一种白背三七总黄酮的制备方法及应用转让专利

申请号 : CN201010261984.0

文献号 : CN101953866A

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相似专利:

发明人 : 宋洪涛陈磊

申请人 : 中国人民解放军南京军区福州总医院

摘要 :

一种白背三七总黄酮的制备方法,取白背三七,加热,粉碎后,加入40-95%乙醇回流提取,提取液浓缩后上大孔树脂柱,用含水乙醇梯度洗脱,收集35-55%乙醇洗脱部分,回收溶剂后,得总黄酮,其可与药学辅料混合,制备具有降血糖作用的药物;该方法不但重现性好,而且杂质减少,总黄酮含量高,从而保证了疗效的稳定,并有利于工业化生产。该提取物可用于制备具有降血糖作用的药物或保健品。

权利要求 :

1.一种白背三七总黄酮的制备方法,其特征在于:取白背三七,粉碎,加入40-95%(重量比,下同)乙醇回流提取,提取液浓缩后上大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集

35-55%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。

2.根据权利要求1所述白背三七总黄酮的制备方法,其特征在于:白背三七粉碎成40目粉,用45-70%乙醇回流提取,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集40-50%醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。

3.根据权利要求2所述白背三七总黄酮的制备方法,其特征在于:白背三七粉碎成40目粉,采用6-10倍药材重量(W/V)的50-80%乙醇溶液,于80-95℃条件下回流提取,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集40-50%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。

4.根据权利要求3所述白背三七总黄酮的制备方法,其特征在于:白背三七粉碎成40目粉,采用7-9倍药材重量(W/V)的50-55%乙醇溶液,于85-90℃条件下回流提取2次,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度递增洗脱,收集40-50%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。

5.根据权利要求4所述白背三七总黄酮的制备方法,其特征在于:白背三七粉碎成40目粉,采用8倍药材重量(W/V)的50%乙醇溶液,于85℃条件下回流提取2次,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,依次用25%、45%、70%、95%的乙醇溶液梯度洗脱,收集45%乙醇洗脱液,浓缩得到总黄酮。

6.一种如权利要求1、2、3、4或5所述制备方法得到的白背三七总黄酮的应用,其特征在于:所述总黄酮与药学上适用载体混合,制备具有降血糖作用的药物。

说明书 :

一种白背三七总黄酮的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药有效部位的提取分离方法,具体地说是从中药白背三七中提取分离具有降血糖作用总黄酮的方法,属于药物分离提取领域。

