水(miliQ)

[0222] 此检测的步骤是相同的，但是，而不用缓冲液，而添加500微升S9混合物。

[0223] S9混合物在冰上具有4小时的适用期。然后在37℃培养板中培养48小时。在规定时间已过后，计数回复突变体菌落。所有测试浓度、阳性和阴性对照试验均运行三次。

[0224] 检测K562细胞培养基的步骤

[0225] 采用人类白血病细胞株K562 ATCC(美国型培养基收藏)，费城，宾夕法尼亚州，美国。这些细胞在DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium：美国Invitrogen公司出品的贝科改良的伊格尔介质)培养液中进行培养，含10％胎牛血清和谷酰胺。将细胞保5
持在5％二氧化碳气氛及37℃。对于这些实验，培养细胞密度为1×10 细胞/毫升。为和血红素(30μmol浓度)一起培养，在开始实验所需化合物前72小时，添加血红素。

[0226] 在移除未处理K562细胞0小时的时间-从这一时间点，添加各自的化合物所需的浓度(5、30、60和100μmol浓度)，在培养基中维持这些细胞7天，并没有添加任何新的化合物或替代培养基。在下列时间收集细胞：0、24、48、72和96小时。在这些时间点利用细胞离心机上″莱什曼″(Leishman)染色幻灯片分析细胞的形态，并在″诺伊贝格尔室″(Neuberger’s chamber)内以锥虫蓝染色进行细胞存活率分析。

[0227] RNA核糖核酸萃取

[0228] 采用制造商的指示，以TRIzol试剂(Gibco-BRL公司，马里兰州，盖瑟斯堡)，以便从K562获得RNA。使含有K562和TRIzol试剂样品在室温下孵育5分钟，以获得完全分离的核酸蛋白质复合物，加入200微升氯仿(三氯甲烷)，彻底搅拌，并于室温再次进行培养5分钟。在4℃温度下，在19,000克离心15分钟，将所获得上层清液存储在另一试管，立即着手以500微升冷异丙醇使其沉淀。搅拌均化后，在室温下进行新的培养10分钟，其次是在4℃于19,000克离心10分钟。倒掉上层清液，在沉淀中加入800微升70％冷乙醇。又在
4℃于14,000克离心5分钟。最后，倒掉上层清液和在室温下放置RNA沉淀10分钟以便干燥，然后再悬浮于含有焦碳酸二乙酯(DEPC)的无菌水中，并在55℃培养10分钟，随后放在冰上使RNA全部增溶化。

[0229] 利用电泳在1.2％变性琼脂糖凝胶上检查样品完整性。具有适量RNA的样品显示完整核糖体的子单元：18S及28S。电泳后，将RNA样品存放在-80℃冷冻。

[0230] 互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成

[0231] 利用上标III RTTM套件方法(Invitrogen公司，生命技术)，将所获得的RNA样品进行互补DNA(cDNA)的合成。在分光光度计(基因奎特-法玛西亚公司，美国)阅读后，加以定量，取3克RNA用酶DNase I(Invitrogen公司，生命科技)处理，去除污染的DNA。加入1.0微升1单位/微升的DNase I，1.0微升10x酶DNase I反应缓冲液(200毫摩尔浓度Tris-HCl，20毫摩尔浓度氯化镁，500毫摩尔浓度KCl2)和足够的水，使得最终反应体积为10.0微升。在室温进行反应15分钟，并加入1.0微升25毫摩尔浓度EDTA中止反应，且在65℃孵育10分钟。

[0232] 对于cDNA(互补脱氧核糖核酸)的合成，接着加入1.0微升50μM浓度寡核苷酸(dT)20和1.0微升10毫摩尔浓度dNTP。在65℃孵育样品5分钟，其次是在4℃1分钟。在每个样品中，添加10.0微升以下反应混合物：2微升10x RT缓冲液，4.0微升25毫摩尔浓度氯化镁，2.0微升0.1摩尔浓度DTT，1.0微升40个单位/微升核糖核酸酶OUTTM和1.0微升200个单位/微升上标III RTTM。在50℃进行反应50分钟，其次是在85℃进行5分钟。此后，在37℃加入1.0微升2单位/微升大肠杆菌核糖核酸酶H进行20分钟。

[0233] 互补DNA合成的验证

[0234] 利用β-肌动蛋白(BAC)基因扩增的PCR验证互补DNA的合成。利用5.0微升10xPCR缓冲液(20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，500毫摩尔浓度氯化钾)进行反应，1.5微升50毫摩尔浓度氯化镁，1.0微升10毫摩尔浓度dNTP，1.0微升10毫摩尔浓度BACF引物(5′-AAGAGATGGCCACGGCTGCT-3′)，1.0微升10毫摩尔浓度BACR引物(5′-TCGCTCCAACCGACTGCTGT-3′)，0.5微升Taq DNA聚合酶，1.0微升基因和39微升水，而最终体积为50微升。在94℃开始进行该方案2分钟，其次是进行35个循环：94℃/30秒～58℃/45秒～72℃/40秒，终止于72℃/7分钟。该产物在1％琼脂糖凝胶进行电泳来验证640pb的扩增。

