一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体及其应用

摘要

一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，按以下步骤制备：(1)中华鳖特异性抗原：采中华鳖血置于玻瓶，室温凝固，35～38℃放置1.5～3h，再3～6℃放置8～12h，离心沉淀，取上清，制层析柱，经硫酸铵水溶液粗提并透析浓缩后稀释，过滤后上样，洗脱，最先洗脱的蛋白IgM即中华鳖特异性抗原；(2)多克隆抗体：以所述抗原免疫动物，取血，分离出抗血清，纯化制得所述多克隆抗体；(3)杂交瘤细胞株：以骨髓瘤细胞与产生抗中华鳖血清蛋白IgM抗体的脾细胞融合得该杂交瘤细胞株；(4)一种抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体：以所述的杂交瘤细胞株产生该单克隆抗体。以所述单克隆抗体检测中华鳖免疫血清效价。本发明适用于甲鱼类病原学、免疫学研究。

权利要求

1.一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，其特征是所述单克隆抗体是按以下步骤制备的抗体：(1)制备中华鳖特异性抗原：中华鳖颈部切断，采其血置于玻瓶，于室温下凝固，用无菌棒沿玻瓶内壁括拨将血块与瓶壁的粘连分离后，先于35～38℃放置1.5～3h，再于3～

6℃放置8～12h，血清充分析出，离心沉淀，取其上清，制SephadexG-200层析柱，中华鳖血清经硫酸铵水溶液粗提并透析浓缩后，用PBS(pH7.4)倍比稀释，经滤膜过滤后上样，用PBS洗脱，自动采样器收集洗脱液，并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度，最先洗脱的蛋白IgM即为中华鳖特异性抗原；该抗原蛋白H链分子量为63kD，L链分子量均为22kD；

(2)制备多克隆抗体：以所述中华鳖特异性抗原免疫动物，取血，分离出抗血清，纯化制得所述多克隆抗体，并以所述中华鳖特异性抗原的包被抗原检测所述抗血清，证明为含抗所述中华鳖特异性抗原的多克隆抗体；

(3)制备一种杂交瘤细胞株：以骨髓瘤细胞与产生抗中华鳖血清蛋白IgM抗体的脾细胞融合得该杂交瘤细胞株，所述的脾细胞取自以所述中华鳖血清蛋白IgM免疫的动物；

(4)制备一种抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体：以所述的杂交瘤细胞株产生该单克隆抗体，该单克隆抗体对所述的中华鳖免疫球蛋白IgM具有特异性。

2.如权利要求1所述的一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，其特征是步骤(1)中，所述血块与瓶壁的粘连分离后，先于37℃放置2h，再于4℃放置10h，血清充分析出后，2000r/mim离心沉淀；所述层析柱，柱长70cm，直径1.6cm。

3.如权利要求1或2所述所述的一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，其特征是所述硫酸铵水溶液为50％(W/W)水溶液。

4.如权利要求3所述的一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，其特征是所述滤膜为厚度0.45μm滤膜。

5.一种检测中华鳖免疫血清抗体效价的方法，其特征是用所述抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体检测中华鳖免疫血清抗体效价。

