一种布洛芬降解菌剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种布洛芬降解菌剂的制备方法，包括：(1)取污水处理厂二沉池的活性污泥接入培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；驯化后，静置，取上层水样，梯度稀释后划线分离，然后在培养，纯化，将分离出的菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养至对数生长期；(2)将上述培养好的菌种接入培养基培养，即得。本发明的方法简单，成本低；所得布洛芬降解菌剂使用方便，高效降解布洛芬，且菌株易于灭活，应用于水处理中的布洛芬的去除。

权利要求

1.一种布洛芬降解菌剂的制备方法，包括：

(1)取污水处理厂二沉池的活性污泥按5％-10％的接种量接入培养基中，以梯度压力式驯化法驯化，布洛芬浓度为10-35mg/L；驯化后，静置，取上层水样，梯度稀释后划线分离，然后在30℃-35℃培养48h-60h，纯化，将分离出的菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养至对数生长期；

(2)将上述培养好的菌种按10％-20％的接种量接入培养基培养，即得；

所述的培养过程中无菌空气的通气量化为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃；培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。

2.根据权利要求1所述的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的培养基配方为：K2HPO4 4.35g，KH2PO4 1.7g，NH4Cl 2.1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8-7.0。

3.根据权利要求1所述的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的驯化条件为搅拌速度160-240转/分，温度30-35℃，时间1-2个月。

4.根据权利要求1所述的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝

7.0～7.2。

5.根据权利要求1所述的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的布洛芬的浓度为10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L。

6.根据权利要求1所述的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的培养基配方为：蔗糖10g/L，牛肉膏3g/L，KH2PO4 1.7g/L，NH4Cl 2.1g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 0.3g/L，pH＝7.0-7.5，布洛芬10-35mg/L。

说明书

一种布洛芬降解菌剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属布洛芬降解菌剂的制备领域，特别是涉及一种布洛芬降解菌剂的制备方法。

背景技术

[0002] 药物及个人护理品(Pharmaceutical and Personal Care Products，简称PPCPs)作为一种新兴污染物日益受到人们的关注。药物和个人护理用品即使微量存在，仍具有相当程度的生物活性，给环境造成不可预测的影响，并可能通过饮用水和食物等途径对人体健康产生潜在危害。

[0003] 在常见的PPCPs化合物中，抗生素、消炎药、抗癫痫药物、调节血脂药在各类环境介质中的检出频率较高。其中非甾体解热镇痛及抗炎药物布洛芬(Ibuprofen，分子结构如图1)作为非处方药，被大量使用，是目前最受关注的PPCPs类污染物之一。

[0004] 传统的活性污泥法，因地域不同，对布洛芬的降解效率不一。photo-Fenton法降解布洛芬的产物，毒性反而增强。研究表明，布洛芬的去除率与微生物菌种密切相关。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种布洛芬降解菌剂的制备方法，该方法简单，成本低；所得布洛芬降解菌剂使用方便，高效降解布洛芬，且菌株易于灭活。

[0006] 本发明中的一种用于增强去除污水中布洛芬的能力的高效降解布洛芬菌株，是一种革兰氏染色反应阴性菌株BL-1，经鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。主要生-物学特性为G，菌体呈短杆状，无芽胞，大小约1.54×1.08μm，具周生鞭毛，兼性好氧；V-P反应、过氧化氢酶，硝酸盐反应、明胶液化试验阳性，甲基红试验、氧化酶、苯丙氨酸反应、硫化氢试验阴性；能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，不能利用乳糖产酸；该菌株在紫外线照射2h后，均已失去活性。该菌株16S rRNA的Genbank登录号为HM136577。

[0007] 本发明的一种布洛芬降解菌剂的制备方法，包括：

[0008] (1)取污水处理厂二沉池的活性污泥按5％-10％的接种量接入培养基中，以梯度压力式驯化法驯化，布洛芬浓度为10-35mg/L；驯化后，静置，取上层水样，梯度稀释后划线分离，然后在30℃-35℃培养48h-60h，纯化，将分离出的菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养至对数生长期；

[0009] (2)将上述培养好的菌种按10％-20％的接种量接入培养基培养，即得；

[0010] 所述的培养过程中无菌空气的通气量化为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃；培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

