重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤应用

摘要

本发明涉及重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤应用。本发明还公开了含有重组人锰超氧化物歧化酶与阿霉素的药物组合物，该药物组合物具有良好的抗肿瘤效果。本发明的药物组合物没有毒副作用，具有极好的药用前景。

权利要求

1.一种锰超氧化物歧化酶的用途，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是实体肿瘤或非实体肿瘤。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的实体肿瘤选自：艾氏腹水瘤，神经胶质瘤，子宫颈癌或肺癌。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的非实体肿瘤是白血病。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的锰超氧化物歧化酶是重组人锰超氧化物歧化酶。

6.一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：有效量的锰超氧化物歧化酶；

有效量的阿霉素；和

药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：

1-20重量份的锰超氧化物歧化酶；

1-5重量份的阿霉素；和

1-100重量份药学上可接受的载体。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中，锰超氧化物歧化酶和阿霉素之和占组合物总重量的1-50％。

9.权利要求6所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

10.一种药盒，其特征在于，所述的药盒含有权利要求6所述的药物组合物。

说明书

重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术以及药物学领域；更具体地，本发明涉及重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤应用。

背景技术

[0002] 超氧化物歧化酶(SuperOxide Dismutase，SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够保护需氧细胞免受正常代谢过程中产生的活性氧(Reactive Oxygen Species，- +ROS)的毒害，其主要催化下列反应：2O2+2H →H2O2+O2，H2O2随后被过氧化氢酶(CATs)和过氧化物酶清除。

[0003] SOD家族有多种同功酶，按分子所含金属辅基的不同，可将其分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧化物歧化酶(ExtraCellular SuperOxide Dismutase，EC-SOD)四类，这四类SOD都催化同一种催化反应。由于不同类型的SOD在一级结构上无同源性，它们之间的理化特性及稳定性差别很大，不同种属不同组织来源的同种SOD也略有差别。

[0004] SOD是国内外医学界一致公认的氧自由基的天然克星，可以专一清除氧自由基，从动物血、脏器及某些植物中提取的SOD已广泛应用于保健品、食品添加剂及化妆品等领域。目前市面上应用的SOD大多是从动、植物中提取的Cu，Zn-SOD，Mn-SOD因只存在于哺乳动物线粒体中，含量很少，根本无法采用提取方法大量获得，因而也限制了对其进一步的研究。
另外，Mn-SOD尽管与Cu，Zn-SOD等同属于SOD家族，但它们的性质有很多不同，故其应用领域也有所不同。如何大量获得人源化的Mn-SOD以及研究其在各方面的应用是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种重组人锰超氧化物歧化酶的抗肿瘤应用。

[0006] 在本发明的一个方面，提供一种锰超氧化物歧化酶的用途，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

[0007] 在一个优选例中，所述的肿瘤是实体肿瘤或非实体肿瘤。

[0008] 在另一优选例中，所述的实体肿瘤选自：艾氏腹水瘤(EAC肿瘤)，神经胶质瘤，子宫颈癌，肺癌。

[0009] 在另一优选例中，所述的非实体肿瘤是白血病。

[0010] 在另一优选例中，所述的锰超氧化物歧化酶是重组人锰超氧化物歧化酶。

[0011] 在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有：

[0012] 有效量的锰超氧化物歧化酶；

[0013] 有效量的阿霉素(ADR)；和

[0014] 药学上可接受的载体。

[0015] 在另一优选例中，所述的药物组合物含有：

[0016] 1-20重量份的锰超氧化物歧化酶；

[0017] 1-5重量份的阿霉素(ADR)；和

[0018] 1-100重量份药学上可接受的载体。

[0019] 在另一优选例中，所述的药物组合物含有：

[0020] 2-12重量份的锰超氧化物歧化酶；

[0021] 1-5重量份的阿霉素(ADR)；和

[0022] 1-100重量份药学上可接受的载体。

[0023] 在另一优选例中，所述的药物组合物中，锰超氧化物歧化酶与阿霉素按照重量比为(1-5)∶1；优选的是(1-3)∶1；更优选2∶1。

[0024] 在另一优选例中，所述的药物组合物中，锰超氧化物歧化酶和阿霉素之和占组合物总重量的1-50％。

[0025] 在另一优选例中，所述的锰超氧化物歧化酶是重组人锰超氧化物歧化酶。

[0026] 在另一优选例中，所述的药物组合物中，锰超氧化物歧化酶和阿霉素之和占组合物总重量的2-40％；更佳地3-30％。

[0027] 在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型选自：注射剂、粉末剂、片剂、混悬液或乳剂。

