吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法

摘要

吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法。选用未木质化的健康嫩叶经洗涤、消毒后主脉切2-4个切口，放入分化培养基中，先暗培42-54h，然后放在培养架上光照培养，待培养30天左右后，将长出的不定芽接入到抽茎培养基中，以促进茎的伸长生长。待不定芽长到2cm左右，将其移入到壮苗培养基中，使其生长为茎干粗壮的无根苗。待苗长到3cm左右时接入到生根培养基中，培养三周即可获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗。本发明突出优点是：操作简单，取材方便且材料丰富，可有效提高吴屯杨组织培养获得再生植株的效率，对其以后遗传改良和遗传转化具有重要意义。

权利要求

吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法，其特征在于通过如下步骤实现的：(1)外植体消毒：选用未木质化的健康嫩叶为外植体，用70％的酒精消毒30s后，再用0.1％的升汞浸泡6‑8min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干；(2)分化培养：将叶片延垂直主脉切2‑4个切口，切口深达主脉，正面向上，放入分化培养基中，先暗培42‑54h，然后放在培养架上光照培养，培养30天即可长出大量不定芽；所述分化培养基为：MS+6BA0.8‑1.2mg/L+NAA0.1‑0.2mg/L；(3)抽茎及壮苗培养：接入抽茎培养基中，以促进茎的伸长生长，待不定芽长到2cm后，将其移入到壮苗培养基中，使其生长为茎干粗壮的无根苗；所述抽茎培养基为：MS+6BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L+GA3 0.8‑1.5mg/L，壮苗培养基为：MS+蔗糖15‑25g/L+琼脂6.5g/L；(4)生根培养：待苗长到3cm时接入到生根培养基中，培养三周即可获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗；所述生根培养基为：1/2MS+IBA0.15‑0.25mg/L+NAA 0.02‑0.04mg/L；以上培养步骤中：分化、抽茎培养基中加入30g/L的蔗糖，壮苗培养基中加入15‑25g/L的蔗糖，生根培养基中加入15g/L的蔗糖；以上所有培养基中均加入6.5g/L的琼脂，其pH为5.8，培养室温度25±2℃，除步骤2中暗培步骤外，其它培养的光照强度1500‑2000Lx，光照时间13‑15h/d；以上培养基中：MS为基本培养基的一种，是Murashige and Skoog Stock的简称；6‑BA为6‑苄氨基嘌呤的简称；NAA为α‑萘乙酸的简称；GA3为赤霉素的简称；IBA为吲哚丁酸的简称。

说明书

吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法

技术领域

[0001] 本发 明属于林业繁殖技术领域，涉及以部分组织进行无性繁殖的技术。具体涉及 以树叶组织培养进行再生植株的技术。

背景技术

[0002] 林业是国民经济的基础产业，在改善生态环境、维护生态平衡、实现可持续发展中 具有不可替代的作用。随着我国荒漠化盐渍化和冻害的不断加剧，培育抗逆品种是实现扩 大种植面积，降低盐碱灾害，缓解土地矛盾的有效途径之一，同时也是提高生态效益和经济 效益的有效途径。近年来，国内外相继推出一批速生、抗旱、耐盐碱、抗病虫害的杨树杂交 种、转基因品种等，大大推动了我国林业技术的发展。

[0003] 1983年初，课题组在辽宁西部新民县大柳屯乡吴屯村发现了一种被当地老百姓称 之为“吴屯杨”(Populus wutunensis)的杨树无性系，在当地的自然环境下高径生长表现优 异。经过多年繁育、盆栽和实地对比试验以及有关专家认定，吴屯杨具有繁殖容易，育苗、造 林成活率高，根系发达，适应性强，生长速度快，抗干旱，耐盐碱，耐瘠薄，树干通直，材质优 良，速生丰产等特点，是优良天然杂交种，可用于营造防护林，大、小径阶用材林等，是一种 速生抗性强的树种，在沙壤土、盐碱地上生长良好，可以在沿海及内陆盐碱地上的造林生产 中推广使用。2008年12月，该品种通过了辽宁省林木品种审定。建立高效的组培再生体 系，对吴屯杨今后的遗传改良和遗传转化奠定了基础。

