本发明公开了一种蒺藜提取物的检测方法，该方法为：色谱条件：室温，相对湿度：25-40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min。本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。
一种蒺藜提取物的指纹图谱检测方法，其特征在于该方法为：色谱条件为：室温，相对湿度：25‑40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器的条件为：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min；取蒺藜提取物制成每1ml含3‑6mg的溶液；注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：第0. 01分 钟：流动相A乙腈溶液为24%，流动相B水为76% ；第8分钟：流动相A乙腈溶液为32%， 流动相B水为68% ；第45分钟：流动相A乙腈溶液为40%，流动相B水为60% ；第75分 钟：流动相A乙腈溶液为55 %，流动相B水为45 %。
3.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：称 取蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷，滤过，制成每Iml含3-6mg的溶 液。
4.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于色谱条件中室温为：20°C;相对 湿度为：35%0
5.如权利要求3所述的指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备中超声处理 10分钟；制成每Iml含5mg的溶液。
6.如权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：第0. 01分钟：流动相A乙腈溶液为24%，流动相B水为76% ；第8分钟：流动相A乙 腈溶液为32 %，流动相B水为68 % ；第45分钟：流动相A乙腈溶液为40 %，流动相B水为 60% ；第75分钟：流动相A乙腈溶液为55%，流动相B水为45% ；第80分钟：流动相A乙 腈溶液为75%，流动相B水为25%;第120分钟：流动相A乙腈溶液为75%，流动相B水为 25%。
7.如权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为10 个共有峰，与蒺藜呋留皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰，计算各共有峰的 相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1#0. 35-0. 43、2#0· 40-0. 48、3#0· 40-0. 50、 4#0· 65-0. 79、5#0· 67-0. 81、6#0· 83-1. 01、7#0· 87-1. 07、8#1· 00、9#1· 21-1. 47、10#1· 30-1. 60 ； 相对峰面积：1#0. 4 〜1. 0、2#0· 2 〜0. 3、4#0· 2 〜0. 4、6#0· 2 〜0. 4、8#1. OOUOflO. 2 〜0. 4。
8.如权利要求6所述的指纹图谱检测方法，其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为13 个共有峰，与蒺藜呋留皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰，计算各共有峰的 相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1#0. 35-0. 43、2#0· 40-0. 48、3#0· 40-0. 50、 4#0· 65-0. 79、5#0· 67-0. 81、6#0· 83-1. 01、7#0· 87-1. 07、8#1· 00、9#1· 21-1. 47、10#1· 30-1. 60、 11#1· 38-1. 86、12#1· 44-1. 94、13#1· 73-2. 33 ；相对峰面积：1#0. 4 〜1. 0、2#0· 2 〜0. 3、 4#0· 2 〜0. 4、6#0· 2 〜0. 4、8#1. OOUOflO. 2 〜0. 4、12#0· 5 〜0. 9。
9.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制 备：取蒺藜草分别加水5〜15倍量，煎煮1〜5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加 入乙醇，搅勻，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好 的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无 苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，即得蒺藜提取物。
10.如权利要求9所述的指纹图谱检测方法，其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制备：所述蒺藜皂苷更优选由如下方法制备：取蒺藜草切段，分别加水5〜15倍量，煎煮 1〜5次，每次1〜4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至50〜60°C相对密度1. 1〜1. 25，放 冷，加入80%〜99%乙醇，搅勻，静置1〜5h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释， 滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制在400〜700L/h，再用水洗至流 出液近无色澄清，继用60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇， 浓缩至50〜60°C相对密度1. 05〜1. 15，得蒺藜皂苷浓缩液，干燥，得蒺藜皂苷。