[0028] 在本发明的另一方面，提供所述的药物组合物的用途，用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

[0029] 在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒含有所述的药物组合物。

[0030] 在一个优选例中，所述的药盒中含有：容器和装于容器中的1-20重量份的锰超氧化物歧化酶；以及，容器和装于容器中的1-5重量份的阿霉素。

[0031] 在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的锰超氧化物歧化酶。

[0032] 在一个优选例中，所述方法还包括：同时给予需要预防或治疗的对象有效量的阿霉素。

[0033] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0034] 图1显示了rhMnSOD处理HL-60细胞48小时的抑制作用(0.5×104细胞/孔)。

[0035] 图2显示了rhMnSOD处理A549细胞48小时的抑制作用(0.5×104细胞/孔)。

具体实施方式

[0036] 本发明人经过广泛的研究，首次揭示了锰超氧化物歧化酶(Manganese Superoxide Dismutase，rhMn-SOD)在抗肿瘤方面的应用；并且，本发明人还发现锰超氧化物歧化酶对于部分肿瘤(艾氏腹水瘤，神经胶质瘤，子宫颈癌、肺癌或白血病)的抗肿瘤效果特别优异；并且，本发明人还发现锰超氧化物歧化酶与阿霉素联用可以更有效地起到抗肿瘤作用。

[0037] Mn-SOD

[0038] 如本文所用，术语“锰超氧化物歧化酶”、“Mn-SOD”、“MnSOD”可互换使用。

[0039] 如本文所用，术语“重组人锰超氧化物歧化酶”、“rhMn-SOD”、“重组人Mn-SOD”可互换使用，都指来源于人的经基因工程手段重组表达获得的锰超氧化物歧化酶。

[0040] 任何来源的Mn-SOD均可用于本发明。优选地，所述的Mn-SOD是人来源的。作为本发明的更优选方式，所述的Mn-SOD是重组人Mn-SOD。重组Mn-SOD表示通过重组体DNA方法和其他人工方法制备的重组多肽，它具有与任何天然存在的Mn-SOD相同的或基本上相同的氨基酸序列。重组人Mn-SOD是一种采用基因工程重组技术制备的人Mn-SOD，其具有的蛋白序列与GenBank登录号PID:g338286所示的序列基本上相同，其编码序列如GenBank登录号M36693.1所示的序列基本上相同。

[0041] 众所周知，根据已公开的Mn-SOD序列，本领域技术人员可以通过PCR扩增等方法制备Mn-SOD的编码序列，然后将其插入表达载体，进而转化常见的宿主细胞(如大肠杆菌)，就可以表达重组Mn-SOD。例如，通过IPTG诱导使得大肠杆菌表达Mn-SOD，然后回收该Mn-SOD。

[0042] Mn-SOD用途

[0043] 本发明提供了Mn-SOD的用途，用于制备预防或治疗肿瘤的组合物。

[0044] 为了论证Mn-SOD的上述用途。在动物水平上，本发明人以荷瘤小鼠作为研究模型。在用药rhMn-SOD后，发现rhMn-SOD可明显地抑制肿瘤的生长。在细胞水平上，本发明人以多种肿瘤细胞(包括神经胶质瘤细胞以及子宫颈癌细胞等)作为研究对象，结果发现给予肿瘤细胞rhMn-SOD后，可明显地抑制肿瘤细胞的生长。在实施例中，本发明人以EAC肿瘤模型作为实验模型，其是通用的治疗实体瘤抗肿瘤药物筛选模型。

[0045] 本发明还提供了含有Mn-SOD与阿霉素(ADR)的组合物的用途，用于制备预防或治疗肿瘤的组合物。

[0046] 本发明人的研究结果显示，Mn-SOD与ADR的联合用药具有显著的增效作用，其对肿瘤的抑制效果显著地优于分别单用Mn-SOD或ADR。

[0047] 本发明所述的肿瘤可选自：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、神经胶质瘤、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