发明内容

[0004] 本发明旨在发明一种吴屯杨叶片组织培养获得再生植株的方法。本发明直接用叶 片作为外植体，取材方便。

[0005] 组织培养技术的成功不仅出取决于植物本身的遗传特性，还需要适宜的培养基种 类、激素种类及浓度，以及恰当的培养温度、适度和光照等条件。不同植物品种对组织培养 条件的要求均有所不同。本方面的技术方案是：吴屯杨组培苗方法包括外植体消毒、分化培 养、抽茎及壮苗培养、生根培养来实现再生植株幼苗。

[0006] 本发明是通过如下步骤实现的：

[0007] (1)外植体消毒：选用未木质化的健康嫩叶为外植体，用70%的酒精消毒30s后， 再用0. 的升汞浸泡6-8min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干。

[0008] (2)分化培养：将叶片延垂直主脉切2-4个切口，切口深达主脉，正面向上，放入分 化培养基中（分化培养基为：MS+6BA0. 8-1. 2mg/L+NAA0. 1-0. 2mg/L)，先暗培42_54h，然后 放在培养架上光照培养，培养30天左右即可长出大量不定芽。

[0009] (3)抽茎及壮苗培养：接入抽茎培养基中（抽茎培养基为：MS+6BA1. Omg/ L+NAAO. 15mg/L+GA30. 8-1. 5mg/L)，以促进茎的伸长生长，待不定芽长到2cm左右后，将其移 入到壮苗培养基（壮苗培养基为：MS+蔗糖15-25g/L+琼脂6. 5g/L)中，使其生长为茎干粗 壮的无根苗。[0010] (4)生根培养：待苗长到3cm左右时接入到生根培养基（生根培养基为：1/2MS+IBA0. 15-0. 25mg/L+NAA 0. 02-0. 04mg/L)中，培养三周左右即可获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗。

[0011] 以上培养步骤中：分化、抽茎培养基中加入30g/L蔗糖，壮苗培养基中加入 15-25g/L的蔗糖，生根培养基中加入15g/L的蔗糖。所有培养基均加入6. 5g/L的琼 月旨，其PH为5. 8，培养室温度25士2°C，除步骤2中暗培步骤外，其它培养的光照强度 1500-2000Lx，光照时间 13-15h/d。

[0012] MS为基本培养基的一种，是Murashige and Skoog Stock的简称（下同）； 6-BA为6-苄氨基嘌呤，是6-benzylaminopurine的简称（下同）；NAA为α -萘乙酸，是 α -Naphthaleneacetic acid 的简称（下同）；GA3 为赤霉素，是 Gibberellic acid 的简称 (下同）；IBA为吲哚丁酸，是indolebutyric acid的简称（下同）。

[0013] 本发明突出优点是：操作简单，取材方便且材料丰富，可有效提高吴屯杨组织培养 获得再生植株的效率，对其以后遗传改良和遗传转化具有重要意。

附图说明

[0014] 图1 ：外植体诱导的丛生芽。两周左右后在叶片切口处开始出现不定芽。

[0015] 图2:外植体诱导的丛生芽。抽茎培养中，不定芽迅速伸长生长情况。

[0016] 图3 ：为诱导不定芽生根。茎干粗壮的幼苗接种到生根培养基，一周左右就可以看 到根源基突起，培养三周左右即可获得粗壮的根。

具体实施方式

[0017] 实施例1

[0018] (1)外植体消毒：选用未木质化的健康嫩叶为外植体，先将外植体用清水清洗表 面灰尘，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用70%的酒精消毒30s后用无菌水清洗一 次，再用0. 的升汞消毒7min，然后在无菌条件下用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干。

[0019] (2)分化培养：将叶片延垂直主脉切2-4个切口，切口深达主脉，正面向上，放入分 化培养基中（分化培养基为：MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L)，先暗培48h，然后放在培养架 上光照培养，4d后叶片普遍卷曲，切口处增厚，长出淡绿色的愈伤组织，大约两周左右后在 叶片切口处开始出现不定芽（图1)，30d后统计结果，不定芽分化率为93. 3%。

[0020] (3)抽茎及壮苗培养：将丛生芽连同外植体一同移入到抽茎培养基中（抽茎培养 基为：MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA31. 0mg/L)，不定芽迅速伸长生长（图2)，待不定芽 长到2cm左右后，将其移入到壮苗培养基（壮苗培养基为：MS+蔗糖20g/L+琼脂6. 5g/L) 中，使不定芽生长的更加健壮。

