一种免疫抑制剂及其组合物

摘要

本发明公开了一种新型免疫抑制剂及其组合物。该免疫抑制剂为槲皮苷，具有免疫抑制效果好，毒性小的特点，可应用在制备治疗自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应，以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病的药品上，具体可用于治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血等疾病。

权利要求

1.槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，所述槲皮苷的分子结构式为：

其中R为鼠李糖基。

2.如权利要求1所述的槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，所述的药品用于治疗自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应，以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病。

3.如权利要求2所述的槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，所述的自身免疫性疾病选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、银屑病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、青少年型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肾病综合征、葡萄膜炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症。

4.如权利要求1所述的槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，其特征是以所述槲皮苷为活性成分，加入医用辅料，制成任何一种剂型的药剂。

5.如权利要求4所述的槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，其特征是所述剂型选自注射剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂及高度分散剂型。

6.如权利要求4所述的槲皮苷在制备免疫抑制药品上的应用，其特征是所述剂型选自乳剂、自乳化系统。

说明书

一种免疫抑制剂及其组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，特别涉及一种具有免疫抑制作用的化合物及其组合物，所述化合物为槲皮苷。

背景技术

[0002] 免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物，可抑制机体异常的免疫反应，目前已广泛用于器官移植(如心、肝、肾、肺、骨髓、皮肤移植等)、抗排斥反应、自身免疫性疾病、新生儿的Rh溶血和过敏反应的治疗。目前临床应用的免疫抑制剂主要包括有机合成化合物、生物工程产品和基因工程产品。有机合成的免疫抑制剂包括类固醇类药物和抗肿瘤药物。后者包括烷化剂和抗代谢药物，如硫唑嘌呤、环磷酰胺、氨甲蝶呤等。此类药物对免疫的多个环节均有抑制作用，但其不良反应严重，为减少不良反应，临床上多与其他免疫抑制剂合用。由于该类药物应用常伴随肾毒性、神经病变等毒副作用，也存在生产复杂，口服吸收差等诸多问题，限制了临床上的广泛应用。生物工程类免疫抑制剂包括环孢素A(CsA)、他可莫司(FK-506)、雷帕霉素、咪唑立宾，但部分药物的副作用也比较强，联合使用时可能还会增强副作用。生物工程类免疫抑制剂如赛尼哌，它是移植领域中第一个人源化单克隆抗体，但价格昂贵。

[0003] 中药是我国传统文化的瑰宝。随着现代医药技术的不断发展，中药的应用和研究又爆发出新的生命力。对中药的现代医学研究主要是从中药中提取有效部位和单体成分。目前已发现一些有免疫抑制作用的中药，如雷公藤、 红花、山茱萸、青藤、白芍。从雷公藤中至今已分离出70多种化学成分，包括生物碱、二萜类、三萜类、倍半萜、苷类、有机酸类和卫矛醇类等。雷公藤作为免疫抑制剂进行治疗时可产生副作用，其副作用主要来自于二萜类，其次为生物碱，药物剂型不同，雷公藤产生的毒副反应差异较大。目前常用雷公藤的三种提取部位，包括水煎剂、酒精浸膏、多苷。红花总黄素是从红花中提取的查耳酮类化合物，有实验表明其能减少脾特异性玫瑰花形成细胞，降低空斑形成细胞的溶血能力，对人血T、B细胞转化均有抑制作用。山茱萸总苷是从山茱萸科植物山茱萸果肉中提取的有效成分。山茱萸总苷不同剂量均可抑制T淋巴细胞增殖。青藤碱是从防己科植物青藤或汉防己(Sinomenium Acutum Rehderett Wilson)的干燥根中提取的生物碱单体。最新研究发现青藤碱与霉酚酸酯、FK506协同能抑制人T细胞激活和IL-2的合成。白芍为毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根。白芍是常用的传统中药，性微寒，味苦、酸，有养血柔肝、缓急止痛、保肝、抗氧化、促进淋巴细胞转化率等作用。药理研究表明，白芍总苷还有抗炎缓痛、抗应激和异常免疫功能的双向调节等作用，属于慢作用抗风湿药物。 [0004] 槲皮苷可从某些植物中提取得到。在研究槲皮苷对三硝基苯磺酸诱导的大鼠急慢性结肠炎的抗炎作用过程中，证明其具有抑制急性炎症的作用。在以延长小鼠戊巴比妥钠所致的睡眠时间为指标的催眠实验来进行槲皮苷的镇静活性评价，研究发现槲皮苷具有明显的镇静活性；也有研究发现槲皮苷具有很强的体外抑制单胺氧化酶A(MAO-A)活性的能力，被认为是潜在的抗抑郁剂。目前国内外对其免疫抑制作用未见有报道。

