一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用

摘要

本发明公开了一株有机溶剂耐受型假单胞菌，该菌名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCC NO.3758。本发明还公开了所述假单胞菌在降解多环芳烃中的应用。本发明的假单胞菌B6-3具有很强的有机溶剂耐受能力，可耐受log Pow在2.5-5.6之间的高毒性有机溶剂，可在有机溶剂的胁迫下利用联苯为唯一碳源生长；能够降解13种美国国家环保局(EPA)规定优先消减的多环芳烃(PAHs)。本发明的假单胞菌B6-3在有机溶剂和多环芳烃共存的极端污染环境的修复处理方面具有很大的应用前景。

权利要求

1.一株有机溶剂耐受型假单胞菌，其特征在于，该菌名为假单胞菌Pseudomonas sp.B6-3，已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏登记号为CGMCC NO.3758。

2.一种如权利要求1所述假单胞菌在降解多环芳烃中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解含有芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)苝、茚并(1，2，3-cd)芘的多环芳烃混合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3的培养温度为30℃，培养摇床转速为200rpm。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述无机盐培养基的配方是：每1,000ml去离子水中含有K2HPO4·3H2O 5.2g；KH2PO43.7g；Na2SO41.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；NH4Cl2.0g；

微量金属盐溶液1ml；其中，所述微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有FeCl2·4H2O 0.3g，CoCl2·6H2O0.038g，MnCl2·4H2O 0.02g，ZnCl20.014g，H3BO30.0124g，Na2MoO4·2H2O0.04g，CuCl2·2H2O 0.0034g。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述唯一碳源联苯的浓度为2.4g/L。

说明书

一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种生物技术领域的假单胞菌及其应用，尤其涉及的是一种一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用。

背景技术

[0002] 近年来，随着工农业生产的迅速发展，全球土壤，水分以及大气的污染程度越来越严重。环境污染已经成为当今世界各国普遍关注的热点问题。在各类污染物中，多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)类化合物分布广泛，危害最为严重。环境中的PAHs主要来源于石油泄漏，以及煤、石油、木材、有机高分子化合物的不完全燃烧。PAHs稳定性强，生物富集率高，潜在毒性大，具有致畸、致癌和致突变等作用。在总数已达1,000多种的环境致癌物中，PAHs占了三分之一以上，为数量最多的一类。美国环保局(EPA)在上世纪80年代就将16种PAHs列入了优先控制的环境污染物黑名单，我国也已经把PAHs列入环境污染的黑名单。消减PAHs污染对于改善人类生存环境，提高人类生活质量具有重大意义。由于PAHs非常顽固，自然条件下很难通过温和的化学作用降解，PAHs除了很少一部分发生光化学分解之外，绝大部分都是通过生物降解途径从环境中慢慢消失。因此，利用微生物降解作用加速PAHs转化为无害物质的过程被认为是修复PAHs污染环境的最佳途径。目前，人们通过富集培养已经分离出许多PAHs降解菌株。但是，对于实际石油污染环境下的PAHs降解，微生物面临复杂的生存压力，特别是石油成份作为有机溶剂对细胞的毒性作用。对微生物的生理研究证明有机溶剂的毒性和它们的油水分配系数(log Pow)-溶剂在辛醇和水相中的分配系数的对数值有关。溶剂的极性越大，log Pow值就越小，溶剂毒性也越大。一般认为，log Pow值在1～5之间的有机溶剂在水层(细胞存在于水层)的分配比例较高，进入细胞膜脂双层的溶剂含量高，所以对细胞产生的毒性极大。石油污染物大部分为脂溶的疏水性有机物，能破坏细胞膜，危害细胞的结构和功能完整性，导致细胞的破裂死亡。因此，迫切需要寻找能够耐受有机溶剂的PAHs降解菌株用于增强石油污染环境的修复。

[0003] 有机溶剂耐受菌是一类新的能与有害影响因素竞争并能在高浓度有机溶剂中茁壮生长的微生物。一般来说，由于有机溶剂对细菌有毒性，所以一直以来人们都认为细菌不能在有机溶剂环境中生存。1989年，Inoue等关于溶剂耐受性微生物的报道改变了人们对微生物生存能力的认识，自此各国研究者陆续分离出多种有机溶剂耐受微生物，并发现了微生物对有机溶剂产生抗性的多种机理，如有机溶剂输出泵、快速修复膜、降低膜透性、增加膜严密度和降低细胞表面疏水性等，能使细菌设法避开有害因素。