背景技术

[0002] 白背三七(Gynura divaricata (L.) DC.)为菊科菊三七属植物,又名白东枫、白子草、玉枇杷、三百棒、厚面皮、鸡菜、大肥牛、白番苋、白红菜、疔拔,分布于台湾至华南、西南一带。其根、茎、叶均可入药。其根性味甘、凉,能清热凉血,散瘀消肿;其茎、叶性味咸微辛、寒,有毒,具有清热,舒筋,止血,祛痰之功效。在福建,民间以其茎叶冲茶饮水服用,用于治疗糖尿病,效果很好。白背三七总黄酮具有较好的降血糖活性(胡勇等,白背三七地上部分降血糖作用研究,西南林学院学报,2007,27(1):55-58; 姜曼花等,白背三七多糖和黄酮降血糖及耐缺氧作用,中国医院药学杂志,2009,29(13):1074-1076)。 [0003] 目前,从白背三七中提取分离总黄酮类物质的报道仅见4篇。①将白背三七茎叶粉碎至12目,浸泡50 min,然后用40倍量60%的乙醇,在60 ℃下超声提取2次。(王津江等,白背三七总黄酮的提取工艺研究。 中国药师,2009,12(2),146-149)②白背三七经95%乙醇反复提取三次,提取液浓缩后的浸膏混悬于水中,经石油醚萃取后,水相再经正丁醇萃取,正丁醇萃取物上聚酰胺柱,乙醇梯度洗脱后得总黄酮。(胡勇等,白背三七地上部分降血糖作用研究,西南林学院学报,2007,27(1):55-58)。③白背三七经60%乙醇超声提取后,提取物上聚酰胺柱,70%乙醇洗脱后得总黄酮。(李厚全等,聚酰胺纯化白背三七总黄酮的研究, 中国药师, 2010,13(2):172-175)上述3种方法从白背三七中提取分离总黄酮类物质,提取物中杂质较多,所用的聚酰胺成本高,且需用毒性的有机溶剂,黄酮含量不高并且转移率低。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是改进从白背三七中提取分离具有降血糖作用总黄酮的方法,使其不但重现性好,而且提取成本低,杂质减少,总黄酮含量高,从而保证了疗效的稳定,并有利于工业化生产。
[0005] 本发明的目的是通过如下方案来实现:方案1、取白背三七,粉碎,加入40-95%(重量比,下同)乙醇回流提取,提取液浓缩后上大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集35-55%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮;所述大孔树脂为D-101大孔树脂。
[0006] 方案2、白背三七粉碎成40目粉,用45-70%乙醇回流提取,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集40-50%醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。
[0007] 方案3、白背三七粉碎成40目粉,采用6-10倍药材重量(W/V)的50-80%乙醇溶液,于80-95℃条件下回流提取,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度洗脱,收集40-50%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。
[0008] 方案4、白背三七粉碎成40目粉,采用7-9倍药材重量(W/V)的50-55%乙醇溶液,于85-90℃条件下回流提取2次,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,用乙醇水溶液梯度递增洗脱,收集40-50%乙醇洗脱部分,浓缩得到总黄酮。
