一种人工抗菌肽及其基因与制备方法转让专利
申请号 : CN201010224980.5
文献号 : CN101955525B
文献日 : 2012-11-07
发明人 : 吴培星 , 徐玲 , 孙茜胜 , 张继瑜 , 宋楠 , 李纯玲
申请人 : 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 , 北京养元兽药有限公司 , 北京天之泰生物科技有限公司
摘要 :
本发明“一种人工抗菌肽及其基因与制备方法”，属于生物制药领域。本发明的人工抗菌肽通过对Genbank中的hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID：NP_001161799.1)进行了改造，获得了活性高、抗菌谱更宽的新抗菌肽。本发明还根据毕赤氏酵母菌对氨基酸密码子的偏好性，对编码该多肽的核苷酸序列进行了优化，该核苷酸序列转入毕赤氏酵母菌中，表达量、抗菌谱明显高于原hepcidin抗菌肽的基因。
权利要求 :
1.一种人工抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
2.权利要求1所述人工抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的药物中的应用。
3.编码权利要求1所述人工抗菌肽的基因。
4.权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.权利要求1所述人工抗菌肽的制备方法，其特征在于，将权利要求5所述的表达载体转化到宿主菌中，然后培养宿主菌使其表达所述人工抗菌肽；所述宿主菌为酵母菌。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌为巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。
说明书 :
一种人工抗菌肽及其基因与制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物医药技术，特别涉及到一种人工抗菌肽及其基因与制备方法。
背景技术
[0002] 抗菌肽(antibacterial peptide)于1972年首次在昆虫体内分离获得，是由生物体免疫系统在受到外界病原体侵袭时产生的一类非特异性免疫应答产物，具有广谱抗细菌、真菌、病毒及抑杀肿瘤细胞等作用。分子质量较小，富含疏水氨基酸和碱性氨基酸，多带正电荷，耐高温、酸碱，稳定性强。对比抗生素，抗菌肽的抗菌谱更广(Miyasaki K T，Lofel R，Lehrer RI.Sensitivity of periodontal pathogens to the bacterial activity of synthetic protegrins，antibioticpeptides derived from porcine leukocytes[J].J Dent Res，1997，76：1453-1459.Andreu D，RivasL.Animal antimicrobial peptides：an overview[J].Biopolymers，1998，47：415-433.)；其杀菌机理独特，不易产生耐药菌；作用专一，对正常细胞无明显毒副作用，无致畸作用，不易产生蓄积中毒。是一类理想的新型“绿色”抗菌药物。
[0003] Hepcidin是2000年被发现的一种在肝脏合成并富含半胱氨酸的抗菌肽，属防御素家族。Hepcidin的蛋白结构在不同物种间高度保守，其蛋白结构富含精氨酸、赖氨酸等带正电的氨基酸残基，8个半胱氨酸形成4个二硫键，成发夹结构，第4和第5个半胱氨酸在发夹的拐角处形成一个二硫键，在磷酸缓冲液中形成稳定的β折迭结构(王元忠，周建新.Hepcidin：具有抗茵活性的铁调节激素[J].生理科学进展，2005，36(4)：372-375.)。和许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似，Hepcidin具有抑制细菌和真菌生长的作用，在体外抗菌试验中，具有抗大肠杆菌、B群链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等细菌活性以及抗白色念珠菌、曲霉菌等真菌活性，其在体内和其它抗菌肽一样参与宿主的天然防御(Vyoral D，Petrak J.Hepcidin：a direct link between iron metabolism and immunity[J].Int J Biochem CellBiol，2005，37(9)：1768-1773.周雷，张勇，王建锋，等.奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达[J].甘肃农业大学学报，2009，2(1)：
7-10.)。同时，Hepcidin还是维持铁稳态的关键激素(Nicolas G，Viatte L，Lou DQ，et al.Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model ofhemocromatosis[J].Nat Genet，2003，34：97-101.)
7-10.)。同时，Hepcidin还是维持铁稳态的关键激素(Nicolas G，Viatte L，Lou DQ，et al.Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model ofhemocromatosis[J].Nat Genet，2003，34：97-101.)