[0048] 特别优选地，所述的肿瘤是：艾氏腹水瘤(EAC肿瘤)，神经胶质瘤，子宫颈癌，肺癌，白血病。Mn-SOD对于这些肿瘤具有异常良好的抑制作用。

[0049] 组合物

[0050] 本发明提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的Mn-SOD；(b)有效量的ADR；以及(c)药学上可接受的载体或赋形剂。优选地，所述的Mn-SOD是rhMn-SOD。

[0051] 本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

[0052] 本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

[0053] 本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的Mn-SOD或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。

[0054] 如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。

[0055] 作为本发明的优选方式，所述的药物组合物中，含有1-20重量份的锰超氧化物歧化酶；1-5重量份的ADR；和1-100重量份药学上可接受的载体。

[0056] 本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液。其中Mn-SOD可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。从药物的性质以及易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，如注射剂、混悬液或乳剂。

[0057] 本发明的Mn-SOD及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，Mn-SOD作为活性成分占总重量的1-50％(较佳地2-40％，更佳地3-30％)，其余为药学上可接受的载体以及其他添加剂等物质。

[0058] 给药方式和剂型

[0059] 本发明的药物组合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。

[0060] 通常，当所述化合物及其组合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约1-50％，通常约为2-40％(重量)的活性成分。

[0061] 所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的组合物中的活性组分(Mn-SOD和ADR的组合)每天以约0.1-100mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.5-500mg，较佳地约为1-200mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1-200mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

[0062] 所述化合物及其组合物可通过静脉内、肌内、皮下或口服等途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

[0063] 所述活性化合物及其组合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。

[0064] 适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。

[0065] 本发明的药物组合物还可与其它活性成分或药物联合给药。

[0066] 本发明的药物组合物可置于药盒中，便于本领域技术人员或医师使用。优选地，所述的药盒中还有本发明的药物组合物的使用说明。

[0067] 也可将Mn-SOD与阿霉素分别装于独立的容器中，置于药盒中。从而有利于灵活地给药，例如先给予阿霉素，之后再给予Mn-SOD。

[0068] 本发明的主要优点在于：

[0069] (1)首次发现了Mn-SOD在防治肿瘤方面的新用途，其药理作用强，且没有毒副作用，具有极好的药用前景。

[0070] (2)首次发现了Mn-SOD与ADR联合用药具有增效的抗肿瘤作用，且没有毒副作用。

[0071] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0072] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0073] 实施例1、rhMn-SOD对于实体瘤的抑瘤作用

[0074] 按全国抗癌药物筛选规程及新药临床前研究指导原则，选取健康且肿瘤生长旺盛(无坏死)EAC荷瘤小鼠(由中国药科大学动物室提供)拉断颈椎处死，经消毒后置于超净台中，在无菌条件下取出肿瘤组织，剪碎，加入生理盐水在研磨器中研磨制成细胞悬液，计8
数肿瘤细胞，将瘤细胞悬液调节成1×10 个/ml备用。

[0075] 取ICR小鼠(由中国药科大学动物室提供)60只，按移植性肿瘤研究法，接种EAC实体型瘤，每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml。接种后24h称鼠重，并随机分为9组，每组10只，雌雄各半。rhMn-SOD的表达、纯化按照本发明人已经发表的文章制备(陈车生，程贻，吴乾一等，重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究[J]，中国药科大学学报，2007，38(5)：472；程贻，陈车生，吴乾一等，重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究[J]，食品与药品，2007，9(7)：1)。

[0076] 实验设：

[0077] 对照组：0.2ml生理盐水；

[0078] rhMn-SOD 2个剂量组：2mg/kg、4mg/kg rhMn-SOD；

[0079] ADR组：2mg/kg ADR；

[0080] ADR联合用药2个剂量组：上述rhMn-SOD剂量分别与ADR 2mg/kg联用。

[0081] ADR用0.2ml生理盐水溶解，经小鼠尾静脉给药，rhMn-SOD用生理盐水稀释后腹腔注射，在联合用药组中，ADR给药后6h腹腔注射rhMn-SOD。于接种后24h给药，每天1次，连续6次。停药后第2天处死并称重荷瘤小鼠，分离瘤块称瘤重，计算抑瘤率。