蒺藜总皂苷的检测方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及蒺藜提取物的检测方法，属于中药领域。 技术背景
[0002] 白蒺藜（Tribulus Terrestris L)为蒺藜科蒺藜属植物，具有活血通络、平肝潜 阳、祛湿化痰、宣痹通阳、补益肝肾等功效。历代本草多有记载，《本草纲目》日：“蒺藜气味 苦温，其性宣通，治胸痹痞满，利肝肾。”《本经》载：“蒺藜主恶血，破积聚。”《本草再新》“益 气化痰，散湿。，，《本草汇言》谓其“去风下气，行水化瘀之药也。”蒺藜总皂苷临床已被应用 多年以治疗心血管疾病。临床及实验药理学都证明可改善心功能、缩小心肌梗塞面积、缓解 心绞痛的症状、延长心绞痛的发作间期、减少心绞痛的发作次数，对陈旧性心肌梗塞伴左室 功能异常者亦能减轻其胸闷、气促和心悸等症状，增加左室收缩功能和排血量。
[0003] 目前，现有技术并没有公开蒺藜提取物的指纹图谱的检测方法。
发明内容
[0004] 本发明目的在于提供一种蒺藜提取物的检测方法。
[0005] 本发明目的在于提供一种蒺藜总皂苷的检测方法。
[0006] 本发明提供一种蒺藜提取物的高效液相_蒸发光散射指纹图谱检测方法，该方法 包括如下步骤：
[0007] 色谱条件：室温，相对湿度：25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60〜 90 %乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速：0. 4〜 0. 6ml/min，柱温：25〜45°C ；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105〜120°C，气体流速：1〜 3L/min。
[0008]
[0009] 所述色谱条件优选室温：20°C，相对湿度：35 % ；
[0010] 供试品溶液的制备：称取蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷， 滤过，制成每Iml含3-6mg的溶液，即得；其中超声优选分钟10 ；优选制成每Iml含5mg的 溶液；
[0011] 测定法：精密吸取供试品溶液20μ 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0012] 本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱：
[0013]
[0014] 所述蒺藜提取物为蒺藜的有机或无机溶剂提取物，包括但不限于醇提过柱精制 物、水提过柱精制物、醇提物或水提物。
[0015] 所述蒺藜提取物优选为：取蒺藜草分别加水5〜15倍量，煎煮1〜5次，合并煎 液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加入乙醇，搅勻，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加 水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出液近无色澄清，继用 60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，得蒺藜提取物。
[0016] 本发明提供蒺藜总皂苷的检测方法，该方法包括如下步骤：
[0017] 色谱条件：室温，相对湿度：25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60〜 90 %乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速：0. 4〜 0. 6ml/min，柱温：25〜45°C ；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105〜120°C，气体流速：1〜 3L/min。
[0018]
[0019] 所述色谱条件优选室温：20°C，相对湿度：35 % ；
[0020] 供试品溶液的制备：称取蒺藜皂苷适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷，滤 过，制成每Iml含3-6mg的溶液，即得；其中超声优选10分钟；优选制成每Iml含5mg的溶 液；
[0021] 对照品溶液的制备：精密称取蒺藜呋留皂苷甲对照品适量，加水制成每Iml含 0. 5mg的溶液，即得。
[0022] 测定法：精密吸取供试品、对照品溶液各20 μ 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱 图；
[0023] 供试品指纹图谱中，指纹图谱应有10个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8 号峰为参照峰（S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间： 1#0. 35-0. 43、2#0. 40-0. 48、3#0. 40-0. 50、4#0. 65-0. 79、
[0024] 5#0· 67-0. 81、6#0· 83-1. 01、7#0· 87-1. 07、8#1· 00、9#1· 21-1. 47、10#1· 30-1. 60 ；相 对峰面积:1#0. 4 〜1. 0、2#0· 2 〜0. 3、4#0· 2 〜0. 4、6#0· 2 〜0. 4、8#1. OOUOflO. 2 〜0. 4。
[0025] 本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱：
[0026]
[0027] 供试品指纹图谱中，指纹图谱应有13个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8 号峰为参照峰（S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间： 1#0. 35-0. 43、2#0. 40-0. 48、3#0. 40-0. 50、4#0. 65-0. 79、