[0005] 药物制剂的剂型有很多种，如常用的片剂、胶囊、微丸、混悬液等，但高度分散剂型对于药物的给药有特殊优势。高度分散剂型包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、微粒、纳米粒、乳剂、胶束、纳米凝胶等。

[0006] 脂质体(Liposomes)是一种由磷脂双分子层构成的泡囊(Vesicles)，是 一种可以在水溶液中高度分散的传递系统，可以作为很多种药物的载体。它的高度分散性使其在体内具有靶向、缓释等效果，口服具有淋巴趋向性，较易携带药物穿越血脑屏障，容易通过融合、内吞等途径进入细胞内。修饰后的磷脂组成的脂质体还可以有体内长循环、温度靶向、pH靶向、磁靶向、主动靶向等功能。脂质体的局部(眼、鼻、皮肤)给药有生物相容性好、促进药物渗透的作用。脂质体还是生物化学和分子生物学研究领域中经常使用的一种转染试剂，现在还是基因治疗的一种重要载体。

[0007] 脂质体泡囊的磷脂双分子层膜将内部包裹的水相和外部水相隔开，双分子层内呈疏水性。药物根据其物理化学性质的不同分别包裹在内水相或膜中。一般地，水溶性药物在内水相中；脂溶性药物在膜层中。脂质体的制备是磷脂分子在水中自组装的过程，内外水相的体积比例不能很大。

[0008] 非离子表面活性剂泡囊(Niosomes)是指某些非离子表面活性剂(如司盘60)在一定条件下在水中自组装成泡囊结构，类似脂质体。它同样可以作为药物载体，具有类似脂质体的一些体内外特征。

[0009] 微粒(Microparticles)一般指粒径在微米级的粒子，范围可从1微米到1000微米。由于其高度分散性，在体内可产生黏附，高的表面积也有助于药物特别是脂溶性药物的溶出，也能产生控释效果。微球(Microspheres)一般指药物溶解或分散在基质中的微粒。将固体药物或液体药物作囊心物包裹而成药库型微小胶囊称微囊(Microcapsules)(陆彬主编.药物新剂型与新技术.北京：人民卫生出版社，1998)。

[0010] 纳米粒(Nanoparticles)一般指是纳米级分散的固体粒子，由于其高度分散性，它作为药物载体有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。固体脂质纳米粒(SLN)采用人体相容的脂质材料作为主要辅料形成纳米粒，具有普通纳米粒的特点和生物相容性好的特点，近年来研究较多。纳米囊(Nanocapsules)特指药物包裹在成膜材料中形成的纳米粒子，同样具有纳米 粒的体内外特点。

[0011] 乳剂常用作脂溶性药物的传递系统，在体内具有靶向性、缓释和控释效果。乳剂的粒径分布范围很广，从数微米到纳米级。纳米乳(Nanoemulsions)是指粒径在200纳米以下的乳滴组成的体系，可以将脂溶性药物包裹在乳滴中。由于其高度分散性，它作为药物载体同样有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。而微乳(Microemulsions)是指粒径在100纳米以下的乳滴组成的体系，同样具有纳米乳的特点。

[0012] 胶束(Micelles)对药物，特别是脂溶性药物有很好的增溶作用，可用作药物传递系统。近年来，聚合物胶束作为传递系统的作用越来越受到重视。

[0013] 纳米凝胶(Nanogels)是近年来开始被研究的一种纳米传递系统，药物包裹在内部，并显示出纳米粒子的体内外特点。

发明内容

[0014] 本发明人出乎意料地发现槲皮苷具有强的免疫抑制作用，并且最有意义的是它的毒性非常小。因此本发明公开了一种具有免疫抑制作用的化合物，其特征在于所述化合物为槲皮苷，其分子结构特征为：

[0015]

[0016] 其中R为糖基分子。

[0017] 如前所述槲皮苷广泛存在于各种植物中，包括某些中药、蔬菜、果实等，选自猴耳环、猫儿刺、银杏叶、大叶蛇葡萄、松叶防风、四川寄生、田基黄、合欢花、藜芦、南蛇藤茎、罗布麻叶、鱼腥草、阳春砂仁、锁阳、芦丁、红 旱莲、红八角莲、沙棘果、槲寄生、桑寄生、马鞭草、满山白、桑叶、侧柏叶、玫瑰花、月季花、火炭母、篇蓄、金钱草、黄蜀葵花、水红花子、虎耳草、菟丝子、辣木叶、青钱柳、贯叶连翘、金丝桃、唐松草、头花蓼。通过常规的有效成分提取技术就可以得到槲皮苷。对提取工艺进行优化后可以得到较纯的槲皮苷，可用于药物的进一步加工，如制备成各种剂型的组合物。很多公开的文献已报道了如何从植物中提取得到槲皮苷，并进行纯化。

