β-脲酰丙酸酶抗原表位、抗β-脲酰丙酸酶抗体及其用途

摘要

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及β-脲酰丙酸酶抗原表位、抗β-脲酰丙酸酶抗体及其用途。具体地，所述β-脲酰丙酸酶抗原表位具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的序列。本发明还涉及一种抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体，所述多克隆抗体与上述抗原表位特异性结合。所述多克隆抗体具有高的特异性和效价。本发明还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途、含有该多克隆抗体的组合物、以及检测β-脲酰丙酸酶的方法。

权利要求

1.一种β-脲酰丙酸酶抗原表位，其由SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成。

2.一种组合物，其中含有权利要求1所述的β-脲酰丙酸酶抗原表位，任选地，还含有用于免疫的佐剂。

3.一种β-脲酰丙酸酶抗原表位-载体复合物，其中，所述β-脲酰丙酸酶抗原表位为权利要求1所述的β-脲酰丙酸酶抗原表位，所述载体选自钥孔戚血蓝素、BSA、以及酪蛋白。

4.一种抗β-脲酰丙酸酶抗体的制备方法，包括使用权利要求1的β-脲酰丙酸酶抗原表位或者权利要求2的组合物或者权利要求3的复合物的步骤；任选地，所述抗β-脲酰丙酸酶抗体是单克隆抗体或者多克隆抗体；具体地，所述制备方法包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的β-脲酰丙酸酶抗原表位或者权利要求2的组合物或者权利要求3的复合物免疫动物得到的血样进行离心，得到多抗血清；和

2)纯化步骤1)中的多抗血清，得到抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体。

5.一种多抗血清，其由权利要求1的β-脲酰丙酸酶抗原表位或者权利要求2的组合物或者权利要求3的复合物免疫动物制得。

6.一种抗β-脲酰丙酸酶抗体，其能够特异地结合权利要求1所述的β-脲酰丙酸酶抗原表位，任选地，其为多克隆抗体或者单克隆抗体。

7.一种组合物，其包含权利要求6所述的抗β-脲酰丙酸酶抗体。

8.一种β-脲酰丙酸酶检测剂，其包含权利要求6所述的抗β-脲酰丙酸酶抗体。

9.权利要求6所述的抗体在制备检测β-脲酰丙酸酶的药物中的用途。

10.一种检测β-脲酰丙酸酶的方法，所述方法包括使用权利要求6所述的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体的步骤；具体地，所述β-脲酰丙酸酶为水稻的β-脲酰丙酸酶。

说明书

β-脲酰丙酸酶抗原表位、抗β-脲酰丙酸酶抗体及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，涉及一种β-脲酰丙酸酶抗原表位、抗β-脲酰丙酸酶抗体，本发明还涉及分别含有所述抗原表位和抗体的组合物、以及所述抗体在检测β-脲酰丙酸酶中的用途。

背景技术

[0002] β-脲酰丙酸酶(Beta-ureidopropionase，酶分类号：EC：3.5.1.6)是一种对碳氮键具有水解活性、但对肽键没有活性的酶。β-脲酰丙酸酶作为参与代谢的重要酶，广泛地存在于多个物种中，例如人类、黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊子、线虫、拟南芥、水稻等，并且在这些物种具有保守的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

[0003] 目前，已经研究发现β-脲酰丙酸酶主要参与细胞内的4种代谢途径：β-丙氨酸代谢，泛酸和CoA生物合成，嘧啶代谢，药物代谢。β-脲酰丙酸酶在前3种途径中通过水解催化生成β-丙氨酸参与到代谢途径中。已知β-丙氨酸是一种肌肽分解产物，同时也是泛酸(维他命B-5)的组成成分，当β-脲酰丙酸酶缺失会导致β-丙氨酸合成受阻，也就会造成维他命B-5的缺失。β-脲酰丙酸酶参与催化降解嘧啶的最后一步。而β-脲酰丙酸酶在药物代谢中比较特殊，它能催化α-氟代-β-脲基丙酸水解成α-氟代-β-丙氨酸，α-氟代-β-丙氨酸作为分泌物排泄出细胞外或体外，保证药物发挥作用后能及时排出(Hardiman M.K.et al.Capacity of rat liver for pyrimidine synthesis and catabolism during fetal and neonatal development.Arch.Biochem.Biophys.224：326-331(1983))；Kvalnes-Krick K.L.，Traut T.W.Cloning，sequencing，and expression of a cDNA encoding beta-alanine synthase from rat liver.J.Biol.Chem.268：
5686-5693(1993))。