[0082] 抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)×100％。

[0083] 由表1可知，与对照相比，所有用药组对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用。单用rhMn-SOD对EAC肿瘤的生长具有显著的抑制作用，且抑制作用随rhMn-SOD剂量的增加而增强。rhMn-SOD与ADR合用有增效作用，与ADR组相比，4mg/kg rhMn-SOD剂量的联合用药组的增效作用具有统计学意义(P＜0.05)。实验期间所有的动物存活且无明显行为异常。rhMn-SOD单用组的小鼠体重变化与对照组无显著差异，其余用药组小鼠体重变化与对照组相比均有明显差异，ADR联合用药组体重变化与ADR组相比无明显差异。

[0084] 表1rhMn-SOD单独使用及与ADR合用对小鼠EAC肿瘤的抑制作用(n＝10)[0085]

[0086] *表示：与对照组相比，P＜0.05；

[0087] **表示：与对照组相比，P＜0.01；

[0088] #表示：与ADR组相比，P＜0.05

[0089] ##表示：与ADR组相比，P＜0.01；

[0090] ！表示：与单独使用相同剂量rhMn-SOD组相比，P＜0.05。

[0091] 实施例2、rhMn-SOD在治疗宫颈癌、神经胶质瘤中的应用

[0092] 分别用24孔板培养正常人肝细胞L02(购自中科院生化所细胞库)，神经胶质瘤细胞C6(购自中科院生化所细胞库)以及人子宫颈癌细胞Hela(购自中科院生化所细胞库)，每种细胞都以不加rhMn-SOD作为对照，纯化后的rhMn-SOD对双蒸水充分透析除盐，0.2μm的滤膜抽滤除菌，rhMn-SOD的单位活力为5000U/ml，用培养基稀释rhMn-SOD，肿瘤细胞中加入不同浓度的rhMn-SOD，浓度分别为2500U/ml，1250U/ml，625U/ml，312.5U/ml，正常人肝细胞中加入浓度为2500U/ml的rhMn-SOD，每隔24h用血球计数板对各种细胞进行计数，同时拍摄各种细胞形态的变化。

[0093] 表2rhMn-SOD对神经胶质瘤细胞C6生长的影响

[0094]

[0095] 由表2可知，加入高浓度的rhMn-SOD可以使神经胶质瘤细胞数目迅速降低，而低浓度的rhMn-SOD对神经胶质瘤细胞的生长有抑制作用，使其生长速度与没加rhMn-SOD的肿瘤细胞相比变得较为缓慢。

[0096] 表3rhMn-SOD对子宫颈癌细胞Hela生长的影响

[0097]

[0098] 由表3可知，加入高浓度的rhMn-SOD可以使子宫颈癌细胞数目迅速降低，而低浓度的rhMn-SOD对子宫颈癌细胞的生长有抑制作用，使其生长速度与没加rhMn-SOD的肿瘤细胞相比变得较为缓慢。

[0099] 实施例3、rhMn-SOD在治疗肺癌及白血病中的应用

[0100] 1.细胞培养

[0101] 人肺腺癌A549细胞和人白血病HL-60细胞(均购于上海市药品检验所)于含5％CO2的37℃培养箱中培养传代，用含10％小牛血清及100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RMPI-1640培养液培养；用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化传代。

[0102] 2.MTT法测定肿瘤细胞存活率

[0103] 将对数生长期的人肺癌细胞A549用胰酶消化后配制成浓度为5×104细胞/ml的细胞悬液(人白血病细胞HL-60直接稀释为相应浓度)，将细胞接种于96孔板，每孔加100μl。次日加入含不同浓度rhMn-SOD及相应溶剂0.02mmol/L Tris-HCl对照的新鲜培养基，每孔加100μl，给药组设10个剂量组(5400、4320、3456、2764.8、2211.84、1769.472、
1415.578、1132.462、905.9697、724.7757U/mlrhMn-SOD)，并设一个溶剂对照组，每组至少设三个平行孔。于37℃继续培养48h后，每孔加20μl 5mg/ml的MTT(磷酸盐缓冲液配制)。
继续培养4h，弃上清，每孔加100μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用酶标仪在参考波长630nm，检测波长570nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50：

[0104]

[0105] 采用MTT法检测rhMn-SOD对肿瘤细胞生存活力的影响。MTT法观察rhMn-SOD对体外培养的人白血病细胞HL-60、人肺癌细胞A549生存活力的影响结果如表4。由表4及图1和图2可见：rhMn-SOD对HL-60细胞及A549细胞活力均有显著的抑制作用。

[0106] 表4rhMn-SOD对体外培养的HL-60细胞和A549细胞的抑制作用

[0107]

[0108] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。