一株镉盐抗性面包酵母及其应用

摘要

一株镉盐抗性面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54-11-11于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4189。应用该镉盐抗性面包酵母生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体的方法是：1)从活化斜面上挑取一环BV54-11-11菌体接入种子培养基中，制得种子液；2)将种子液以5～15％接种量，接入优化发酵培养基进行发酵。本发明的优点：在发酵得到富含谷胱甘肽的面包酵母菌体中，谷胱甘肽胞内含量可达19mg/g干菌体，既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌体蛋白两种产品，也可以直接作为功能性酵母使用。

权利要求

1.一株镉盐抗性面包酵母，其特征在于：所述面包酵母(Saccharomycescerevisiae)BV54-11-11于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4189。

2.一种应用权利要求1所述镉盐抗性面包酵母生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体的方法，其特征在于步骤为：

1)从活化斜面上挑取一环BV54-11-11菌体接入种子培养基中，在温度为26～30℃下静置培养20～24h，即得种子液；

2)将种子液以5～15％接种量，接入优化发酵培养基进行发酵，发酵条件为：装液量(30～80)mL/250mL、转速150～200r/min、温度26～30℃、pH值5.5～6.5、培养时间

20～30h。

3.根据权利要求2所述应用镉盐抗性面包酵母生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体的方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

4.根据权利要求2所述应用镉盐抗性面包酵母生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体的方法，其特征在于：所述优化发酵培养基的组成为：葡萄糖25～35g/L、玉米浆0.3～1.0％(v/v)、(NH4)H2PO4(1～3)g/L、KH2PO4(0.5～2)g/L、MgSO4·7H2O(0.05～0.3)g/L。

说明书

一株镉盐抗性面包酵母及其应用

【技术领域】

[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株镉盐抗性面包酵母及其在生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体中的应用。【背景技术】：

[0002] 谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的生物活性三肽，在生物体内分为还原型和氧化型，其中还原型GSH分子中同时含有γ-谷氨酰基和活性巯基，可参与多种生物反应，对维持细胞的正常状态具有重要意义。GSH在抗氧化、清除自由基、解毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线等方面发挥重要作用，是重要的功能因子，因此，在食品工业、医药工业中应用非常广泛，应用前景广阔。

[0003] 谷胱甘肽的生产方法有溶剂萃取法、化学合成法、生物法，生物法包括酶法和发酵法，其中发酵法是利用微生物自身代谢产生谷胱甘肽，与其他方法相比具有简便、易控、易扩大生产等优点，是目前主要的谷胱甘肽生产方法。发酵法生产谷胱甘肽的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的谷胱甘肽含量，二者的有机结合将有利于谷胱甘肽产量的大幅度提高。细胞密度的提高可通过对发酵过程的优化控制(包括高密度培养)获得，而胞内谷胱甘肽含量的提高通常是由菌种选育来实现的，主要有两种方法：一是采用常规诱变育种选育高产菌株，二是利用遗传工程技术构建具有谷胱甘肽合成酶活性的基因工程菌。

[0004] 目前能较多地积累谷胱甘肽的菌种主要为酵母菌，采用的菌种选育方法主要是化学诱变法(亚硝基胍、硫酸二乙酯等)和物理诱变法(紫外线和X射线)，得到的突变株以乙硫氨酸抗性株、甲硫氨酸敏感株、锌离子抗性株等为主，本发明经紫外和硫酸二乙酯复合诱变，以硫酸镉抗性为筛选标记，筛选得到一株镉盐抗性、胞内GSH生成量提高的面包酵母菌株。【发明内容】：

[0005] 本发明目的是提供一株镉盐抗性面包酵母突变株以及利用该菌株生产富含谷胱甘肽酵母菌体的方法。

[0006] 本发明的技术方案：

[0007] 一株镉盐抗性面包酵母，所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54-11-11于2010年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4189。

[0008] 一种应用所述镉盐抗性面包酵母生产富含谷胱甘肽面包酵母菌体的方法，步骤为：

[0009] 1)从活化斜面上挑取一环BV54-11-11菌体接入种子培养基中，在温度为26～30℃下静置培养20～24h，即得种子液；

[0010] 2)将种子液以5～15％接种量，接入优化发酵培养基进行发酵，发酵条件为：装液量(30～80)mL/250mL、转速150～200r/min、温度26～30℃、pH值5.5～6.5、培养时间20～30h。

[0011] 所述种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L。

[0012] 所述优化发酵培养基的组成为：葡萄糖25～35g/L、玉米浆0.3～1.0％(v/v)、(NH4)H2PO4(1～3)g/L、KH2PO4(0.5～2)g/L、MgSO4·7H2O (0.05～0.3)g/L。

[0013] 本发明的优点和积极效果：

[0014] 本发明提供了一株镉盐抗性、可在胞内富集谷胱甘肽的面包酵母菌株，应用该面包酵母可发酵得到富含谷胱甘肽的面包酵母菌体，谷胱甘肽胞内含量可达19mg/g干菌体；所得富含谷胱甘肽的面包酵母菌体既可以用于谷胱甘肽提取得到谷胱甘肽和菌体蛋白两种产品，也可以直接作为功能性酵母使用。
【具体实施方式】：

[0015] 实施例1：镉盐抗性、可富集谷胱甘肽面包酵母菌株的诱变筛选[0016] 1)紫外诱变及筛选

[0017] 以面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BV54为出发菌株，从斜面上挑取一环BV54置于50mL YPD培养基中，30℃静置培养36h，制备一级种子。以2％接种量接种于装有50mL YPD的250mL三角瓶中，30℃，150r/min培养10h，使菌体生长处于对数生长末期。摇
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匀后取1mL菌液，用0.85％的生理盐水稀释到菌体浓度10，分别取0.1mL稀释液涂布于含有不同浓度镉盐的抗性验证平板上，30℃培养3～4d，观察其生长情况，如表1所示。

[0018] 表1面包酵母BV54镉盐抗性验证

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[0020] “++”：表示有较强的生长；“+”：表示有较弱的生长；“-”：表示不能生长[0021] 由表1可知，面包酵母BV54在0.90mmol/L镉盐抗性平板上有较弱的生长，而在1.00mmol/L镉盐抗性平板上不能生长，故选择含1.00mmol/L硫酸镉的YPD平板作为面包酵母BV54紫外诱变初筛平板。

[0022] 以面包酵母BV54为出发菌株，根据酵母GSH生成量和其镉盐抗性的关系，利用镉盐抗性平板来筛选GSH产量提高的突变株。选择致死率为85％的紫外诱变剂量(照射120s)对面包酵母进行诱变，将诱变后的菌液均匀涂布于1.0mmol/L的镉盐抗性平板上，
30℃避光培养3～4d后挑取突变株，最后获得39株GSH明显提高的面包酵母突变株，命名为BV54-1～BV54-39，选择谷胱甘肽含量提高明显的BV54-11菌株进行化学诱变。

[0023] 2)化学诱变及筛选

[0024] 按上述面包酵母BV54培养方法培养BV54-11，确定镉盐抗性筛选平板。结果见表2。

[0025] 表2面包酵母BV54-11镉盐抗性验证

[0026]

[0027] “++”：表示有较强的生长；“+”：表示有较弱的生长；“-”：表示不能生长