[0018] 一般地，对植物中槲皮苷的提取工艺可以如下操作：将植物或药材粉碎，经过一至多次醇水溶液提取，滤过，合并滤液；滤液浓缩成浸膏，浸膏有机溶剂沉淀后上柱或直接上柱，进行柱分离，有机溶剂洗脱，并在有机溶剂中重结晶，挥干溶剂，得槲皮苷单体。对提取工艺过程进行优化，如提取溶剂组成、量、温度、速率，柱填料型号、量，可以得到较高收率(80％以上)的槲皮苷。

[0019] 本发明中的槲皮苷分子结构中含有槲皮素基团和糖基R。糖基R可源于各种糖分子。糖基R可源于单糖、二糖、寡糖。糖基R可选自葡萄糖基、鼠李糖基、半乳糖基、芸香糖基、桑布双糖基、二葡糖基、芹菜糖基芦丁糖基、木糖基、阿拉伯糖基，优选的是葡萄糖基、鼠李糖基，更优选的是鼠李糖基。具体地，本发明中的槲皮苷选自槲皮素葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷、槲皮素半乳糖苷、槲皮素芸香糖苷、槲皮素桑布双糖苷、槲皮素二葡糖苷、槲皮素芹菜糖基芦丁糖苷、槲皮素木糖苷、槲皮素阿拉伯糖苷，优选的是槲皮素葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷，更优选的是槲皮素鼠李糖苷。

[0020] 本发明中的槲皮苷经细胞和动物实验验证，具有显著的免疫抑制作用，且毒性小。实验证明槲皮苷能抑制刀豆蛋白A(ConA)诱导的T淋巴细胞增殖和脂多糖(LPS)诱导的B淋巴细胞增殖，并且对单向混合淋巴细胞反应也表现出明显的抑制作用。在整体动物水平上槲皮苷能缓解迟发型超敏反应的炎性症状，并且可以抑制同种异体器官移植排斥反应，且在细胞和整体动 物水平均显示极低毒性。槲皮苷具有显著的免疫抑制作用，因此可作为一种新型免疫抑制剂，用于预防和治疗免疫相关的疾病，如自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应，以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病。因此本发明公开了槲皮苷及其组合物在制备治疗自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应，以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病的药品上的应用，优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗自身免疫性疾病、器官移植后的排斥反应的药品上的应用，更优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药品上的应用。

[0021] 自身免疫性疾病可涉及人体各个组织，包括结缔组织疾病、神经肌肉疾病、内分泌性疾病、消化系统疾病、泌尿系统疾病、血液系统疾病，具体疾病种类选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、银屑病、多发性硬化症、重症肌无力、脱髓鞘疾病、原发性肾上腺皮质萎缩、慢性甲状炎、青少年型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血与萎缩性胃炎、自身免疫性肾小球肾炎、肾病综合征、慢性肾小球肾炎、葡萄膜炎、肺肾出血性综合症、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症。本发明公开了槲皮苷及其组合物在制备治疗自身免疫性疾病的药品上的应用，优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化症、重症肌无力、青少年型糖尿病、慢性非特异性溃疡性结肠炎、慢性活动性肝炎、恶习性贫血、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症的药品上的应用，更优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白细胞减少症的药品上的应用，最优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肾小球肾炎、自身免疫性溶血性贫血 的药品上的应用。

[0022] 器官移植可产生严重的排斥反应。器官移植可涉及人体各种器官，包括心、肝、脾、肺、肾、胰、骨髓、角膜、皮肤、关节、骨、四肢，但随着医疗科技的发展，器官移植的范围越来越大。本发明公开了槲皮苷及其组合物在制备治疗器官移植后的排斥反应的药品上的应用，优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗肝、肾、骨髓移植后的排斥反应的药品上的应用，更优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗肾、骨髓移植后的排斥反应的药品上的应用，最优选的是槲皮苷及其组合物在制备治疗肾移植后的排斥反应的药品上的应用。 [0023] 无论从细胞水平还是整体水平，槲皮苷在发挥作用的同时都显示出极低的毒性。临床上进行器官移植或治疗免疫相关疾病的病人都需长期使用免疫抑制剂，药物的毒性是影响药物能否长期使用的重要因素。槲皮苷作为一种高效、低毒的免疫抑制剂，具有很强的开发价值。