[0235] 定量实时PCR反应的引物设计

[0236] 利用软件“引物快递”(应用生物系统公司)进行定量实时PCR反应的引物设计，并以灾变方案分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，验证结构(如发夹和二聚体)形成的条件。

[0237] 定量实时PCR的规范

[0238] 引物浓度

[0239] 用于定量实时PCR的引物最佳浓度，应足够低以便复制所有存在于样品的基因副本。使用相同数量的样品，在最后浓度为150nmol、300nmol、600nmol及900nmol进行每个引物(正，反义)的反应。在既定临界值测得荧光周期被称为临界周期或Tc。因为同样的样品量用于所有反应，临界周期Tc不应改变。如果增加引物浓度会导致Tc减少，则在这个反应中试剂量仍然不够。因此，所选最佳浓度系最低浓度，伴有较低的Tc。

[0240] 在定量实时PCR技术中用于基因扩增研究的每个引物的扩增片段顺序和长度列于表8。

[0241] 表8-扩增片段顺序和长度

[0242]

[0243] 用于研究基因的扩增及扩增效率的引物浓度列于表9。浓度的定义为在测试条件下产生扩增效率的浓度。

[0244] 表9-引物浓度

[0245]

[0246] 反应效率

[0247] 为了使实时PCR反应可靠、再现性好，需要有最佳反应条件，即在每一个周期扩增必须显示100％扩增效率，出现复制样品。扩增效率由公式10(-1/斜率)得到，其中斜率指曲线的斜率值。通过下列7个已知样品量，以对数尺度，利用最佳引物浓度作最适化：2ng(2x100)，6.32ng(2x100.5)，20ng(2x101)，63.2ng(2x101.5)，120ng，200ng(2x102) 及
632ng(2x102.5)。结果用来画出Tc对样品量的标准曲线。

[0248] 定量实时PCR

[0249] 在阅读分光光度计(基因奎特-法玛西亚公司，美国)和定量后，cDNA等分部份在定量实时PCR反应中用作范本。该技术包括在PCR反应中以光学监测荧光发射，利用特殊探针或染料结合于新合成的链。

[0250] 利用SYBER Green PCR主混合物 (应用生物系统公司)进行反应，始终运行一式两份，该主混合物除包含所有PCR所需的所有反应试剂(dNTP的氯化镁、缓冲液、TaqAmpli-金)，还包含SYBER Green染料-检测周期循环反应所需的双链插层剂。此外，采用分析基因的cDNA样品和特殊引物。

[0251] 荧光对循环次数图的实时扩增检测采用ABI 5700序列检测系统 仪器(应用生物系统公司)。越高的基因表露，即在开始反应时，有更多的副本，早期会出现扩增，因此，Tc较低。

[0252] 这些反应在含12.5微升SYBER Green PCR反应试剂主混合物 25ng cDNA样品及确定最佳引物浓度的混合物中进行，使得最终体积为25微升。在所有情况下，提出包含无菌水代替样品的阴性对照。这些反应准备用于包含塑料盖的96凹孔培养板(索伦森，生物科学公司)，可让光线的通过。该程序开始在95℃/10分钟，其次是45个循环：95℃/15秒～60℃/1分钟。在正常扩增结束时，温度从60℃逐渐升高至95℃，加上退化步骤。由PCR产生的产品会因温度上升而变性，SYBR绿色荧光信号会降低。如果有一个或多个PCR产物存在于每个反应，可核实由此产生的图形，由于扩增PCR产物熔融温度之间的差异，这种差异是由于每个产品的基材组成和数目所造成的。

[0253] 实时数据分析

[0254] 关注的基因表露以相对的方式确认，并以校准基因规格化，在这项研究中我们使用β-肌动蛋白和GAPDH作为校准基因，这些基因的表露有创制性，也就是说，在各种条件之间他们没有表现出什么变化。然而，一些研究已经证这些基因的表露会发生重大变化。从所获得Tc值，计算复制的Tc的算术平均。随后，利用公式Q＝EΔTc，求得(Q)表露量，其中E＝反应效率，ΔTc＝最低Tc(观察)-Tc(样品)。因此，表露即样品最高表露值(最低所测Tc)，相当于Q值＝1。每个样本的校准基因Q值均进行Gnorm方案，其计算相同值之间的几何平均数，其被称为样品正规化因子。在一定样品中关注的基因表露正规化是关注的样品基因Q值和样品正规化因子之间的正常量。所得到的数据是以任意单位表示或绝对表露值表示。

[0255] 醋酸引起的腹部蠕动

[0256] 止痛轮廓的评价，通过醋酸引起的小鼠腹部蠕动进行。此法试验对象为瑞士小白鼠，雌雄都用，重量从21至28克，禁食约8小时。口服测试物质，而且以5％阿拉伯树胶作为载体。1小时后，在动物的腹腔注入醋酸0.1N(0.1毫升/10克重量)。注射醋酸10分钟后，在20分钟内计数腹部蠕动。对照组为载体(阿拉伯树胶)，它并没有显示药理活性。