[0011] 所述步骤(1)中的培养基配方为：K2HPO4 4.35g，KH2PO4 1.7g，NH4Cl 2.1g，MgSO40.2g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8-7.0。

[0012] 所述步骤(1)中的驯化条件为搅拌速度160-240转/分，温度30-35℃，时间1-2个月。

[0013] 所述步骤(1)中的牛肉膏蛋白胨培养基为：牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。

[0014] 所述步骤(1)中的布洛芬的浓度为10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L。

[0015] 所述步骤(2)中的培养基配方为：蔗糖10g/L，牛肉膏3g/L，KH2PO4 1.7g/L，NH4Cl2.1g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 0.3g/L，pH＝7.0-7.5，布洛芬10-35mg/L。

[0016] 所得菌株应用于水处理中的布洛芬的去除。

[0017] 本发明借助生物强化技术的思想，从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中经驯化、富集分离、纯化后，得到一株对布洛芬具有高效降解作用的细菌。该菌株来源于废水处理系统，因此该菌株能适应复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔。

[0018] 有益效果

[0019] (1)本发明的制备方法简单，成本低；所得布洛芬降解菌剂使用方便，高效降解布洛芬，且菌株易于灭活，保证了使用的生态安全性；本发明对于改善和保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要意义；

[0020] (2)小型污水处理设施(曝气生物滤池)结果表明，用本发明生产的菌剂可以明显提高布洛芬的去除效率。

附图说明

[0021] 图1布洛芬的化学结构；

[0022] 图2菌体电镜照片；

[0023] 图3未降解(a)和降解(b)样品的GC-MS总离子色谱图；

[0024] 图4曝气生物滤池装置图。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0026] 实施例1

[0027] 1.菌株的分离和鉴定

[0028] (1)取自城市污水处理厂二沉池的活性污泥按5％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化，布洛芬浓度为10、15、20、25、30、35mg/L，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月。无机盐培养基配方为K2HPO4 4.35g，KH2PO4 1.7g，NH4Cl 2.1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O0.01g，CaCl2·2H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8-7.0。

[0029] (2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样1mL，梯度稀释后在平板上划线分离。然后在30℃培养箱中培养48h。挑取形态清晰的单一菌落，编号，并反复纯化，将分离出的菌株接种到斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中待后续进行降解试验。其中富集培养基为牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。固体培养基中加入17g/L的琼脂粉。

[0030] (3)分别挑取一定量的经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有15mg/L的布洛芬，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为48h。培养后测定溶液中布洛芬的剩余浓度，从而确定出对布洛芬具有高效降解作用的菌株BL-1；

[0031] 所述的无机培养基为蔗糖10g/L，牛肉膏3g/L，KH2PO4 1.7g/L，NH4Cl 2.1g/L，MgSO40.2g/L，CaCO3 0.3g/L，pH＝7.0-7.5，布洛芬15mg/L。

[0032] (4)经生理生化鉴定和16S rRNA序列分析和同源性比较，菌株BL-1被初步鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。主要生物学特性为G，菌体呈短杆状，无芽胞，大小约1.54×1.08μm，具周生鞭毛，兼性好氧；V-P反应、过氧化氢酶，硝酸盐反应、明胶液化试验阳性，甲基红试验、氧化酶、苯丙氨酸反应、硫化氢试验阴性；能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖产酸，不能利用乳糖产酸；该菌株在紫外线照射2h后，均已失去活性。该菌株16S rRNA的Genbank登录号为HM136577。

[0033] 2.实验室布洛芬降解试验

[0034] 本发明所提供的一株布洛芬高效降解菌在初始pH值为7.左右，温度为30℃，振荡速率为160r/min，250mL锥形瓶的装液量为100mL的条件下，菌株接种量为0.6％，布洛芬初始浓度为15mg/L，培养时间48h，布洛芬的降解率高达90％。

[0035] 3.小型污水处理设施(曝气生物滤池)的强化试验

[0036] 将发酵的菌液按2％的比例，在进水水温15.6℃～24.5℃，pH 6.88～7.27的条3 2
件下，进水负荷为0.2m/m·h，气水比为1.5∶1时，投加了菌剂的曝气生物滤池中布洛芬的去除率为86％～91％。而没有投加菌剂的曝气生物滤池中布洛芬的去除率为48％～
53％。