[0004] 现有技术文献已经有关于能够以毒性有机溶剂苯乙烯为碳源生长菌株的研究，也有报道通过基因工程改造之后，中国专利号：200610044410.1；公开号为：1861785；名称为：一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌及其在双液相反应中的应用。该技术公开了一株可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌，该菌株于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为：No.M 206011。本发明还公开了所述的可耐受有机溶剂的恶臭假单胞菌在双液相反应中的应用，其方法包括：(1)菌株选择，(2)种子细胞培养，(3)制备催化剂细胞，(4)收集催化剂细胞，(5)休止细胞制备，(6)在双液相反应中处理样品，(7)样品检测；该菌株具有很强的耐受有机溶剂的能力，且具有较高的降解二苯并噻吩、4-甲基二苯并噻吩、4，6-二甲基二苯并噻吩和3-甲基苯并噻吩的能力。有机溶剂耐受菌株也能够转化毒性有机溶剂甲苯以及进行生物脱硫，然而，有机溶剂耐受菌株对于PAHs的降解未见报道。在石油以及一些工业污染的环境中，有机溶剂往往伴随着多环芳烃共同存在于污染体系中，大部分细菌能够通过细胞结构的改变抵抗低浓度、毒性相对较低的有机溶剂。但是一些毒性极强log Pow值为1～5的有机溶剂，例如苯及其烷基衍生物即使在极低的浓度下(0.1％)也极易导致细胞的死亡。因此，获得具有能在毒性有机溶剂存在条件下生长的PAHs降解菌株用于污染环境修复具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对目前存在的降解多环芳烃的难题和现实的迫切需求，本发明提供了一株有机溶剂耐受型假单胞菌及其在降解多环芳烃中的应用。

[0006] 本发明所述的有机溶剂耐受型假单胞菌，该菌名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏登记号为CGMCCNO.3758。

[0007] 所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，来源于化工厂被PAHs污染的土壤，经富集培养、分离得到。

[0008] 所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3，该菌株菌落呈亮白色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，该菌株为革兰氏阴性，杆状，端部有鞭毛，具有过氧化物酶、乙醇脱氢酶、氧化酶活性，不能产生硝化反应，无尿素酶、明胶水解酶的活性。该菌株的脂肪酸类型与荧光假单胞菌A型(Pseudomonas fluorescens biotype A)的相似度最高，为0.957。

[0009] 本发明所述的有机溶剂耐受型假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3在降解多环芳烃中的应用，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解含有芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)苝、茚并(1，2，3-cd)芘的多环芳烃混合物。

[0010] 其中，上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3富集培养所用培养基为无机盐培养基。所述无机盐培养基的配方是：每1,000ml去离子水中含有K2HPO4·3H2O 5.2g；KH2PO43.7g；Na2SO41.0g；MgSO4·7h2O 0.2g；NH4Cl 2.0g；微量金属盐溶液1ml；其中，所述微量金属盐溶液配方为1000ml去离子水中含有FeCl2·4H2O 0.3g，CoCl2·6H2O
0.038g，MnCl2·4H2O 0.02g，ZnCl2 0.014g，H3BO3 0.0124g，Na2MoO4·2H2O 0.04g，CuCl2·2H2O0.0034g。

[0011] 其中，所述无机盐培养基中加入的唯一碳源是联苯，其浓度为2.4g/L。富集培养、分离菌株时加入联苯固体5g/L。

[0012] 其中，所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3的培养温度优选为30℃，培养摇床转速优选为200rpm。

[0013] 本发明提供的假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3能够以联苯为唯一碳源生长，能够耐受有机溶剂，并且能够降解13种EPA规定优先控制PAHs混合物。

[0014] 本发明所提供的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3能够利用联苯为唯一碳源生长，将联苯矿化为CO2和H2O。在纯培养条件下，该菌株能在20h内将无机盐培养基中2.4g/L的联苯降解90％以上，菌液的浊度由OD620为0.14增加到最大值2.06。

[0015] 本发明所提供的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3能够耐受log Pow值为2.5体积比为20％的有机溶剂甲苯(20％为甲苯和LB培养基体积比)，在体积比高达100％(有机溶剂和LB培养基的体积比)的对二甲苯(log Pow为3.1)中能够生长良好。添加体积比1～4％的柴油能够促进假单胞菌B6-3在无机盐培养基中利用联苯生长，更高浓度的柴油只是略微抑制假单胞菌B6-3的生长。