[0009] 方案5、白背三七粉碎成40目粉,采用8倍药材重量(W/V)的50%乙醇溶液,于85℃条件下回流提取2次,提取液浓缩后上D-101大孔树脂柱,依次用25%、45%、70%、
95%的乙醇溶液梯度洗脱,收集45%乙醇洗脱液,浓缩得到总黄酮。
[0010] 上述制备的白背三七总黄酮可与药学上适用载体混合,制备具有降血糖作用的药物。
[0011] 为了实现以上目的,申请人从以下各方面进行了有益的试验:1、提取方式对提取效率的影响
(1)药材选择
选用菊科菊三七属植物白背三七(Gynura divaricata (L.) DC.)的叶,药材的性状特征、粉末特征、理化性质应符合福建省中药材标准(2006年版)“白子草”项下的内容。
[0012] (2)提取溶剂白背三七所含黄酮多为黄酮苷类极性较大的化合物,甲醇或乙醇是优良的提取溶剂,但甲醇毒性较大,所以本发明用乙醇溶液作为总黄酮的提取溶剂。
[0013] (3)提取方式分别取粉碎成40目的药材粉末约20g,精密称定,以8倍量50%乙醇按下列方法提取:
冷浸:8倍量溶剂冷浸12小时,提取2次。
[0014] 渗漉:16倍量溶剂渗漉。
[0015] 热回流:8倍量溶剂85℃热回流,提取2次。
[0016] 分别合并各种提取液,按紫外分光光度法分别测定提取物中总黄酮量,结果如表1所示。
[0017] 表1提取方式对提取效率的影响表由表1可知,热提的提取效率最高,渗漉次之,冷浸较差,而且三者差异显著。
[0018] 2、提取工艺的优化为了确定乙醇浓度、用量、温度以及提取次数对提取效率的影响,我们进行了正交设计试验研究,以总黄酮的含量为指标,对提取工艺进行了优化。用热回流法提取,提取液浓缩后,按紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量。
[0019] 提取工艺正交实验涉及溶剂浓度、温度、溶剂用量、提取次数等,分别测定总黄酮量、浸膏量和总黄酮得率。
[0020] 综合考虑到总黄酮提取总量、含量及得率,同时结合到工业化生产的成本、后处理的难易,以及工艺的稳定与重现性等因素,本发明选用按药材重量计6-10倍体积的40-95%乙醇,于80-95℃条件下进行回流提取。较好的提取分离条件是:用药材重量7-9倍体积的45—70%乙醇,回流提取。较佳条件还有:用药材重量7-9倍体积的50-60%乙醇,于80-90℃条件下回流提取2次。更佳条件为:用药材重量8倍体积的50%乙醇,于85℃条件下回流提取2次。
[0021] 3、白背三七总黄酮的分离、纯化、浓缩与干燥的最佳工艺(1)分离与纯化工艺
白背三七提取物经D-101大孔树脂分段,依次用25%,45%,70%,95%乙醇洗脱,收集45%乙醇洗脱部分,减压浓缩后干燥,即得总黄酮部分。
[0022] (2)浓缩与干燥工艺将45%乙醇洗脱部分过滤,减压回收溶剂,真空干燥,即得总黄酮部位,其中总黄酮的含量可达到50-60%,药材中总黄酮的转移率可达到60~85%。
[0023] 本发明工艺所用的药材炮制方法是经实验比较而得出,提取溶剂种类和浓度、提取方法、药材粉碎目数等经过正交设计研究而成,保证了所得到的白背三七总黄酮得率高;大孔树脂的洗脱分段,经过严格的小浓度梯度实验,保证了所得到的分段部位中主要黄酮(芦丁,烟花苷,紫云英苷等)的含量达到50~60%,药材中总黄酮的转移率为60~85%。