[0024] 本发明公开的槲皮苷及其组合物可应用在制备治疗自身免疫性疾病、过敏反应和器官移植后的排斥反应，以及与机体免疫系统功能及反应状态异常相关的疾病的药品上。 [0025] 本发明中的槲皮苷可制备成各种形式的组合物，其特征是以所述化合物(槲皮苷)为活性成分，加入医用辅料，制成任何一种剂型的药剂。具体剂型可选自注射剂、口服液、片剂、胶囊剂、颗粒剂。槲皮苷还可以制备成缓释制剂、固体分散体等剂型达到长效或速效，并提高吸收的效果。

[0026] 将适量槲皮苷溶于水，或添加适当助溶剂、增溶剂后，获得其注射剂。助溶剂可选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、乙醇胺、二乙胺。增溶剂一般为表面活性剂，可选自吐温、泊洛沙姆、卞泽、磷脂、聚氧乙烯蓖麻油。具体型号例如吐温20、吐温60、吐温80、泊洛沙姆P188。注射剂中还可添加等渗调节剂、缓冲剂、抗菌剂、抗氧化剂。等渗调节剂如氯化钠、葡萄糖、 甘油。缓冲剂如磷酸盐、醋酸-醋酸钠、枸橼酸-枸橼酸钠。抗菌剂如三氯叔丁醇。抗氧化剂如亚硫氢酸钠。对于不同糖基类型的槲皮苷，一般根据它们在水和其它混合溶剂中的溶解情况，可筛选处合适的处方，制备得到稳定的注射剂。水中溶解度小的槲皮苷还可以制备成混悬型注射剂，此时分散介质一般为水或水溶液，助悬剂可选自羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素、壳聚糖、海藻酸钠、聚维酮。混悬型注射剂注射后可产生缓释效果。含槲皮苷的口服液的处方与其注射剂类似，选择的辅料范围更广。本专业技术人员参考常规制备工艺手段就可以得到槲皮苷的注射剂和口服液。

[0027] 含槲皮苷的片剂可参考本专业一般技术制备得到。本专业技术人员根据具体槲皮苷的物理化学性质，包括溶解性、润湿性、密度等，选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的片剂。同样含槲皮苷的胶囊剂、颗粒剂可参考本专业一般技术制备得到。 [0028] 根据药物体内药效的需要，本发明中的槲皮苷还可制备成高度分散剂型。本发明中含槲皮苷的高度分散剂型，其粒子成高度分散状态，一般地粒子直径小于1000微米，优选的粒子直径小于100微米，更优选的粒子直径小于1微米，进一步优选的是小于0.5微米，更进一步优选的是小于0.2微米。高度分散剂型一般以水性分散液的形式存在并给药，也可以经过适当处理如干燥过程获得固态或半固态形式。高度分散剂型选自脂质体、纳米粒、纳米乳、微乳、自微乳化系统、脂质体、非离子表面活性剂泡囊、微粒、纳米粒、乳剂、自乳化系统、胶束、纳米凝胶。高度分散剂型根据其具体组成和给药途径，在体内会表现出促吸收、靶向、缓释或控释等作用。

[0029] 含槲皮苷的脂质体制备方法可参考相关文献和专业技术(如：New RRCed.Liposome：a practical approach.Oxford：Oxford University Press，1990；邓英杰.脂质体技术.北京：人民卫生出版社，2007)。一般地，如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将槲皮苷与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中， 减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。如果超声时间延长，还可能得到纳米级分散系统。如果采用反相蒸发法制备脂质体，可以将槲皮苷与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，加入水或缓冲液，高速搅拌或超声制备成乳剂，然后减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，然后加入水或适当缓冲液或不加，继续减压旋转蒸发，直至形成均匀的脂质体混悬液。脂质体混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固态，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到脂质体混悬液。运用相似的技术可以获得含槲皮苷的非离子表面活性剂泡囊。选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的脂质体和非离子表面活性剂泡囊。

[0030] 含槲皮苷的微粒包括微球和微囊。微球的制备方法可参考相关文献和专业技术(如：Perez MH，et al.The preparation and evaluation ofpoly(e-caprolactone)microparticles containing both a lipophilic and a hydrophilicdrug.J Controlled Rel，2000，65：429-438)。一般地，可将药物与聚合物共同溶于有机溶剂中，然后利用O/W乳化法制备得到微球。还有很多其他制备微球的方法，在许多文献中都可以找到(如：Freiberg S，Zhu XX.Polymermicrospheres for controlled drug release.Int J Pharm，
2004，282：1-18)，包括单体聚合法、溶剂挥发法、喷雾干燥法。微囊的制备方法包括相分离法、液中干燥法、喷雾干燥法等(如：陆彬主编.药物新剂型与新技术.北京：人民卫生出版社，1998)。选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的微粒。