[0028] 5#0· 67-0. 81、6#0· 83-1. 01、7#0· 87-1. 07、8#1· 00、9#1· 21-1. 47、10#1· 30-1. 60、 11#1. 38-1. 86、12#1. 44-1. 94、13#1. 73-2. 33 ；
[0029]相对峰面积：1#0. 4 〜1. 0、2#0· 2 〜0. 3、4#0· 2 〜0. 4、6#0· 2 〜0. 4、8#1· 00、 IOflO. 2 〜0. 4、12#0· 5 〜0. 9。
[0030] 所述蒺藜皂苷可以为市场购买，也可以为蒺藜醇提过柱精制物、水提过柱精制物、 醇提物或水提物；所述蒺藜皂苷优选由如下方法制备：取蒺藜草分别加水5〜15倍量，煎 煮1〜5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加入乙醇，搅勻，静置，滤过，滤液减压回 收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出 液近无色澄清，继用60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓 缩，得蒺藜皂苷；
[0031] 所述蒺藜皂苷更优选由如下方法制备：取蒺藜草（蒺藜地上干燥部分）切段，分别 加水5〜15倍量，煎煮1〜5次，每次1〜4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度 1. 1〜1.25 (50〜60°C )，放冷，加入80%〜99%乙醇，搅勻，静置1〜5h，滤过，滤液减压 回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制 在400〜700L/h，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无苦 味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1. 05〜1. 15(50〜60°C )，得蒺藜皂苷浓 缩液，干燥，得蒺藜皂苷。
[0032] 本发明对流动相进行了大量的选择工作，如考察甲醇_水溶剂系统，结果发现，在 实际可行的测定时间内，很难得到完全基线分离的色谱图，且梯度的微小变化，对图谱影响 较大。
[0033] 本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。本发明展开剂在75分钟内可以获得 10个有效检测峰，在75分钟后，当对展开剂进行探索性调整时，意外的获得3个有效检测 峰。
[0034] 下述实验用于进一步说明本发明的效果，但是对本发明范围的限制。
[0035] 实验例1精密性试验
[0036] 对实施例1的检测方法进行重现性试验，按照实施例1的方制成供试液，经微孔滤 膜滤过注入液相色谱仪，连续进样测试五次，考察色谱峰的相对保留时间的一致性及单峰 面积大于总峰面积10%的指纹峰（1、8、10号三个峰），2、3号和4、5号未能达基线分离，分 别作为峰组计算，其中30分钟以内组峰面积大于5%的指纹峰（2〜3#)峰面积或峰面积比值的稳定性，结果列于表1〜4。 [0037] 表1精密度试验绝对保留时间
[0038]
[0039]
[0040]表2精密度试验绝对保留时间
[0041]
[0042] 表3精密度试验峰面积
[0043]
[0044] *只有8 (S)的峰面积> 20 %。
[0045] 表4精密度试验相对峰面积比值
[0048] 结果示出，五次测定图谱的共有峰相对保留时间非常一致，几无变化。单峰面积占 总峰面积20%以上的共有峰只有对照峰_，其五次测定的峰面积RSD为4. 23%。其余4 个考察峰（或峰组）的面积比值RSD依次为4. 04、1. 18,2. 73,2. 50%。符合国家药品审评 中心于2001年发布的“中药注射液指纹图谱研讨会”纪要规定，“在方法学考察中，对峰面 积大于20%的共有峰，其峰面积比值的RSD不得大于5% ；峰面积小于20%的共有峰，RSD 可不作规定”的意见，认证本方法具有良好的精密性。
[0049] 实验例2重现性试验
[0050] 对实施例1的检测方法进行重现性试验，按照实施例1的方法制成5个独立供试 液，依法连续测定，结果列于表5〜8[0051 ] 表5重现性试验绝对保留时间
[0053] 表6重现性试验相对保留时间
[0061] 如表所示，五次独立测定的共有峰相对保留时间非常一致，单峰面积大于20%的 8# (对照峰）峰面积的RSD为2. 18%，远小于5%，其余4个考察峰（或峰组）的面积比值 RSD依次为3. 57、4. 54、3. 85、5. 09%。表明本方法具有良好重现性。
[0062] 实验例3稳定性试验
[0063] 对实施例1的检测方法进行稳定性试验，每间隔90分钟测定一次，连续测定6小9时（5次），结果列于表9〜12。 [0064] 表9稳定性试验绝对保留时间
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071] *只有8 (S)的峰面积> 20%。
[0072] 表12稳定性试验相对峰面积比值[0073]
[0074]
[0075] 如表所示，单峰面积大于20%的8# (对照峰）峰面积的RSD为2. 88%，远小于5%， 其余4个考察峰（或峰组）的面积比值RSD依次为2. 64、5. 23,6. 16,7. 75%。结果表明，本 供试液具有可行的稳定性。
[0076] 实验例4指纹图谱相似度分析
[0077] 选用中南大学指纹图谱相似度评价软件，对10批蒺藜粗皂苷（制备方法同实施例 3的方法）的采用实施例1高效液相-蒸发光散射指纹图谱方法，取其平均色谱或中位数色 谱作为对比标样，进行全谱相似度分析。蒺藜粗皂苷指纹图谱的全谱相似度，均大于0. 9，表 明各组内10批样品的指纹图谱具有良好的相似性。
[0078] 实验例5展开剂调整后的指纹图谱
[0079] 取蒺藜粗皂苷（制备方法同实施例3的方法）2批，根据实施例2的方法测定指纹 图谱，计算共有峰相对保留时间、峰面积及峰面积比值13，结果示出，十批粗皂苷的共有峰 及其相对保留时间基本一致，其峰面积比值基本相同，也与蒺藜草的指纹图谱相吻合。[0080]