6.如权利要求5所述的方法，其特是用间接ELISA或间接竞争ELISA检测。

说明书

一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗水产生物免疫球蛋白单克隆抗体及其应用，特别是抗甲鱼免疫球蛋白单克隆抗体及应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着中华鳖养殖业的发展，中华鳖病害也日益猖獗。暴发性疾病的发生与流行阻碍了中华鳖养殖业的健康发展。要解决这些问题，除了加强管理、提高养殖技术外，还必须重视其病原学、免疫学等领域的研究，将免疫预防手段引入到中华鳖养殖业，通过免疫手段有效增强中华鳖主动防御能力，减少疾病发生机率。基于这种认识和生产上的需求，本发明者开展了针对中华鳖免疫球蛋白(IgM)单克隆抗体的研究。杂交瘤-单克隆抗体技术由KoTtler和Milstein发明于1975年。80年代初在世界各国兴起单克隆抗体研究热潮，现在每年都有近万篇有关单克隆抗体的研究报道，单克隆抗体已从初期的探索性研究进入大量开发、应用阶段。此外，单克隆抗体技术与现代分子生物学技术相结合还可以用于基因定位、表达文库的筛选、基因表达产物的检测与提纯。尽管单克隆抗体已广泛应用于生命科学的方方面面，但应用单克隆抗体研究水产类免疫球蛋白结构与功能，用于水产类病原微生物研究、检测与快速诊断方面的报道却为数不多，AK Siwicki制备了抗金鱼免疫球蛋白单克隆抗体并用于抗体分泌细胞和免疫水平监测，Lin和Harry应用单克隆抗体分析小瓜虫保护性抗原并进行了被动免疫实验，Austin建立以单克隆抗体为核心的水产病原快速检测方法。本发明是发明者开展中华鳖免疫球蛋白(IgM)单克隆抗体的研究，包括将单克隆抗体运用于中华鳖体液免疫应答规律的研究、病原诊断、流行病学、血清学调查和中华鳖IgM结构与功能的分析研究的构成部分。

发明内容

[0003] 本发明要解决当今应用单克隆抗体研究水产类免疫球蛋白结构与功能，单克隆体用于水产类病原微生物研究、检测与快速诊断方面的工作甚少，以至于对水产类生物特别是甲鱼的疾病诊断与防治困难的问题，为此提供本发明的一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体及其应用。

[0004] 为解决上述问题，本发明的技术方案包括一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体及这种单克隆抗体的应用。

[0005] 本发明的一种抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体，其特殊之处是该单克隆抗体是按以下步骤制备的抗体：

[0006] (1)制备中华鳖特异性抗原：中华鳖颈部切断，采其血置于玻瓶，于室温下凝固，用无菌棒沿玻瓶内壁括拨将血块与瓶壁的粘连分离后，先于35～38℃放置1.5～3h，再于3～6℃放置8～12h，血清充分析出，离心沉淀，取其上清，制SephadexG-200层析柱，中华鳖血清经硫酸铵水溶液粗提并透析浓缩后，用PBS(pH7.4)倍比稀释，经滤膜过滤后上样，用PBS洗脱，自动采样器收集洗脱液，并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度，最先洗脱的蛋白IgM即为中华鳖特异性抗原；该抗原蛋白H链分子量为63kD，L链分子量均为
22kD；

[0007] (2)制备多克隆抗体：以所述中华鳖特异性抗原免疫动物，取血，分离出抗血清，纯化制得所述多克隆抗体，并以所述中华鳖特异性抗原的包被抗原检测所述抗血清，证明为含抗所述中华鳖特异性抗原的多克隆抗体；

[0008] (3)制备一种杂交瘤细胞株：以骨髓瘤细胞与产生抗中华鳖血清蛋白IgM抗体的脾细胞融合得该杂交瘤细胞株(生物材料保藏日期：2009年6月2日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3113)，所述的脾细胞取自以所述中华鳖血清蛋白IgM免疫的动物；

[0009] (4)制备一种抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体：以所述的杂交瘤细胞株产生该单克隆抗体，该单克隆抗体对所述的中华鳖免疫球蛋白IgM具有特异性。

[0010] 步骤(1)中，所述血块与瓶壁的粘连分离后，宜先于37℃放置2h，再于4℃放置10h，血清充分析出后，2000r/mim离心沉淀；所述层析柱，以柱长70cm，直径1.6cm为合适。

[0011] 所述硫酸铵水溶液可以是50％(W/W)水溶液。

[0012] 所述滤膜为厚度0.45μm滤膜，该滤膜为业内常用滤膜。

[0013] 本发明所述单克隆抗体的应用，是指一种检测中华鳖免疫血清抗体效价的方法，其特殊之处是用所述抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体检测中华鳖免疫血清抗体效价。