[0004] 作为β-脲酰丙酸酶的一个具体代表，水稻的β-脲酰丙酸酶参与含氮化合物代谢的生化过程，涉及到多种有机和无机化合物，这些过程包括固氮作用、硝化作用、硝酸盐还原、含氮有机物和铵的相互转换。检测β-脲酰丙酸酶，将直接反映水稻相应的生化进程是否顺利，更有利于对深入研究β-脲酰丙酸酶的功能提供检测试剂。已知水稻β-脲酰丙酸酶的基因是Os07g0485100，GenBank登录号：NP_001059656.1，别名AK060443。该基因位于水稻7号染色体，从18480774到18483842bp，cDNA序列全长3069bp，读码框如SEQ ID NO：2所示，编码的β-脲酰丙酸酶是413个氨基酸的蛋白质，该蛋白的分子量为45712.8，其蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。

[0005] 但是，迄今为止，对β-脲酰丙酸酶的研究都停留在mRNA水平上，并且限于对鼠等动物的研究，因为至今都没有人能够有效地制备抗β-脲酰丙酸酶，特别是植物的模式生物水稻的β-脲酰丙酸酶的抗体。现有技术中，通常制备的多克隆抗体特异性不高，用于检测目标物质会存在准确性的问题。另一方面，如果用β-脲酰丙酸酶全长制备抗原的话，如果是化学合成，全长的氨基酸序列有413个氨基酸，蛋白质空间结构的重建是一个很困难的工作，再现与生物体内相同的空间构象仍然是现阶段蛋白质学研究的难点；如果是重组表达，需要的操作步骤很繁琐，并且最后表达出目标蛋白的几率很小。一般来说抗原表位合成简易，准确性高，成本低廉，空间构象容易再现，因此有必要开发一种具有代表β-脲酰丙酸酶本身的抗原表位(antigenic determinant，AD)(又称抗原决定簇，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团)来代替全长蛋白。

[0006] 尽管目前已经有用于预测抗原表位的软件，例如BEPITOPE软件，但是预测得到的抗原表位中会有30％左右的非有效抗原表位，即不能特异性地代表抗原的抗原表位，或者不能引发免疫应答(Chang HT，LiuCH，Pai TW.Estimation and extraction of B-cell linear epitopes predicted by mathematical morphology approaches.J Mol Recognit.2008 Nov-Dec；21(6)：431-41)。

发明内容

[0007] 为了解决上述问题，本发明人在通过BEPITOPE软件预测得到多个抗原表位序列的基础上，进行了大量的实验和不懈的努力，结果发现在预测的36个抗原表位中有一个抗原表位序列SLHRLLQSNLSPEL(SEQ ID NO：4)是最有效的抗原表位，并且其具有良好的抗原特异性。由此提供了下述发明：

[0008] 本发明的一个方面涉及一种β-脲酰丙酸酶抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

[0009] 在本发明的一个实施方案中，为了增加与载体的交联性，在上述抗原表位的C末端添加了一个半胱氨酸(半胱氨酸提供二硫键与载体交联)，得到序列为SLHRLLQSNLSPELC(SEQ ID NO：5)的抗原表位。

[0010] 半胱氨酸也可以加在多肽的N末端，得到序列为CSLHRLLQSNLSPEL(SEQ ID NO：6)的抗原表位。

[0011] 末端加1个半胱氨酸就可以了。如果在同一端加多个半胱氨酸，导致成本上升，并且二硫键密度太大，而实际上也不需要这么多二硫键。另外不宜在N末端和C末端都加半胱氨酸，因为一个抗原表位和一个载体结合，如果在两端分别加1个半胱氨酸，半胱氨酸与载体结合后，抗原表位少了游离端，反而不利于产生抗体。