具体实施方式

[0024] 以下为本发明的几个具体实施案例,进一步描述本发明,但是本发明不仅限于此。
[0025] 实施例1取白背三七药材20kg,粉碎成40目粉,采用药材重量6倍体积的45%(重量比,下同)乙醇75℃热回流提取三次,每次1小时。提取液合并,减压回收溶剂,所得浓缩液用D101大孔树脂分段,洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集35-55%乙醇段洗脱液,减压回收溶剂,所得浸膏经真空干燥,即得白背三七总黄酮粗品0.17kg,其总黄酮含量为50%,转移率为66%。
[0026] 实施例2取白背三七药材20kg,粉碎成40目粉,采用药材重量8倍体积的70%乙醇85℃热回流提取二次,每次1小时。提取液合并,减压回收溶剂,所得浓缩液用D101大孔树脂分段,洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集45-50%乙醇段洗脱液,减压回收溶剂,所得浸膏经真空干燥,即得白背三七总黄酮粗晶0.16kg,其总黄酮含量为55%,转移率为70%。
[0027] 实施例3取白背三七药材20kg,粉碎成40目粉,采用药材重量10倍体积的95%乙醇95℃热回流提取二次,每次1小时。提取液合并,减压回收溶剂,所得浓缩液用大孔树脂分段,洗脱剂为梯度增加的乙醇溶液。收集45—55%乙醇段洗脱液,减压回收溶剂,所得浸膏经真空干燥,即得白背三七总黄酮粗品0.15kg,其总黄酮含量为51%,转移率为60%。
[0028] 实施例4取白背三七药材20kg,粉碎药材至40目,以热回流方式,用50%乙醇,8倍量体积的溶剂,85℃下提取2次。合并提取液,减压浓缩至浓缩液体积与药材的重量比为0.8-1.0。
浓缩液用多层纱布过滤,上样于D-101大孔树脂顶端,用水,25%,45%,70%,95%乙醇梯度洗脱,收集45%乙醇段洗脱液,减压回收溶剂,真空干燥得0.18kg白背三七总黄酮粗品,其总黄酮含量为59%,转移率为84%。
[0029] 实施5 总黄酮降糖作用1 实验材料
3.1.1 实验动物
SPF级SD大鼠, 60只,♂,体重150~180g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号:SOXK(沪)2008-0003。在福州总医院实验动物科清洁级鼠类实验室进行饲养和实验。
[0030] 2 药物和试剂盐酸二甲双胍片:江苏苏中药业集团股份有限公司产品,批号:07010906;
格列本脲片:天津太平洋制药有限公司出品,批号:070404;
白背三七总黄酮依本专利所述方法提取纯化而得;
胆固醇为中国医药集团上海化学试剂公司产品,批号:F 20061114;
胆酸钠为中国医药集团上海化学试剂公司产品,批号:F 20060428;
链脲佐菌素(STZ)及柠檬酸/柠檬酸三钠:Sigma公司;
冰醋酸和浓硫酸均为分析纯,购自上海联试化工试剂有限公司;
肝糖元测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;
超氧化物歧化酶(SOD)测试盒及丙二醛(MDA)测定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所;
胰岛素(Ins)放射免疫分析药盒、内皮素(ET)放射免疫分析药盒:购自北京北方生物技术研究所。
[0031] 白背三七总黄酮:由实施例1得到。
[0032] 3实验主要仪器Optium血糖/血酮仪及配套试纸:美国雅培公司;
电子天平:FA1004,上海电平仪器厂产品;
低速冷冻离心机:HDC-2044,科大创新股份有限公司中佳分公司产品;
放射免疫计数器:GC-1200γ,中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器公司产品;
紫外-可见光分光光度计:UV-2501PC,日本岛津公司出品;
全自动生化分析仪:AU-2700,Olympus公司出品;
4实验方法
4.1 糖尿病动物模型的建立
SPF级雄性SD大鼠适应性饲养一周后,随机抽取8只作为正常对照组,其余大鼠用高糖高脂饲料(饲料自制,组成为:10.0%猪油,20.0%蔗糖,2.5%胆固醇,1.0%胆酸盐,66.5%常规饲料)喂养30d。禁食水12h后,以浓度为0.1mmol/L、pH4.2~4.5的柠檬酸/柠檬酸三钠缓冲液新鲜配制2%链脲佐菌素(STZ)溶液,大鼠以30mg/kg剂量腹腔注射,72小时后剪-1
尾采血检测血糖,以血糖>16.7 mmol·L 为成功模型纳入实验。
[0033] 4.2 实验分组与给药取糖尿病模型大鼠40只随机分为5组,每组8只,其中1组为模型对照组,其余4组为给药组, 即二甲双胍组(25mg/kg·d)、格列本脲组(2mg/kg·d)、白背三七总黄酮低剂量组(20mg/kg·d)和高剂量组(80mg/kg·d),临用前均用0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液。