[0031] 含槲皮苷的纳米粒制备方法有很多种，文献也很多，根据纳米粒的材料和要求不同，可参考相关文献和专业技术(如：Nanoparticles A Review.Mohanraj VJ，Chen Y. Tropic J Pharm Res，2006，5(1)：561-573；Yiguang Jin.Nanotechnology in pharmaceutical manufacturing，in：(Shayne Cox Gad，ed.)Pharmaceutical Manufacturing Handbook.John Wiley and Sons，Inc.，2008， 1251-1290)一般地，聚合物纳米粒的制备方法包括聚合法、沉淀法、溶剂挥发法、盐析法；固体脂质纳米粒(SLN)的制备方法包括高压乳匀法、微乳法、溶剂挥发法；无机纳米粒的制备方法包括沉淀法。纳米囊的方法一般地包括单体界面聚合法和聚合物界面纳米沉积法。含槲皮苷的纳米粒混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到纳米粒混悬液。选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的纳米粒。

[0032] 固体脂质纳米粒作为含槲皮苷的纳米粒剂型的优选。一般地，将槲皮苷与常温下为固态的脂质，如磷脂、脂肪酸、甘油酯，共同加热熔融，然后加入水或适当缓冲液，在加热情况下在高压乳匀机上循环乳化多次，形成纳米分散的乳滴，迅速冷却，使之固化，即得到含槲皮苷的固体脂质纳米粒。用微乳法也可制得含槲皮苷的固体脂质纳米粒。 [0033] 含槲皮苷的乳剂制备方法可参考相关文献和专业技术(如：陆彬主编.药物新剂型与新技术.北京：人民卫生出版社，1998)。一般地，需要添加乳化剂、油相，采用各种乳化设备(如电动搅拌器、胶体磨、超声波乳化器、高速搅拌器、高压乳匀机)进行分散制得。选择适当处方后，乳剂还可以干燥形成干乳，临用前配置重新形成乳剂。设计适当处方后，还可以制备得到自乳化系统(如：Gursoy RN，et al.Self-emulsifying drug delivery systems(SEDDS)for improved oral delivery of lipophilic drugs.Biomed Pharmacother，2004，58：173-182)。纳米乳和微乳是较特殊的乳剂。纳米乳的粒径主要分布在200nm以下；而微乳的粒径主要分布在100nm以下。含槲皮苷的纳米乳制备参考相应文献(如：Solans C，et al.Nano-emulsions.Curr Opin Colloid Interface Sci，2005，10：102-110)。含槲皮苷的微乳制备可以参考相应文献。一般地，在微乳中包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相、水相、药物。一般在选择合适的处方后，即可容易地形成微乳。如果选择合适的处方，一般包括乳化剂、 助乳化剂、助溶剂、油相，还可以组成自微乳化系统，在加入适量水溶液后，系统可以自行分散成微乳。选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的乳剂。

[0034] 含槲皮苷的胶束制备可以参考相应文献。聚合物胶束在本发明中作为优选，其制备方法参考相应文献(如：Torchilin VP.Micellar nanocarriers：Pharmaceutical perspectives.Pharm Res，2007，24：1-16；Liu J，Lee H，Allen C.Formulation of Drugs in Block Copolymer Micelles：Drug Loading and Release.Curr Pharm Des，2006，12，4685-4701)，一般地包括透析法、乳化法、薄膜分散法。选择合适的处方和工艺就可以得到较理想的含槲皮苷的胶束。

[0035] 含槲皮苷的纳米凝胶制备可以参考相应文献(如：Shin Y，et al.Hybridnanogels for sustainable positive thermosensitive drug release.J Controlled Rel，2001，73：1-6)。一般采用具有两亲性的共聚物分散在水中形成。

[0036] 本发明中含槲皮苷的高度分散剂型，如果其组成或表面吸附有高度亲水的分子或分子片断，由于在体外环境或体内环境可以形成亲水性保护层，可以阻滞粒子间的聚合或在体内阻滞调理化作用而获得长循环效果。常用的亲水性分子或分子片断是聚乙二醇(PEG)。在本发明中，可以采用添加带有聚乙二醇链的脂肪类衍生物如聚乙二醇化磷脂、聚乙二醇化胆固醇、聚山梨酯的方法制备得到表面亲水的槲皮苷的高度分散剂型。 具体实施方式