[0012] 本发明的抗原表位可以通过常规的肽合成技术化学合成得到，也可以在适当的宿主中表达得到；优选的是化学合成。

[0013] 本发明的还一方面涉及一种组合物，其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的β-脲酰丙酸酶抗原表位，任选地，可以含有免疫佐剂，例如氢氧化铝、弗氏完全佐剂、或者弗氏不完全佐剂等。

[0014] 本发明的还一方面涉及一种β-脲酰丙酸酶抗原表位-载体复合物；其中，所述β-脲酰丙酸酶抗原表位为本发明的β-脲酰丙酸酶抗原表位，所述载体可以是钥孔戚血蓝素(KLH)、BSA、或酪蛋白等。

[0015] 本发明的还一方面涉及一种抗β-脲酰丙酸酶抗体，所述抗β-脲酰丙酸酶抗体能够特异性地结合SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的β-脲酰丙酸酶抗原表位。所述抗β-脲酰丙酸酶抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。

[0016] 本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体可以得自各种常规制备多克隆抗体的动物，例如山羊，兔子，大鼠，小鼠等。

[0017] 对本领域技术人员而言，可以根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的β-脲酰丙酸酶抗原表位制备单克隆抗体，具体操作可以参见本领域的技术手册，也可以参考文献例如Nature1975 Kohler&Milstein Vol 256，p495。

[0018] 本发明的还一方面涉及一种含有抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体的血清(简称多抗血清)，其通过使用SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的抗原表位免疫动物制得。

[0019] 本发明的还一方面涉及一种抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体制备方法，包括将SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的β-脲酰丙酸酶抗原表位作为抗原免疫动物的步骤。任选地，所述免疫步骤可以加入佐剂，例如氢氧化铝、弗氏完全佐剂、或者弗氏不完全佐剂，等等。

[0020] 本发明的一个实施方案中，所述抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体制备方法，包括如下步骤：

[0021] 1)将SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的β-脲酰丙酸酶抗原表位作为抗原免疫动物；

[0022] 2)取血，离心收集多抗血清；和

[0023] 3)纯化步骤2)中的多抗血清，得到抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体。

[0024] 本发明的还一方面涉及一种组合物，其包含本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体。

[0025] 本发明的还一方面涉及一种β-脲酰丙酸酶检测剂，其包含本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体。

[0026] 其中由于β-脲酰丙酸酶在多个物种中是保守的(见下面的SEQ ID NO：1)，而且本发明中作为抗原表位的SEQ ID NO：4存在于保守序列中(参见SEQ ID NO：1中加框的序列)，因此本发明的多克隆抗体不仅可以检测水稻中的β-脲酰丙酸酶，也可以检测其它多个物种(例如人类、黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊子、线虫、拟南芥等)中的β-脲酰丙酸酶。

[0027] MDSSNGERPPQGEDAPAAAAGSIGGYE FKEASRLLLGLNCGRALEAISLPEATSALAKAHNFDVQAFRFDADKEYLRQPRVIRVGLIQNSIAIPTTSHFADQKKAIMEKVKPMIDAAGDAGVNILCLQEAWTMPFAFCTREKRWCEFAEPVDGESTQFLQQLAKKYNMVIVSPILERDVNHGEIVWNTAVVXXXXXXXXXXXXXXXXPRVGDFNESTYYMEGNTGHPVFETAYGKIGVNICYGRHHPLNWLAFGLNGAEIVFNPSATVGELSEPMWPIEARNAAIANSYFVGSINRVGTEVFPNPFTSGDGKPQHADFGHFYGSSHFSAPDASCTPSLSRYRDGLMISDMDLNLCRQIKDKWGFRMTARYDTYASLLSEYLKPDFKPQVIVDPLINKSA(SEQ ID NO：1)

[0028] 注：X表示任意氨基酸。

[0029] 本发明的还一方面涉及本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体在制备检测β-脲酰丙酸酶的药物中的用途。