各组大鼠均灌胃给予相应药物,正常对照组和模型对照组给予等容量的0.5% CMC-Na溶液。
灌胃期间正常对照组给予基础饲料喂养,其余各组动物继续喂以高糖高脂饲料。定期称量体重调整给药量,1次/ d,连续30d。
[0034] 4.3 指标检测实验期间分别于0 d、10 d、20 d、30 d剪尾取血检测血糖。给药结束后,将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)进行麻醉,心脏取血7~10ml,分离血清,-20℃冰箱保存待测。
采用AU-2700型全自动生化分析仪检测血糖、血脂水平,并严格按照试剂盒使用说明书测定SOD和MDA含量,放射免疫法检测血清Ins、血浆ET。剖取新鲜肝脏,生理盐水冲洗后,严格按照试剂盒使用说明书测定肝糖元含量。
[0035] 4.4 统计学分析实验数据均用SPSS13.0软件进行统计学处理,各项指标结果以均数±标准差( ±s)表示,组间比较采用t检验, 以P <0.05为有统计学显著差异性。
[0036] 5 结果5.1 白背三七总黄酮对2型糖尿病模型大鼠血糖的影响
大鼠腹腔注射STZ后,血糖显著升高,注射第10d、20d、30d模型组大鼠血糖很高,与正常组比较,具有显著性差异(p<0.01),说明2型糖尿病模型造模成功,并在实验期间持续高血糖。给药10d后各组大鼠血糖开始下降,给药后20d,白背三七总黄酮低、高剂量组大鼠血糖下降明显,与模型组比较,有显著性差异(p <0.05)。灌胃30d后白背三七总黄酮低、高剂量组大鼠血糖与模型组比较具有非常显著性差异(p <0.01),高剂量组与二甲双胍、格列本脲对照组降血糖效果相当(p >0.05)。结果提示,白背三七总黄酮具有较好的降血糖作用,并能显示出一定的量效、时效关系。见表5。
[0037] 表5:白背三七总黄酮对T2DM大鼠血糖的影响(n=8, ±s)a b c
注:与正常对照组比较, p <0.01 ;与模型对照组比较,p<0.05,p<0.01
d e
与二甲双胍对照组比较,p>0.05;与格列本脲对照组比较,p>0.05
5.2 白背三七总黄酮对2型糖尿病模型大鼠血脂的影响
各组动物灌胃30天后,与正常对照组相比较,模型组大鼠血中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平均明显升高(p<0.01),说明2型糖尿病模型大鼠出现了明显的脂代谢紊乱;与模型对照组相比较,白背三七总黄酮低、高剂量组大鼠的TC和TG水平均明显下降(p<0.01, p<0.05)。结果提示白背三七总黄酮对改善糖尿病脂代谢紊乱有较好作用。见表6。
[0038] 表6:白背三七总黄酮对T2DM大鼠血脂的影响(n=8, ±s)注:与正常对照组比较,a p <0.01 ; 与模型对照组比较,bp<0.05,cp<0.01
5.3 白背三七总黄酮对2型糖尿病模型大鼠血清胰岛素的影响
灌胃结束后,与正常对照组相比较,模型组大鼠的血清胰岛素水平明显升高(p<0.01),说明2型糖尿病模型大鼠出现了高胰岛素血症;与模型对照组相比较,白背三七总黄酮低、高剂量组血清胰岛素水平均有不同程度的降低,具有非常显著性差异(p<0.01)。结果提示白背三七总黄酮对改善2型糖尿病大鼠高胰岛素血症有较好的作用。结果如表7。
[0039] 表7:白背三七总黄酮对T2DM大鼠血清胰岛素的影响(n=8, ±s)a b
注:与正常对照组比较, p <0.01 ; 与模型对照组比较,p<0.01
5.4 白背三七总黄酮对2型糖尿病模型大鼠肝糖元的影响
与正常对照组相比较,模型组大鼠的肝糖元含量明显降低(p<0.01);与模型对照组相比较,二甲双胍组和格列本脲组的肝糖元含量均有不同程度的升高(p<0.01,p<0.05),而白背三七总黄酮低、高剂量组肝糖元含量与模型组相当,无显著变化(p>0.05)。结果如表8所示。
[0040] 表8:白背三七总黄酮对T2DM大鼠肝糖元含量的影响(n=8, ±s)a b c d
注:与正常对照组比较, p <0.01 ; 与模型对照组比较,p<0.05,p<0.01, p>0.05
5.5 白背三七总黄酮对2型糖尿病模型大鼠血中SOD、MDA的影响
与正常对照组相比,模型组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力明显降低(p<0.01),而脂质过氧化的终末产物丙二醛(MDA)含量明显增加(p<0.01),说明2型糖尿病模型大鼠机体清除自由基的能力下降,氧化应激水平升高;而白背三七总黄酮低、高剂量组血清SOD活力明显高于模型组,MDA含量明显低于模型组(p<0.01),结果提示白背三七总黄酮能增加糖尿病大鼠抗氧化酶活性,减轻脂质过氧化。结果如表9。
[0041] 表9:白背三七总黄酮对T2DM大鼠血SOD、MDA的影响(n=8, ±s)