[0037] 下面结合实施例和实验例对本发明作进一步阐述，但这些实施例并不是对本发明的任何限制。

[0038] 实施例1.槲皮素鼠李糖苷的分离纯化

[0039] 取干燥合欢花粉碎至10～40目，以70％～90％乙醇渗漉提取，收集约生 药量的10倍量渗漉液，减压回收得浸膏，依次以石油醚(bp 60～90℃)、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，合并各次萃取液，减压得各部分浸膏。取乙酸乙酯部分浸膏，硅胶柱层析(氯仿∶甲醇，范围从100∶1～0∶1梯度洗脱)，经重结晶，得到黄色粉末。盐酸-镁粉反应显红色、Molish反应显阳性。结晶经聚酰胺薄膜层析，采用多种展开剂展开，其色谱行为与标准品槲皮素鼠李糖苷完全一致。经HPLC分析，与标准品色谱行为一致，确认该化合物为槲皮素鼠李糖苷。其化学式C21H20O11，分子量为448.38，分子结构式如下：

[0040]

[0041] 除合欢花外，还可以采用其它植物，在上述说明书内容中已经列举。其它槲皮苷，如槲皮素葡萄糖苷、槲皮素鼠李糖苷、槲皮素半乳糖苷、槲皮素芸香糖苷、槲皮素桑布双糖苷、槲皮素二葡糖苷、槲皮素芹菜糖基芦丁糖苷、槲皮素木糖苷、槲皮素阿拉伯糖苷可采用类似提取步骤得到。

[0042] 实施例2.槲皮素葡萄糖苷注射剂

[0043] 处方：

[0044] 槲皮素葡萄糖苷 10g

[0045] 吐温80 8ml

[0046] 乙醇 20ml

[0047] 亚硫酸氢钠 0.2g

[0048] 注射用水加至100ml

[0049] 取槲皮素葡萄糖苷、吐温80、乙醇搅拌溶解，搅拌下缓慢加入含亚硫酸氢钠的注射用水，得澄清溶液。分装至100支玻璃安瓿中，灌封后灭菌。每支注射剂含100mg槲皮素葡萄糖苷。

[0050] 用类似的处方和工艺可以得到其它槲皮苷，包括槲皮素鼠李糖苷、槲皮素半乳糖苷、槲皮素芸香糖苷、槲皮素桑布双糖苷、槲皮素二葡糖苷、槲皮素芹菜糖基芦丁糖苷、槲皮素木糖苷、槲皮素阿拉伯糖苷的注射剂。

[0051] 实施例3.槲皮素鼠李糖苷片剂

[0052] 处方：

[0053] 槲皮素鼠李糖苷 10g

[0054] 乳糖 100g

[0055] 玉米淀粉 20g

[0056] 羧甲基淀粉钠 8g

[0057] 聚乙烯吡咯烷酮 2g

[0058] 硬脂酸镁 0.5g

[0059] 取槲皮素鼠李糖苷、乳糖共同粉碎，过100目筛，然后与玉米淀粉、一半量羧甲基淀粉钠混合均匀，取10％聚乙烯吡咯烷酮水溶液制软材，过20目筛制备湿颗粒，在60℃干燥，干颗粒用20目筛整粒，与另一半量羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁混合均匀，用7mm浅凹冲压片，平均片重为140mg。每片含100mg槲皮素鼠李糖苷。该片剂在水中迅速崩解，在37℃水中45分钟内槲皮素鼠李糖苷溶出超过80％。

[0060] 用类似的处方和工艺可以得到其它槲皮苷的片剂。

[0061] 实施例4.槲皮素葡萄糖苷胶囊剂

[0062] 处方：

[0063] 槲皮素葡萄糖苷 10g

[0064] 乳糖 100g

[0065] 玉米淀粉 20g

[0066] 羧甲基淀粉钠 4g

[0067] 聚乙烯吡咯烷酮 2g

[0068] 取槲皮素葡萄糖苷、乳糖共同粉碎，过100目筛，然后与玉米淀粉、羧甲基淀粉钠混合均匀，取10％聚乙烯吡咯烷酮水溶液制软材，过20目筛制备湿颗粒，在60℃干燥，干颗粒用20目筛整粒，装于硬胶囊壳内。胶囊内容物平均重为135mg。每粒胶囊含100mg槲皮素葡萄糖苷。该胶囊在37℃水中45分钟内槲皮素葡萄糖苷溶出超过75％。