[0021] (4)生根培养：待苗长到3cm左右时选择茎干粗壮的幼苗接种接入到生根培养基 (生根培养基为d/^MS+IBAO. 20mg/L+NAA0. 03mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突起， 培养三周左右即可获得健壮的根（图3)。30d后统计结果，生根率达98.0%。

[0022] 以上培养步骤中：分化、抽茎培养基中加入30g/L蔗糖，壮苗培养基中加入20g/L 的蔗糖，生根培养基中加入15g/L的蔗糖。以上培养基中均加入6. 5g/L的琼脂，pH5.8，培 养室温度25°C，除步骤2中暗培步骤外，其它培养的光照强度2000Lx，光照时间14h/d。[0023] 实施例2

[0024] (1)外植体消毒：采集未木质化的健康嫩叶为外植体，先将外植体用清水清洗表 面灰尘，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用70%的酒精消毒30s，用 [0025] 无菌水清洗一次，再用0. 的升汞消毒6min，然后用无菌水清洗5次，取出后用 无菌滤纸吸干。

[0026] (2)分化培养：将叶片延垂直主脉切2-4个切口，切口深达主脉，正面向上，接入分 化培养基中（分化培养基为：MS+6BA0. 8mg/L+NAA0. lmg/L)，先暗培42h，然后放在培养架上 光照培养，大约两周左右后在叶片切口处开始出现不定芽，30d后统计结果，不定芽分化率 为 86. 7%。

[0027] (3)抽茎及壮苗培养：将丛生芽连同外植体一同移入到抽茎培养基中（抽茎培养 基为：MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA30. 8mg/L)，不定芽迅速伸长生长，待不定芽长到2cm 左右后，将其移入到壮苗培养基（壮苗培养基为：MS+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L)中，使不定 芽生长的更加健壮。

[0028] (4)生根培养：待苗长到3cm左右时，选择茎干粗壮的幼苗接种接入到生根培养基 (生根培养基为：1/2MS+IBA0. 25mg/L+NAA0. 04mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突起， 培养三周左右即可获得健壮的根（图3)。30d后统计结果，生根率达92.0%。

[0029] 以上培养步骤中：分化、抽茎培养基中加入30g/L蔗糖，壮苗培养基中加入25g/L 的蔗糖，生根培养基中加入15g/L的蔗糖。以上培养基均加入6. 5g/L的琼脂，pH5.8，培养 室温度27°C，除步骤2中暗培步骤外，其它培养的光照强度2000Lx，光照时间13h/d。

[0030] 实施例3

[0031] (1)外植体消毒：采集未木质化的健康嫩叶为外植体，先将外植体用清水清洗表 面灰尘，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用70%的酒精消毒30s，用无菌水清洗一次， 再用0. 的升汞消毒8min，然后用无菌水清洗5次，取出后用无菌滤纸吸干。

[0032] (2)分化培养：将叶片延垂直主脉切2-4个切口，切口深达主脉，正面向上，接入分 化培养基中（分化培养基为：MS+6BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L)，先暗培养54h，然后放在培养架 上光照培养，大约两周左右后在叶片切口处开始出现不定芽，30d后统计结果，不定芽分化 率为88. 9%。

[0033] (3)抽茎及壮苗培养：将丛生芽连同外植体一同移入到抽茎培养基中（抽茎培养 基为：MS+6BA1. 0mg/L+NAA0. 15mg/L+GA31. 5mg/L)，不定芽迅速伸长生长，待不定芽长到 2cm左右后，将其移入到壮苗培养基（壮苗培养基为：MS+蔗糖15g/L+琼脂6.5g/L)中，使 不定芽生长的更加健壮。

[0034] (4)生根培养：待苗长到3cm左右时，选择茎干粗壮的幼苗接种接入到生根培养 基（生根培养基为d/^MS+IBAO. 15mg/L+NAA 0. 02mg/L)中，一周左右就可以看到根源基突 起，培养三周左右即可获得粗壮的根（图3)。30d后统计结果，生根率达94.0%。

[0035] 以上培养步骤中：分化、抽茎培养基中加入30g/L蔗糖，壮苗培养基中加入15g/L 的蔗糖，生根培养基中加入15g/L的蔗糖。以上培养基均加入6. 5g/L的琼脂，pH5.8，培养 室温度23°C，除步骤2中暗培步骤外，其它培养的光照强度1500Lx，光照时间15h/d。