[0016] 所述的LB培养基的配方为：每1,000ml去离子水中含有：酵母膏5g；蛋白胨5g；NaCl10g；用NaOH溶液调pH值为7.0。

[0017] 本发明所提供的菌株假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3在无机盐培养基中利用联苯为唯一碳源生长后能够同时降解13种美国国家环保局(EPA)公布的优先消减的多环芳烃混合物，包括芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)苝、茚并(1，2，3-cd)芘。利用OD620为5.0的细胞悬液，5天内，芴和蒽的降解率达到100％，同时，上述其它多环芳烃的降解率介于48.8％到76.8％之间。在石油以及一些工业有机物污染的环境中，有机溶剂往往伴随着PAHs共同存在于污染体系中，以往报道的PAHs降解菌株在这种有机溶剂毒性的环境下很难存活，往往达不到修复PAHs污染的效果。本发明与现有的PAHs降解菌株相比，具有耐受有机溶剂的特点，这对于PAHs降解菌株在环境修复中的实际应用更具优势。

附图说明

[0018] 图1为假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-2脂肪酸分析的气相色谱图；

[0019] 其中：图中各个峰对应的脂肪酸标注在表1中。

[0020] 表1：图1中各个峰对应脂肪酸的鉴定、分析结果

[0021]保留时间(min) 脂肪酸名称 相对含量(％)
1.621 Solvent peak ...
3.131 10:1 0.12
4.226 10:03OH 3.26
4.761 12:0 2.67
5.324 unknown 0.07
6.162 12:02OH 4.10
6.544 12:03OH 3.86
7.292 14:0 0.42
8.841 15:0 0.25
10.211 16:1w7c 35.31
10.513 16:0 31.22
11.891 17:1w8c 0.13
12.058 17:0CYCLO 0.73
12.247 17:0 0.23
13.706 18:1w7c 17.23
14.014 18:0 0.39

[0022] 图2为假单胞菌B6-3在有机溶剂/LB培养基(体积比为20％)双液相相体系中的生长情况。

[0023] 其中：“□”为不加有机溶剂的空白对照；“▲”为正癸烷胁迫条件下菌株的生长；“●”为正庚烷胁迫条件下菌株的生长；“◇”为对二甲苯胁迫条件下菌株的生长；“■”为甲苯胁迫条件下菌株的生长；“○”为苯胁迫条件下菌株的生长。

[0024] 图3为假单胞菌B6-3在不同体积比的有机溶剂/LB培养基双液相体系中生长12h后的浊度。

[0025] 图4为假单胞菌B6-3在不同体积比的柴油/无机盐培养基双液相体系中利用2.4g/L联苯生长的情况。

具体实施方式

[0026] 本实施例主要提出了有机溶剂耐受型假单胞菌(Pseudomonas putida)B6-3在有机溶剂存在环境中降解多环芳烃的应用，但本发明内容不仅限于此。

[0027] 以下实例中所述无机盐培养基配方均为每1,000ml去离子水中含有：K2HPO4·3H2O5.2g；KH2PO4 3.7g；Na2SO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；NH4Cl 2.0g；微量金属盐溶液1ml。其中，微量金属盐溶液配方为(去离子水1,000ml)：FeCl2·4H2O 0.3g，CoCl2·6H2O 0.038g，MnCl2·4H2O 0.02g，ZnCl2 0.014g，H3BO3 0.0124g，Na2MoO4·2H2O 0.04g，CuCl2·2H2O
0.0034g。

[0028] 以下实例中所用LB培养基配方为每1,000ml去离子水中含有：酵母膏5g；蛋白胨5g；NaCl 10g；用NaOH溶液调pH值为7.0。

[0029] 其中，无机盐培养基和LB培养基在使用前于121摄氏度灭菌15分钟。

[0030] 以下实施例所述假单胞菌B6-3的培养温度为30摄氏度，培养摇床转速为200rpm。

[0031] 实施例1：

[0032] 假单胞菌B6-3的筛选和鉴定

[0033] 取使用联苯的化工厂内污染的土壤样品加入到无机盐培养基中，加入5g/L固体联苯富集培养，培养10天后开始传代培养，培养条件同上，每三天转接一次，转接10次后将培养液适当稀释后用无机盐固体培养基(无机盐培养基中加入2％的琼脂)培养，筛选能够生长的菌株。选生长最好一株菌转接到无机盐液体培养基，加入2.4g/L的联苯培养，得到菌株命名为菌株B6-3。