[0069] 用类似的处方和工艺可以得到其它槲皮苷的胶囊剂。

[0070] 槲皮苷颗粒剂的处方和工艺与胶囊剂类似。

[0071] 实施例5.槲皮素鼠李糖苷乳剂

[0072] 取槲皮素鼠李糖苷、泊洛沙姆P188、玉米油、丙二醇加热，全溶，溶液缓慢滴入搅拌着的pH7.4磷酸缓冲液中，得到乳剂。该乳剂经过高压乳匀机循环乳化3次，得到乳滴粒径小于1微米的乳剂。该乳剂灌封于安瓿内，经过100℃加热30分钟加热。取样观察，绝大部分乳滴粒径小于5微米。该乳剂在室温放置可保持较长时间稳定。该乳剂可用于静脉注射、肌肉注射，也可以用于口服。

[0073] 用类似的处方和工艺可以得到其它槲皮苷的乳剂。

[0074] 实施例6.槲皮素葡萄糖苷自乳化系统

[0075] 取槲皮素葡萄糖苷(5g)、为油酸(5g)、吐温80(12g)、1，2-丙二醇(12g)混合，加热全溶，冷却至室温后，制备成软胶囊，即为槲皮素葡萄糖苷自乳化系统。该软胶囊放于37℃水中，稍搅拌，可在5分钟内形成均匀乳剂。

[0076] 用类似的处方和工艺可以得到其它槲皮苷的自乳化系统。

[0077] 以下是关于槲皮苷免疫抑制剂作用和毒性的实验例。

[0078] 实验例1.槲皮素鼠李糖苷的小鼠体外脾淋巴细胞转化实验

[0079] 实验方法：BALB/c小鼠处死，取脾脏，1640培养基(含20％FBS)制成细胞悬液，调整细胞密度。槲皮素鼠李糖苷每孔加入100μL细胞悬液、90μL的各浓度的药物和10μL的ConA/LPS，共同孵育，并设置空白对照、细胞对照和药物对照组。设三个时间点24h、48h、72h，将孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。待培养结束时，从各孔小心吸出上清，再加入10μL MTT，继续放入培养箱中孵育。4小时后，各孔再加入100μL甲臜裂解液，放回培养箱中孵育过夜，于酶标仪上在吸收波长为570nm参比波长为630nm的条件下读取OD值，计算细胞生长抑制率。

[0080] 实验结果：分析实验数据可知，槲皮素鼠李糖苷对刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠T淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用，这种抑制作用和时间、剂量有依赖性关系。剂量越高，时间越长，抑制越明显(见表1)。槲皮素鼠李糖苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠B淋巴细胞的增殖也有较明显的抑制作用(见表2)。

[0081] 其它槲皮苷也显示出类似的对小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖的明显抑制作用。

[0082] 表1.槲皮素鼠李糖苷对ConA诱导小鼠T淋巴细胞增殖的抑制作用

[0083]

[0084] 表2.槲皮素鼠李糖苷对LPS诱导的B淋巴细胞增殖的抑制作用

[0085]

[0086] 实验例2.槲皮素葡萄糖苷对单向混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用

[0087] 实验方法：将近交系BALB/c和C57BL小鼠处死，取脾脏，用培养液制成细胞悬液，调整细胞密度。其中C57BL小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理，作为反应细胞，BALB/c小鼠脾细胞为刺激细胞，两种细胞悬液等体积混合。然后于96孔培养板中加入100μL混合细胞悬液，槲皮素葡萄糖苷溶液100μL，对照组加100μL含10％血清的培养液，并设两种细胞的单独培养作为对照。于37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时。待培养结束时，从各孔小心吸出 上清，再加入10μL MTT，继续放入培养箱中孵育。4小时后，各孔再加入100μL甲臜裂解液，放回培养箱中孵育过夜，酶标仪上读取OD570。

[0088] 实验结果：分析实验数据可知，槲皮素葡萄糖苷能够抑制单向的混合淋巴细胞反应，这种作用与剂量和作用时间呈依赖关系(见表3)。

[0089] 其它槲皮苷也显示出类似的对单向的混合淋巴细胞反应有明显抑制作用。 [0090] 表3.槲皮素葡萄糖苷对小鼠混合淋巴细胞反应的影响

[0091]