[0014] 所述效价检测可以用间接ELISA或间接竞争ELISA检测。

[0015] 本发明所述的一种多克隆抗体，是以所述的免疫抗原(如中华鳖免疫球蛋白)免疫动物取血制得的抗血清，以所述的包被抗原(如中华鳖免疫球蛋白)检测该抗血清，可以证明含抗中华鳖免疫球蛋白的多克隆抗体。例如，抗中华鳖免疫球蛋白多抗是由Balb/c小鼠全血中分离获得的，是由上述免疫抗原刺激Balb/c小鼠机体而产生的针对中华鳖免疫球蛋白的特异性抗体。

[0016] 本发明所述的一种抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体，是由所述的杂交瘤细胞株所产生的、对中华鳖免疫球蛋白具有特异性的并含均一物质的抗体。该细胞分泌的免疫球5
蛋白能够有效特异的结合中华鳖免疫球蛋白，最高效价达到5.12×10，同时具有很好的特异性。例如，所述的细胞株来自于SP2/0细胞与Balb/C小鼠(经本发明所述免疫抗原免疫)脾细胞融合细胞，所述的免疫球蛋白来自于Balb/c小鼠，由杂交瘤细胞系免疫其机体后产生腹水而纯化获得。

[0017] 本发明所述的一种检测中华鳖免疫血清抗体效价的方法，是用所述的单克隆抗体检测，优选的是用间接竞争ELISA进行测定。

[0018] 综合上述，本发明是将纯化的中华鳖血清免疫球蛋白免疫动物，取其血，分离出抗血清，纯化制得所述多克隆抗体，通过产生抗中华鳖血清蛋白IgM抗体的脾细胞(取自以所述中华鳖血清蛋白IgM免疫的动物)与骨髓瘤细胞的融合获得能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株能够分泌中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体。用此抗体可用于中华鳖免疫血清效价的测定。该抗体具有高度特异、高度灵敏等特点，可用于中华鳖免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测和病原诊断、具有广阔的应用前景。

[0019] 本发明所述杂交瘤细胞株生物材料保藏日期：2009年6月2日，保藏编号：CGMCC No.3113，分类命名：杂交瘤细胞，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

[0020] 一、中华鳖IgM单克隆抗体的制备

[0021] (1)制备中华鳖特异性抗原：中华鳖颈部切断，采其血置于玻瓶，于室温下凝固，用无菌棒沿玻瓶内壁括拨将血块与瓶壁的粘连分离后，先于37℃放置2h，再于4℃放置10h，血清充分析出，2000r/min离心沉淀，取其上清，制SephadexG-200层析柱，柱长70cm，直径1.6cm，中华鳖血清经50％(W/W)硫酸铵水溶液粗提并透析浓缩后，用PBS(pH7.4)倍比稀释，经0.45μm滤膜过滤后上样，用PBS洗脱，自动采样器收集洗脱液，并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度，最先洗脱的蛋白IgM即为中华鳖特异性抗原；该抗原蛋白H链分子量为63kD，L链分子量均为22kD。

[0022] (2)制备多克隆抗体：以中华鳖特异性抗原免疫小鼠或兔，取血，分离出抗血清，纯化制得多克隆抗体。

[0023] (3)制备一种杂交瘤细胞株制备：以SP2/0骨髓瘤细胞与产生抗中华鳖血清蛋白IgM抗体的Balb/C小鼠脾细胞融合得杂交瘤细胞株。

[0024] (4)制备一种抗中华鳖免疫球蛋白的单克隆抗体：以所述的杂交瘤细胞株产生该单克隆抗体，该单克隆抗体对所述的中华鳖免疫球蛋白IgM具有特异性。

[0025] 步骤(2)中小鼠免疫及步骤(3)产生所述抗体的小鼠免疫具体为：

[0026] 以所述中华鳖特异性抗原免疫5只雌性Balb/C小鼠，另取5只做阴性对照。每次免疫以100μg/只的中华鳖免疫球蛋白剂量免疫小鼠。

[0027] 免疫程序采用两次基础免疫及二次加强免疫，基础免疫时间分别为：0d，15d，加强免疫：21d，融合前3天腹腔及尾静脉途径再加强免疫一次。将免疫抗原用生理盐水稀释，第一次基础免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内，第二次基础免疫取用弗氏不完全佐剂乳化好的抗原注射于小鼠的颈背部皮下(多点)或腹腔内，以后加强免疫同上述第二次基础免疫。步骤(3)制备杂交瘤细胞株具体为：