具体实施方式
[0081] 实施例1 ：
[0082] 色谱条件：室温：20°C，相对湿度：35% ；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60〜90 %乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速： 0. 4〜0. 6ml/min，柱温：25〜45°C ；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105〜120°C，气体流 速：1 〜3L/min。 [0083]
[0084] 供试品溶液的制备：精密称取实施例3的蒺藜粗皂苷适量，加水适量，超声处理10 分钟，放冷，滤过，制成每Iml含5mg的溶液，即得。
[0085] 对照品溶液的制备：精密称取蒺藜呋留皂苷甲对照品适量，加水制成每Iml含 0. 5mg的溶液，即得。
[0086] 测定法：精密吸取供试品、对照品溶液各20 μ 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱 图。
[0087] 蒸发光散射检测器检测，经HPLC分离的液体组分，进入检测器，经雾化，流动相被 气化，检测组分形成的微小颗粒，对检测光形成散射作用，进而转化为电信号，转变为响应值。
[0088] 供试品指纹图谱中，指纹图谱应有10个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰 为参照峰（S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间为0. 38， 0. 45，0. 47，0. 75，0. 79，0. 93，0. 98，1. 00，1. 30，1. 42。相对保留面积：1#0. 62、2#0· 4、4#0· 3、 6#0. 32、8#1. OOUOflO. 26。
[0089] 实施例2 ：
[0090] 色谱条件：室温：20°C，相对湿度：35% ；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 60〜90 %乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速： 0. 4〜0. 6ml/min，柱温：25〜45°C；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105〜120°C，气体流 速：1 〜3L/min。
[0091]
[0092] 供试品溶液的制备：精密称取实施例3的蒺藜粗皂苷适量，加水适量，超声处理10 分钟，放冷，滤过，制成每Iml含5mg的溶液，即得。
[0093] 对照品溶液的制备：精密称取蒺藜呋留皂苷甲对照品适量，加水制成每Iml含 0. 5mg的溶液，即得。
[0094] 测定法：精密吸取对照品、供试品溶液各20 μ 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱 图。
[0095] 供试品指纹图谱中，指纹图谱应有13个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰 为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，0. 37，0. 45，0. 46，0. 75， 0. 78,0. 92,0. 98，1. 00，1. 29，1. 41，1. 59，1. 65，1. 99。相对峰面积比值：1#0. 62、2#0· 4、 4#0· 3、6#0· 32、8#1· OOUOflO. 26、12#0· 69。
[0096] 实施例3 ：蒺藜皂苷制备
[0097] 取蒺藜草（蒺藜地上干燥部分）切段，分别加水5〜15倍量，煎煮1〜5次，每 次1〜4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1. 1〜1. 25(50〜60°C )，放冷，加入 80%〜99%乙醇，搅勻，静置1〜5h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤 液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制在400〜700L/h，再用水洗至流出液近 无色澄清，继用60%〜85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至 相对密度1. 05〜1. 15(50〜60°C )，得蒺藜皂苷浓缩液，干燥，得蒺藜皂苷。
[0098] 实施例4 ：
[0099] 色谱条件：室温：20°C，相对湿度：35% ；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以 60〜90 %乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速： 0. 4〜0. 6ml/min，柱温：25〜45°C；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105〜120°C，气体流 速：1 〜3L/min。
[0100]
[0101] 供试品溶液的制备：精密称取实施例5的蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理10 分钟，放冷，滤过，制成每Iml含5mg的溶液，即得。
[0102] 测定法：精密吸取供试品溶液各20μ 1，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0103] 实施例5:
[0104] 取蒺藜草（蒺藜地上干燥部分)切段，分别加水5〜15倍量，煎煮1〜5次，每次 3h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1. 1〜1.25(50〜60°C )，放冷，加入85%乙 醇，搅勻，静置4h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，干燥即得提取物。