发明内容
[0004] 本发明所述一种具备高抑菌活性的新抗菌肽，是根据Genbank上hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID：NP_001161799.1)，人工设计并合成一种hepcidin抗菌肽的核苷酸序列，并构建到表达载体中，转化到酵母受体菌中诱导表达，表达产物表现出高表达量，高活力等特性。体外抑菌实验结果表明该抗菌肽生物活性强，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌活性。
[0005] 一种人工抗菌肽，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。
[0006] 一种人工抗菌肽，是通过对Seq ID No.1所示的氨基酸序列进行取代、缺失、加入、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸而得到的与Seq ID No.1所示的氨基酸序列所示的多肽相同抗菌活性的氨基酸序列。
[0007] 上述人工抗菌肽在抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中的应用。
[0008] 编码上述人工抗菌肽的基因。
[0009] 所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
[0010] 含有上述基因的表达载体。
[0011] 所述表达载体指pPICZαA-hepcidin。
[0012] 上述人工抗菌肽的制备方法，指将上述表达载体转化到宿主菌中，培养宿主菌使其表达所述人工抗菌肽。
[0013] 所述宿主菌指大肠杆菌或酵母菌。
[0014] 所述酵母菌指毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)。
[0015] 本发明对Genbank中记录的hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID：NP_001161799.1)进行人工改造和设计，得到本发明Seq ID No.1所示的氨基酸序列，并根据毕赤氏酵母对氨基酸的密码子偏好性设计其核苷酸序列，得到编码本发明人工抗菌肽的基因。通过构建载体，转化到宿主，诱导表达后发现，与原多肽表达蛋白相比，本发明的人工抗菌肽具有表达量高，抗菌谱宽的优点。即原多肽的表达量约127.9mg/L，不能满足生产需要，生产成本过高；改造后的多肽的基因在毕赤氏酵母中的诱导表达量大大提高，约
214.2mg/L。原多肽仅对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，且抑菌效果不理想。本发明的人工抗菌肽不仅对枯草芽孢杆菌有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌均有明显的抑杀作用。
214.2mg/L。原多肽仅对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，且抑菌效果不理想。本发明的人工抗菌肽不仅对枯草芽孢杆菌有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌均有明显的抑杀作用。
附图说明
[0016] 图1.重组质粒pPICZαA-hepcidin PCR鉴定
[0017] 1重组质粒pPICZαA-hepcidin 2.DNA Marker
[0018] 图2重组酵母菌PCR鉴定
[0019] 1.重组酵母菌；2.空载体；3.DNAMarker
[0020] 图3Hepcidin表达产物的SDS-PAGE分析
[0021] 1.空载体对照；2.筛选高拷贝hepcidin表达产物；3.未经筛选hepcidin表达产物；4.蛋白Marker
[0022] 图4本发明人工抗菌肽的抑菌对比试验
[0023] A.金黄色葡萄球菌；B.枯草芽孢杆菌；C.无乳链球菌
[0024] 菌斑1.氨苄青霉素；2～5.本发明的多肽；6阴性对照
[0025] 图5原抗菌肽的抑制试验
[0026] A.枯草芽孢杆菌；
[0027] 1.阴性对照；2.阳性对照Amp；3-5.50μL原多肽表达上清液；
[0028] B金黄色葡萄球菌；
[0029] 1.AMP，2.本发明的多肽，3-7.原多肽
具体实施方式
[0030] 以下具体实验操作步骤对本发明作进一步描述，实验方法中如无特别说明，均为常规方法。
[0031] 实施例1.构建重组酵母菌
[0032] 步骤1.根据Genebank上hepcidin抗菌肽的氨基酸序列(Genbank ID：NP_001161799.1)，设计出本发明抗菌肽的氨基酸序列Seq ID No.1，再根据毕赤氏酵母对密码子的偏好性，在不改变氨基酸的条件下，设计编码该多肽的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，由北京Invitrogen公司合成该核苷酸序列。
[0033] 并根据Seq ID No.2设计一对引物H1/H2：
[0034] H1：5′GGCCTCGAGATGGCTCTGTCTTCCACAATC 3′
[0035] H2：5′CGCTCTAGATCAGGTCTTCCTGCAACAGCA 3′
[0036] 在Seq ID No.2的3’端引入终止密码子，在Seq ID No.2两端分别引入Xho I和Xba I酶切位点。
[0037] 合成原抗菌肽Genbank ID：NP_001161799.1的氨基酸序列的基因如Seq ID No.3所示的核苷酸序列，并根据该序列设计合成引物如下：
[0038] H3：5′GGCCTCGAGATGGCTCTGAACACGAACATC 3′
[0039] H4：5′CGCTCTAGATCAGGTCTTGCAGCACCAGCC 3′，在Seq ID No.3的3’端引入终止密码子，在Seq ID No.3两端分别引入Xho I和Xba I酶切位点。
[0040] 步骤2.构建表达载体pPICZαA-hepcidin