[0030] 本发明的还一方面涉及一种检测β-脲酰丙酸酶的方法，所述方法包括使用本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体的步骤。具体地，包括如下步骤：

[0031] 1)将待测样品与本发明的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体孵育，使所述的抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体与待测样品中的β-脲酰丙酸酶特异性结合，由此形成免疫复合物；和

[0032] 2)检测是否存在免疫复合物。

[0033] 上述检测β-脲酰丙酸酶的方法可以检测β-脲酰丙酸酶的有无、对其进行半定量(例如western blot方法)；在有β-脲酰丙酸酶标准品的情况下，还可以通过ELISA方法对β-脲酰丙酸酶进行定量检测。

[0034] 在本发明的一个实施方案中，所述β-脲酰丙酸酶为水稻的β-脲酰丙酸酶。具体的，所述水稻为水稻93-11。

[0035] 发明的有益效果

[0036] 1)本发明提供的多克隆抗体，特异性高。Western blot检测时只出现特异性的一条条带(见图1与图2比较)，与其它抗原表位相比，特异性高；

[0037] 2)本发明提供的多克隆抗体，可用于检测β-丙氨酸的表达情况。β-脲酰丙酸酶能催化水解底物(N-氨基甲酰-β-丙氨酸)成β-丙氨酸，β-脲酰丙酸酶的水平能间接反映有机体是否缺乏β-丙氨酸。

[0038] 3)本发明提供的β-脲酰丙酸酶抗原合成简易，准确性高。本发明提供的抗原表位是经软件预测选出的抗原表位片段后化学合成的，片段短小，容易合成，空间构象再现容易。

[0039] 4)本发明提供的多克隆抗体可用于所有检测β-脲酰丙酸酶存在与否的试剂。

[0040] 5)本发明提供的多克隆抗体可用于研究泛酸和CoA合成途径、嘧啶代谢途径、β-丙氨酸代谢途径、涉及α-氟代-β-脲基丙酸的药物代谢途径，研究栽培稻特异的基因功能。

附图说明

[0041] 图1：使用抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体1对β-脲酰丙酸酶在水稻不同组织的免疫印迹检测结果。

[0042] 图2：使用抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体2对β-脲酰丙酸酶在水稻不同组织的免疫印迹检测结果。

[0043] 图3：多抗1检测的β-脲酰丙酸酶的一级质谱图。

[0044] 图4：多抗1检测的β-脲酰丙酸酶的二级质谱图。

具体实施方式

[0045] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0046] 实施例1：候选抗原表位1和候选抗原表位2的预测

[0047] 水稻 β-脲酰 丙 酸 酶对 应 的基 因 是Os07g0485100，GenBank登 录 号：NP_001059656.1，别名AK060443。读码框序列如下：