[0092] 实验例3.槲皮素鼠李糖苷的非特异性淋巴细胞毒性试验

[0093] 实验方法：近交系BALB/c小鼠处死，取脾脏，用培养液制成细胞悬液。然后将100μL细胞悬液加入96孔培养板中，加入100μL不同浓度的槲皮素鼠李糖苷和CsA，对照组加100μL含10％血清的培养液，于37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时。待培养结束时，从各孔小心吸出上清，再加入10μLMTT，继续放入培养箱中孵育。4小时后，各孔再加入
100μL甲臜裂解液，放回培养箱中孵育过夜，酶标仪上读取OD570。

[0094] 实验结果：分析实验数据可知，槲皮素鼠李糖苷只有在极高浓度时对正常小鼠脾细胞有抑制作用，1110μmol/L时最大抑制率也只有15％左右，其作 用剂量远远低于其毒性剂量(见附图1)，证明其有很低的毒性和副作用。

[0095] 其它槲皮苷也显示出类似的低毒性结果。

[0096] 实验例4.槲皮素鼠李糖苷对迟发型超敏反应(DTH)的抑制

[0097] 实验方法：近交系BALB/c小鼠随机分组，分别用绵羊红细胞(SRBC)进行皮下免疫，同天腹腔注射不同浓度的槲皮素鼠李糖苷溶液，对照组给予等量的生理盐水或者环孢素A(CsA)溶液。注射5天后，右足垫皮下再次注射SRBC，左足垫皮下注射等量生理盐水作为对照。24小时后，用游标卡尺测量每只小鼠左右足足垫的厚度，计算抑制率。 [0098] 实验结果：分析实验数据可知，槲皮素鼠李糖苷组随着给药剂量的逐渐升高，对迟发超敏反应的抑制逐渐增强，槲皮素鼠李糖苷40mg/kg和20mg/kg时与生理盐水组相比，对足垫肿胀的抑制率呈现非常显著的差异，且40mg/kg和阳性对照组CsA 40mg/kg对足垫肿胀的抑制率几乎一致，而槲皮素鼠李糖苷10mg/kg则没有明显作用(见表4)。

[0099] 表4.药物对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用

[0100]

[0101] ***＜0.001，各药物组与生理盐水组相比较。

[0102] 其它槲皮苷也显示出类似的结果。

[0103] 实验例5.槲皮素鼠李糖苷在小鼠同种异型皮肤移植中的作用

[0104] 实验方法：近交系BALB/c和C57BL小鼠麻醉后，无菌环境下同时剪去左侧背部皮肤(1cm×1cm)。然后BALB/c小鼠和C57BL小鼠皮片互换，平铺于背部左边的植床上，缝合、包扎和固定。而每只小鼠背部右侧皮肤进行自体移植，以验证实验人的技术误差。分设槲皮素鼠李糖苷组、阳性对照组、空白对照组和协同组，在皮肤移植手术结束24小时后腹腔注射给药，每日一次。观察7～15天，记录皮片存活时间，移植皮片以发生完全损伤干燥为发生排斥标准。

[0105] 实验结果：分析实验数据可知，槲皮素鼠李糖苷和CsA同剂量给药，对小鼠同种异体皮肤移植的抗排斥作用没有显著差异，均能明显延长皮瓣的存活时间。协同作用组采用将CsA组和槲皮素鼠李糖苷组剂量各降低一半后联合给药，发现皮瓣存活时间较CsA组和槲皮素鼠李糖苷组短，对抗排斥反应作用未见改善(见表5，见附图2)。

[0106] 表5.药物对小鼠同种异型皮肤移植的作用

[0107]* **

[0108] p＜0.05，0.001＜p＜0.01，与生理盐水组相比较。

[0109] 其它槲皮苷也显示出类似的结果。

[0110] 实验例6.槲皮素鼠李糖苷的小鼠急性毒性试验

[0111] 实验方法：小鼠分别以口服5g槲皮素鼠李糖苷/kg体重或腹腔注射2g槲皮素鼠李糖苷/kg体重的剂量一次性给药，密切观察给药4小时内的动物反应，并连续观察10天，记录动物状态和死亡情况。

[0112] 实验结果：槲皮素鼠李糖苷毒性极低，进行限量实验，小鼠在一次性口 服5g/kg或腹腔注射2g/kg的剂量时均未出现死亡，状态正常，连续观察十天后解剖，肉眼检查组织器官未见明显病变。可以认为槲皮素鼠李糖苷对小鼠的口服的急性毒性剂量大于5g/kg，腹腔注射大于2g/kg。

[0113] 其它槲皮苷也显示出很低的毒性。附图说明：

[0114] 图1.环孢素A和槲皮素鼠李糖苷对正常小鼠脾细胞毒性的影响比较

[0115] 图2.槲皮素鼠李糖苷对小鼠同种异型皮肤移植的作用。