[0028] 细胞融合：提前制备小鼠饲养细胞层，步骤为颈椎脱臼法将Balb/C小鼠处死，用眼科剪刀剪开腹部皮肤，利用一次性注射器将不完全1640培养液注入小鼠腹腔内，反复抽吸几次，最后将注入的液体全部吸出，放入50ml离心管中，3000rpm离心10min用HAT培养液悬浮沉淀，混匀后以100μl/孔铺入96孔细胞培养板中。将SP2/0骨髓瘤细胞与前述免疫Balb/C小鼠脾细胞以1∶5的细胞个数比例，在50ml离心管中混匀，1000rpm，离心10min，弃上清(可用灭菌的滤纸吸干)；将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，然后在1min内慢慢滴入1ml预温至37℃的50％PEG，边加边轻轻用吸管尖搅拌，完全加完后继续搅拌30s，静置1min，然后慢慢加入37℃预温的1640基础培养液10ml。具体加入的方法：
第1min逐滴滴入1ml，第2min加1ml，第3-4min加3ml，第5min加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻搅拌。最后缓慢加入30ml 1640基础培养液，1000rpm离心7min，去上清，于37℃放置5min，用HAT完全培养基悬浮，得融合细胞；同时也用HAT培养基悬浮上述制备的饲养脾细胞，与上述融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT，接种于96孔细胞培养板中，约200μl/孔，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

[0029] 建立杂交瘤细胞系：提前制备饲养脾细胞(方法同上)，将杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板对活细胞进行计数：将细胞用1640完全培养基分别稀释到5，10，50个细胞/毫升，将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，使相应的孔平均分别含有0.5，1和5个细胞，培养第4天可换液一次，从第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。在克隆后第7-9d细胞克隆长满培养孔
1/3-1/2时，即可用间接竞争法去进行抗体特异性的检测，如检出特异性抗体阳性的细胞孔，可选择抗体效价高、呈单个克隆生长、生长状况良好的细胞，继续进行再克隆。将阳性孔的细胞移至24孔培养板，并在相对应的原孔中补加新鲜培养基，以防二者同时污染或细胞死亡。待24孔板中的细胞生长良好时，可转至100ml细胞培养瓶中培养，并及时冻存。

[0030] 动物体内诱生的方法制备腹水：在接种杂交瘤细胞前1-2周，先给Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡或弗氏不完全佐剂；将克隆成功的杂交瘤细胞1000rpm离心，弃6
上清，细胞用1640基础培养液悬浮，并将细胞数调至1x10 个/ml，以上每只小鼠腹腔注射0.5ml上述制备好的杂交瘤细胞悬液接种杂交瘤细胞后约10d，可见小鼠腹部明显膨大，此时用碘酒、酒精棉球对小鼠腹部皮肤消毒后，用5ml注射器抽取腹水，将腹水于4℃，
1000rpm离心10min，取上清，分装后置-20℃保存。

[0031] 腹水的纯化：取上述制备的腹水3ml，加入0.06mol/L，pH4.8的醋酸缓冲液6ml，混匀后在室温下边搅拌边加入99μl辛酸，持续搅拌30min，然后置于4℃静止2h以上。将溶液4℃，1000rpm离心30min，取上清，用2mol/L的NaOH调节pH值至7.4，往上清溶液中边搅拌边加入等体积的饱和硫酸按溶液，30min后，4℃静止2h以上。10000rpm离心30min，取沉淀溶于5ml0.01M，pH7.4的PBS中，混匀后置入0.01M的PBS中透析，4℃透析两日，每8h换一次液，两日后取出透析袋中的溶液，收集后经紫外分光光度计测定其蛋白含量后，按
5mg/ml分装冻存于-80℃。