[0048] ATGGACAGCAGCAACGGCGAGCGGCCGCCGCAGGGAGAGGATGCGCCGGCGGCGGCGGCGGGGTCGATCGGAGGGTACGAGTCCCTGCACAGGCTCCTCCAGTCCAACCTCTCCCCGGAGCTCTTCAAGGAAGCAAGCCGGCTGCTATTGGGACTGAATTGTGGGCGTGCTCTAGAGGCCATCTCATTGCCCGAAGCCACATCTGCTCTTGCAAAAGCTCATAACTTTGATGTGCAGGCCTTCCGTTTTGATGCAGATAAAGAGTATCTCAGGCAACCACGGGTTATTCGAGTTGGCCTGATTCAGAACTCAATTGCTATTCCTACCACCAGTCATTTTGCAGATCAGAAGAAGGCTATCATGGAGAAAGTCAAGCCTATGATTGATGCAGCTGGTGATGCTGGTGTTAATATTTTGTGTTTACAGGAAGCTTGGACAATGCCTTTTGCCTTCTGCACACGTGAGAAAAGGTGGTGTGAGTTTGCTGAGCCTGTTGATGGAGAATCTACTCAATTTCTTCAACAACTTGCTAAGAAATATAACATGGTAATTGTGAGCCCAATCCTCGAAAGAGATGTAAACCACGGAGAGATTGTATGGAATACAGCTGTTGTCATAGGTAATCATGGGAACATAATTGGTATACATCGAAAGAATCACATCCCAAGAGTCGGTGATTTCAATGAGAGCACATACTATATGGAGGGTAACACTGGGCATCCAGTGTTTGAAACAGCATATGGGAAAATCGGAGTAAACATTTGTTATGGAAGGCATCATCCCCTTAATTGGCTTGCTTTTGGCCTCAATGGAGCTGAAATAGTATTCAACCCATCCGCAACTGTTGGTGAACTCAGTGAACCAATGTGGCCCATTGAGGCCAGAAATGCTGCAATTGCAAATAGCTACTTTGTCGGGTCAATTAACCGGGTTGGCACAGAGGTCTTCCCAAACCCATTCACTTCTGGTGACGGGAAACCTCAGCATGCCGACTTTGGTCATTTCTATGGATCCAGCCATTTCTCAGCACCTGATGCTTCTTGCACCCCATCACTATCTCGCTACCGAGATGGCTTGATGATATCTGATATGGACCTCAACTTATGTCGCCAGATCAAAGACAAGTGGGGCTTCCGCATGACTGCCCGTTATGACACGTATGCTTCCTTGCTTTCAGAGTACTTGAAGCCAGATTTTAAACCTCAAGTCATTGTTGACCCCTTGATCAATAAGAGTGCGTAA(SEQ ID NO：2)

[0049] 所编码的水稻β-脲酰丙酸酶全长序列如下：

[0050] MDSSNGERPPQGEDAPAAAAGSIGGYE FKEASRLLLGLNCGRALEAISLPEATSALAKAHNFDVQAFRFDADKEYLRQPRVIRVGLIQNSIAIPTTSHFADQKKAIMEKVKPMIDAAGDAGVNILCLQEAWTMPFAFCTREKRWCEFAEPVDGESTQFLQQLAKKYNMVIVSPILERDVNHGEIVWNTAVVIGNHGNIIGIHRKNHIPRVGDFNESTYYMEGNTGHPVFETAYGKIGVNICYGRHHPLNWLAFGLNGAEIVFNPSATVGELSEPMWPIEARNAAIANSYFVGSINRVGTEVFPNPFTSGDGKPQHADFGHFYGSSHFSAPDASCTPSLSRYRDGLMISDMDLNLCRQIKDKWGFRMTARYDTYASLLSEYLKPDFKPQVIVDPLINKSA(SEQ ID NO：3，其中加框的序列为SEQ ID NO：
4)

[0051] 然后根据SEQ ID NO：3，用BEPITOPE软件对水稻β-脲酰丙酸酶基因编码的蛋白质进行抗原表位的预测。本实施例中使用了BEPITOPE软件提供的五种方法Standard、Karplus、Emini、Amphiphi、Pellequer，以及这五种方法的综合方法cons_Sta_Kar_Emi_Amp_Pel，所有参数选择默认。具体方法可以参考Odorico M，Pellequer J L.BEPITOPE：predicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins[J].J Mol Recognit，2003，16(1)：20-22。

[0052] 一共预测得到了36个候选的抗原表位，选出抗原表位峰值较高的两个片段SLHRLLQSNLSPEL(SEQ ID NO：4)和KAIMEKVKPMIDAA(SEQ ID NO：7)。

[0053] 然后将上述两个片段在水稻蛋白质库(RAP-DB数据库，网址：http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)进行唯一性检索(蛋白序列比对)，确定了这两个片段在水稻蛋白质库中的唯一性。

[0054] 实施例2：抗原表位1和抗原表位2的化学合成

[0055] 实施例1中得到的候选抗原表位1和2的两端都没有半胱氨酸，为了实现与载体的交联，合成的序列需加入半胱氨酸，因此要合成的多肽序列分别为：SLHRLLQSNLSPELC(SEQ ID NO：5)和KAIMEKVKPMIDAAC(SEQ ID NO：8)。