[0257] 辣椒素诱导的小鼠耳肿胀法

[0258] 此法是利用瑞士小鼠进行，雌雄都用，体重从18至30克。动物禁食8小时，但可自由喝水。这实验包括在局部施用(右耳)20微升辣椒素溶液(250微克/耳)，稀释于丙酮中，1小时腹腔注射(稀释于0.5％阿拉伯树胶)。左耳(对照)注入载体，其中辣椒素以丙酮稀释，而右耳注入辣椒素。此法的特点是耳朵产生急性炎症反应，形成浮肿。处死动物，割下它们的耳朵称重，以获取发炎指数。耳朵进行切片(8毫米直径)研究。其次，发炎耳朵的重量和对侧耳朵(对照耳)相比较，对照耳并没有用发炎治疗剂处理。浮肿抑制率是以测试物质治疗动物群的耳朵减去只用载体及辣椒素处理的动物群，然后除以刺激剂组和对照组之间的差异。其结果是减去1，再乘以100，列于表4。

[0259] 腹膜炎检测

[0260] 小鼠分别口服所分析的物质或载体，在口服后1小时，它们也同时由腹腔注射1毫升3％巯基乙醇酸盐溶液，作腹膜炎检测。注射1毫升3％巯基乙醇酸盐溶液4小时后，以32+ 2+
毫升″汉克斯溶液″(HANKS solution：平衡盐溶液，不含Ca 和Mg )冲洗腹膜腔。接下来，腹腔清洗进行分析和在″纽鲍尔室″(Newbauer′s chamber)用40倍物镜光学显微镜计算总白血细胞。结果列于表5。

[0261] 统计分析

[0262] 利用学生的T-检验求出实验组和对照的意义层面。当P*＜0.05时，这些值被认为是重要的。结果以平均值±标准误差表示，正如图例所显示。

[0263] 小鼠腹腔巨噬细胞的细胞毒测定

[0264] 该测定细胞活力(图5)，将腹腔巨噬细胞悬浮在RPMI溶液中，浓度设定为5x106细胞/毫升，其中96凹孔组织培养板的每个凹孔添加100微升，在37℃和5％的二氧化碳-4 -5 -6 -7 -8下，以10 、10 、10 、10 、10 毫摩尔浓度的药物和药物前体一起培养。以具有参考620nm滤光镜的紫外光/可见光分光光度计(微板仪，型号550-Biorad公司)在540nm读取吸光度。

[0265] 腹腔渗出细胞的获得和培养

[0266] 小鼠预先腹腔注射接种3.0毫升3％巯乙醇酸盐溶液，以刺激腹腔的巨噬细胞。经过3天的刺激，处死动物，并采集腹腔巨噬细胞。然后利用358克(离心机：芳纳-埃克塞尔萨II 206MP)在无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，离心5分钟，将细胞洗涤2至3次，然后悬6
浮于1毫升RPMI-1640以便在纽鲍尔室内计数。经过计算，浓度为5x10 细胞/毫升，而这些细胞分配于一次性(用后即丢弃的)无菌96凹孔培养板。于是将含有适当浓度细胞的
96凹孔培养板送到37℃烘箱培养24小时，箱中含有95％的水分和5％的二氧化碳，并存在-8 -7 -6 -5 -4
着消炎药和牛磺酸衍生物，各自的浓度为：10 、10 、10 、10 和10 毫摩尔浓度，或甚至只于RPMI-1640培养基的存在下。脂多醣(LPS)被用作阳性对照，而RPMI-1640培养基作为细胞对照。孵育期后，收集在培养基上层清液，以确定其一氧化氮含量。于全过程中，在所用RPMI-1640中补充2mM(毫摩尔浓度)L-谷酰胺，青霉素(100单位/毫升)、链霉素(100-2
单位/毫升)、5％牛胎儿血清和2-巯基乙醇5x10 摩尔浓度(RPMI-1640-C)。

[0267] 一氧化氮剂量

[0268] 由巨噬细胞培养基获得上层清液后，如上所述评估一氧化氮的浓度。这个评估是通过测量累积亚硝酸盐浓度(一种一氧化氮稳定的降解产物)，其方法是根据Green等(1982年)所提的方法，以″格里斯试剂″(Griess reagent：1％对胺苯磺酰胺、0.1％萘二胺盐酸盐，在5％磷酸中)进行重氮化反应。为此，在室温以相同体积″格里斯试剂″(Griess reagent)孵育50微升培养基获得上层清液(10分钟)，此后，以酵素免疫分析仪(ELISA阅读仪)(微孔鉴定板，型号550-Biorad公司)在550nm处测定吸光度。亚硝酸盐的浓度是根据事先准备好的已知亚硝酸钠摩尔浓度的标准曲线求得。该测试作三次，2- 5
而数值以NO /5x10 细胞的μmol表示。结果显示在图6。