[0032] 二、间接ELISA检测抗中华鳖免疫球蛋白单克隆抗体的效价

[0033] 取试验足够量的本发明所述的抗原，用包被液CBS进行稀释，加到ELISA板孔中，100μL/孔，然后将酶标板置4℃冰箱过夜。取出过夜的酶标板，用PBST充分洗涤3次后，每孔加入200μL含10％小牛血清的PBS 37℃封闭3h，同上洗涤。每孔加入100μL已建立的杂交瘤细胞培养上清，并从1∶100开始倍比稀释，37℃孵育1.5h，同上洗涤。每孔加入
50μL羊抗鼠IgG酶标抗体，37℃孵育1.5h，同上洗涤。加OPD显色液，每孔50μL，于37℃水浴避光显色10～15min。每孔加50μL 2mol/L硫酸终止反应。应用酶联免疫阅读仪读出OD490值。P/N≥2.1者判为阳性，P/N＜2.1者判为阴性。

[0034] 三、间接ELISA检测本发明所述单克隆抗体的特异性

[0035] 用间接ELISA的方法测所述单克隆抗体与另外种类鳖、鱼的IgM之间的交叉反应。将台湾甲鱼、泰国甲鱼、中华鳖、日本甲鱼、鲫鱼、花鱼骨、草鱼、鳗鱼、青鱼、鲢鱼、鳊鱼的血清进行1∶1000包被，以定株的阳性克隆的单本发明所述的克隆抗体的细胞上清作为一抗进行交叉反应的测定。结果表明本发明所述杂交瘤细胞3H3产生的本发明所述单克隆抗体对台湾甲鱼、泰国甲鱼和日本甲鱼有交叉反应。(表1)

[0036] 表1单抗的特异性鉴定

[0037]

[0038] 注：-为阴性，+为阳性

[0039] 四、中华鳖血清免疫效价的测定

[0040] (1)中华鳖免疫

[0041] 选择合适的免疫佐剂，制备中华鳖四价菌苗。在幼鳖转池或出温室季节，小批量免疫50只体重约100～150g/只的健康中华鳖，后肢肌肉注射，免疫剂量为0.2mL/只，并设置对照组，后腿部肌肉注射等量的生理盐水，共接种20只健康中华鳖。

[0042] (2)抗血清的采集

[0043] 将所述免疫的中华鳖，分别于0d、10d、20d、30d、40d、50d、60d、80d和100d时，随机采集3只受免中华鳖和1只对照组中华鳖的血液并制备血清。

[0044] (3)TAS-ELISA方法检测血清效价

[0045] 取四价菌苗用包被液CBS(pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释到1×109个/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃冰箱过夜。取出过夜的ELISA板，用PBST充分洗涤3～4次，每次3～5min。用含10％小牛血清的PBS封闭，200μL/孔，37℃封闭3h，同上洗涤。每孔加入
100μL所述中华鳖抗血清(1∶200开始作系列倍比稀释)，37℃孵育1.5h，同上洗涤。单抗孵育：每孔加入100μL所制备的中华鳖IgM单克隆抗体(1∶1000稀释)，37℃孵育1.5h，同上洗涤。酶标抗体孵育每孔加入50μL工作浓度(1∶1000)的羊抗鼠IgG酶标抗体，
37℃孵育1.5h，同上洗涤。加入磷酸-柠檬酸缓冲液配制的OPD底物液，每孔50μL，37℃避光显色10～15min。终止并读数每孔加50μL 2mol/L硫酸终止反应。应用酶联免疫阅读仪读出OD490值。P/N≥2.1者判为阳性，P/N＜2.1者判为阴性。(P代表TAS-ELISA所测受免鳖血清中抗体的OD值，N代表所测健康的相应血清中抗体的OD值。结果见表2。

[0046] 表2中华鳖免疫后血清中抗体效价

[0047]