[0056] 对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示的多肽序列进行化学合成(由吉尔生化公司合成)，得到β-脲酰丙酸酶的抗原表位1和抗原表位2。

[0057] 实施例3：抗原表位1-KLH复合物的制备

[0058] 采用戊二醛连接法，将实施例2中合成的抗原表位1的C端与交联载体蛋白-钥孔戚血蓝素(KLH)交联，得到抗原表位1-KLH复合物。

[0059] 具体实施步骤如下：

[0060] 将5mg合成多肽加入7mg KLH中，边震荡边缓慢加入新鲜配制的3g/L戊二醛溶液1ml，室温孵育2h。以pH8.5的硼酸缓冲液透析24h，得到抗原表位1-KLH复合物。

[0061] 实施例4：抗原表位2-KLH复合物的制备

[0062] 按照与实施例3中相同的方法制备抗原表位2-KLH复合物，除了将抗原表位1换为抗原表位2。

[0063] 实施例5：多抗血清1的制备

[0064] 取1-2mg实施例3中制备的抗原表位1-KLH复合物，免疫新西兰大白兔，每隔14天加强免疫一次；第2次加强免疫后7天，耳静脉取血，分离血清(5000rpm离心10min)，收集上清，测效价。同时按照相同的步骤，用抗原表位1(SEQ ID NO：5)作为对照。

[0065] 具体步骤如下：

[0066] 取1-2mg实施例3中制备的抗原表位1-KLH复合物与等量的完全福氏佐剂充分乳化，形成油水包，于兔颈部和背部皮下多点注射，每点约100μg。2周后加强免疫，剂量同前，用不完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射；以后隔2周加强免疫1次；从第2次加强免疫开始，每次免疫7天后，经耳静脉取血测定抗体的效价。

[0067] 其中，耳静脉取血进行效价检测(ELISA法)的步骤如下：

[0068] 在96孔板上，每孔加入50μg/ml磷酸酪氨酸100μl，4℃过夜后，进行包被，洗涤。将按照前述方法制备的耳静脉血的多抗血清稀释为1∶100，1∶500，1∶2500，1∶3200，
1∶12800，1∶25600，1∶52000，每孔各加100μl，37℃保温30min，洗涤。各加入1∶100稀释的羊抗兔Ig酶结合物100μl，37℃保温30min，洗涤。加入TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)100μl，20min后，加2mol/l的H2SO4终止反应。

[0069] 经过4次加强免疫后，效价检测的结果如下：

[0070] 多抗血清1(抗原表位1-KLH复合物免疫)＞25600(抗原表位1-KLH复合物有免疫原性的最大稀释倍数是25600)；

[0071] 裸肽免疫(抗原表位1，SEQ ID NO：5)得到的多抗血清＞3200(仅仅由抗原表位1组成的裸肽具有免疫原性的最大稀释倍数是3200)。

[0072] 上述结果已经符合要求，遂于末次加强免疫7天后颈动脉放血，收集血样。将收集的血样在3-4℃下静置3-4小时，然后5000rpm离心10分钟，收集血清，得到多抗血清1(耳静脉检测效价符合要求后，颈动脉取的血样不必再检测效价)。无菌分装保存于-80℃备用。

[0073] 实施例6：多抗血清2的制备

[0074] 按照与实施例5相同的方法制备多抗血清2并进行效价检测，除了使用候选抗原表位2-KLH复合物替代候选抗原表位1-KLH复合物。

[0075] 其中，经过4次加强免疫后，效价检测的结果如下：

[0076] 多抗血清2(抗原表位2-KLH复合物免疫)＞12800(抗原表位2-KLH复合物有免疫原性的最大稀释倍数是12800)；

[0077] 裸肽免疫(抗原表位2，SEQ ID NO：7)得到的多抗血清＞2500(仅仅由抗原表位2组成的裸肽具有免疫原性的最大稀释倍数是2500)。

[0078] 可见，抗原表位2-KLH复合物的效价低于抗原表位1-KLH复合物；抗原表位2的效价低于抗原表位1。

[0079] 实施例7：抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体1(多抗1)的制备

[0080] 将实施例5中制备的多抗血清1进行纯化，制得多克隆抗体1(多抗1)。

[0081] 将抗原表位SLHRLLQSNLSPELC(SEQ ID NO：5)多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联，制备多肽亲和层析柱。