[0041] 材料：表达载体pPICZαA购于Invitrogen公司。T4DNA连接酶、GoTaq酶、Xho I、Xba I等限制性内切酶购自TaKaRa公司，氨苄青霉素(AMP)、Zeocin购于Invitrogen公司。
[0042] 方法：
[0043] PCR扩增：合成的hepcidin基因整合在载体PCR2.1-TOPO(合成基因过程中Invitrogen附赠的)上，提质粒后PCR扩增PCR2.1-TOPO中的hepcidin。反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。
[0044]
[0045] PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，采用Xho I、Xba I双酶切PCR产物和pPICZαA，通过T4DNA连接酶将人工合成基因hepcidin整合到pPICZαA(购于Invitrogen)中，PCR鉴定阳性重组质粒，见图1，命名为pPICZαA-hepcidin，PCR鉴定的阳性质粒送检DNA测序，测序结果与Seq ID No.2一致。
[0046] 相同方法构建原抗菌肽的基因Seq ID No.3的表达载体pPICZαA-hepcidin’，PCR引物为H3/H4，双酶切酶为Xho I、Xba I。
[0047] 步骤3转化酵母菌及鉴定
[0048] 材料：宿主菌：毕赤氏酵母菌X-33(Pichiapastoris)，由发明人实验室有保存，自申请日起20年可向公众发放用于验证试验。
[0049] 方法：阳性重组质粒pPICZαA-hepcidin及pPICZαA-hepcidin’经Sac I线性化后，分别电转化毕赤氏酵母菌X-33。电击条件：电压1800V，电阻200Ω，电容25μF，电击时间5ms。在25μg/mLZeocin的YPDs固体培养基上筛选阳性转化子，经YPD液体培养基增菌后，提取YPD液体培养基中的重组酵母DNA，进行PCR鉴定，鉴定引物：
[0050] 5′AOX：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3‘
[0051] 3′AOX：5′-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3‘
[0052] PCR反应程序为：①94℃1min；②94℃1min，59℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min电泳结束后取5μL样用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。
[0053] 转化了pPICZαA-hepcidin’的重组酵母菌的PCR鉴定，引物同为5′AOX/3′AOX：程序同上。
[0054] 步骤4.筛选高拷贝重组酵母菌
[0055] 用无菌96孔板筛选pPICZαA-hepcidin’、pPICZαA-hepcidin转化的高拷贝阳性重组酵母菌，Zeocin(购于Invitrogen，Cat.No.：R250-0)抗性浓度为2、4、6mg/ml梯度上升，筛选多拷贝整合转化子。
[0056] 步骤5.诱导表达
[0057] 将筛选到重组酵母菌的YPD液体培养基培养物按1∶50的比例转接于100mL BMGY培养基，在30℃250rpm培养至OD600达到3～6，离心收集菌体，并重悬于500mL BMMY培养基，进行诱导表达：28℃，250rpm培养96h，每24h补加甲醇至终浓度为1％。96h后10000rpm，20min离心收集培养上清。
[0058] 测浓度，pPICZαA-hepcidin转化的重组酵母菌的抗菌肽表达量约214.2mg/L，pPICZαA-hepcidin’转化的重组酵母菌的抗菌肽表达量为约127.9mg/L。
[0059] 步骤6.步骤5所获得的上清经SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图3所示。
[0060] 实施例2.抑菌试验
[0061] 材料：实验菌菌株：
[0062] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CVCC1882、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CVCC717、无乳链球菌CVCC586(Streptococcus agalactiae)，第一发明人所在实验室有保存，保证自申请日起二十年内，可向公众发放用于验证试验。
[0063] 方法：
[0064] 用无菌棉拭子蘸取处于对数生长期的金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌、无乳链球菌悬浮液，均匀涂布于LB固体培养基，室温放置3min。无菌操作将无菌纸片贴在涂好菌的平板上，滴加50μL待测的实施例1制备得到的上清样品，37℃培养16h，以同体积pPICZαA空载体转化X-33酵母的表达蛋白为阴性对照，5μL氨苄青霉素(AMP 50μg/mL)为阳性对照。测量抑菌直径(抑菌直径＝抑菌圈直径-无菌纸片直径)。
[0065] 结果：
[0066] 抑菌试验结果显示，2#和3#菌株对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、枯草芽孢杆菌有较好的抑菌活性，而对大肠杆菌均无明显作用。4#菌株对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌活性，对无乳链球菌无抑菌活性。5#菌株仅对金黄色葡萄球菌有抑菌活性，对枯草芽孢杆菌、无乳链球菌无抑菌活性。(见表1、图4)。
[0067] 表1重组hepcidin不同酵母菌株抑菌试验的抑菌环直径结果(直径cm)[0068]
[0069] 以相同方法，检测pPICZαA-hepcidin’转化的重组酵母菌表达的蛋白对金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌抑制，结果如图5所示：结果表明原抗菌肽仅仅能抑制枯草芽孢杆菌。