[0082] 将制备的多抗血清加入到以上制备的层析柱中，放置于4℃孵育过夜后，洗脱抗体，即得到抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体(多抗1)。

[0083] 实施例8：抗β-脲酰丙酸酶多克隆抗体2(多抗2)的制备

[0084] 按照与实施例7相同的方法进行，除了将多抗血清1替换为实施例4制备的多抗血清2，制得多克隆抗体2(多抗2)。

[0085] 实施例9：多抗1和多抗2针对β-脲酰丙酸酶的特异性检验

[0086] 1)使用多抗1检测

[0087] 选取水稻93-11(获自国家杂交水稻工程技术中心)苗期地上部、分蘖期叶片、孕穗期剑叶、开花期剑叶、成熟期剑叶、苗期地下部、分蘖期茎、开花期穗子、成熟期种子(共9个部位)，分别提取总蛋白质。

[0088] 总蛋白质样品的制备：用液氮研磨上述新鲜水稻组织至粉末状，分装到预冷离心管中，每300μl粉末加800μl蛋白质裂解液(62.5mmol/L pH7.4 Tris·HCl，10％甘油，2％SDS，20mmol/LNaF，2mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，5％β-巯基乙醇)，迅速混匀并置于冰上，冰水混合物中孵育10分钟，约每2分钟震荡混匀1次。4℃，12000r/min离心15分钟。取上清，转移到新的离心管中，-70℃保存。得到水稻总蛋白。

[0089] Western印记：

[0090] 将提取的上述水稻蛋白质进行SDS-PAGE(12％)，检测时，Marker(Transgen Biotech，货号：DM 201)和上述9个部位的水稻总蛋白的上样量从左至右依次为为：10μl、7μl、8μl、7μl、6μl、6μl、6μl、10μl、3μl、5μl(图1)。

[0091] SDS-PAGE后电转移到PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉封闭PVDF膜。使用实施例7中制备的多抗1，以1∶1000稀释后室温孵育3小时，TTBS(2mmol/L Tris·HCl pH7.6，13.6mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)洗膜3次，每次5分钟。之后加入以1∶15000稀释的兔源多抗(厂家货号：中杉ZB2301)，室温孵育1小时，TTBS洗膜3次，每次5分钟。加ECL Pluc显色剂显色，暗室曝光5分钟。结果如图1所示，在PVDF膜上看到48kDa附近的一条特异性条带，这与预测分子量(46kDa)几乎完全一致。

[0092] 需要说明的是，尽管水稻全蛋白中可能有很多分子量与其相似的蛋白，但是与多抗1特异性结合的就只有β-脲酰丙酸酶一个。关于特异性的预测：SEQ ID NO：5经过http://rice.plantbiology.msu.edu/blast.shtml(与实施例1中的http://rapdb.dna.affrc.go.jp/作用相同，目的是再次检验唯一性)的检查，确定此多肽序列特异，该序列在水稻总蛋白中唯一确定β-脲酰丙酸酶。

[0093] 此外，为了进一步证明检测到的的确是β-脲酰丙酸酶，将上述9个表位分别提取的总蛋白进行第二次SDS-PAGE电泳，得到SDS胶，然后在上面选取与western blot上的目标条带(48kDa)对应的条带，用Trypsin酶消化后打质谱，通过对一级质谱图(图3)和二级质谱图(图4)的联合搜索，可以推测是β-脲酰丙酸酶。

[0094] 2)使用多抗2检测

[0095] 按照与实施例8的1)中完全相同的方法进行，除了将多克隆抗体1替换成实施例4制备的多克隆抗体2。结果如图2所示，在PVDF膜上看到在分蘖期的水稻组织样品，在
48kDa附近出现两条条带，并且在多个样品的检测中出现多个条带。结果显示，多抗2的特异性明显不如多抗1。

[0096] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。