[0034] 按照“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京：科学出版社，2001.2)和“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株B6-3进行形态特征观察和生理生化特性鉴定。

[0035] 鉴定结果如下：

[0036] 菌株B6-3菌落呈亮白色、圆形、边缘整齐、光滑湿润，该菌株为革兰氏阴性，杆状，端部有鞭毛，具有过氧化物酶、乙醇脱氢酶、氧化酶活性，不能产生硝化反应，无尿素酶、明胶水解酶的活性，符合假单胞菌的特性；命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3。该菌株的脂肪酸类型与荧光假单胞菌A型(Pseudomonas fluorescensbiotype A)的相似度最高，为0.957。

[0037] 上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)B6-3已于2010年4月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏登记号为CGMCC NO.3758。

[0038] 实施例2：

[0039] 假单胞菌B6-3利用联苯生长能力测定

[0040] 种子培养：利用无机盐培养基培养假单胞菌B6-3，加入2.4g/L的联苯，培养20h后离心收集菌体，用无机盐培养基洗3次，用无机盐培养基重悬菌体后调OD620为3.0，所得悬浮液即为种子培养液。

[0041] 假单胞菌生长能力：将种子培养液加入到无机盐培养基中，获得初始OD620为0.14的菌液，加入2.4g/L的联苯，不同时间取样，检测菌液的浊度和联苯的含量。

[0042] 其中，联苯含量的测定利用高效液相色谱(HPLC)法：样品加入2倍体积的无水乙醇后离心，上清用微孔滤膜过滤后用HPLC检测。其中，高效液相色谱仪为美国安捷伦公司生产，HPLC条件为：柱型C18×15cm；柱温，30℃；流动相为，甲醇/水(V/V)＝80/20，0.5ml/min；检测波长254nm。

[0043] 结果：

[0044] 假单胞菌B6-3能够在20h内将无机盐培养基中2.4g/L的联苯降解90％以上，菌液的浊度由OD620为0.14增加到最大值2.06。

[0045] 实施例3：

[0046] 假单胞菌B6-3耐受有机溶剂能力分析

[0047] 种子培养基为利用LB培养基(含体积比为0.3％的对二甲苯)培养的B6-3菌液。

[0048] 有机溶剂(log Pow)分别选择体积比为20％的苯(2)，甲苯(2.5)，对二甲苯(3.1)，正庚烷(4.1)和正葵烷(5.6)；为了进一步验证菌体在更高浓度有机溶剂中的耐受性，检测了菌体在有机溶剂和LB培养基的比分别为20％，50％，100％的甲苯，对二甲苯，正庚烷和正癸烷中的生长情况。每个实验平行三份。

[0049] 结果：

[0050] 假单胞菌B6-3在有机溶剂/LB培养基体积比为20％的双液相体系中的生长情况显示。随着有机溶剂log Pow值的增大，菌体的耐受性逐渐增强，在logPow为2.5的有机溶剂甲苯中，假单胞菌B6-3都能生长。而且假单胞菌B6-3能够耐受有机溶剂/LB培养基体积比高达100％的对二甲苯，正庚烷，正癸烷。Log Pow值介于1～5之间的有机溶剂对细胞的毒性非常大，这些有机溶剂即使在体积比只有0.1％的低浓度下都会导致细胞的死亡。实验结果说明B6-2具有非常强的有机溶剂耐受能力。

[0051] 实施例4：

[0052] 假单胞菌B6-3耐受柴油实验

[0053] 种子培养基为利用无机盐培养基(加入体积比为0.3％的对二甲苯)以2.4g/L联苯为唯一碳源培养的假单胞菌B6-3菌液。

[0054] 有机相分别选择体积比为0％，1％，2％，4％，6％，8％，10％，12％的独山子柴油，联苯的浓度为2.4g/L。实验中使用无机盐培养基，不同时间取样测菌液的浊度，以不加柴油和联苯，以及不加联苯加入1％柴油的生长体系作为空白对照。

[0055] 结果：

[0056] 柴油成分包括链烷烃、环烷烃、苯及其衍生物、各种PAHs及其衍生物等，对细菌具有很强的毒性。假单胞菌B6-3不能利用独山子柴油为碳源生长，能够在柴油的胁迫下利用联苯为唯一碳源生长，并且在柴油含量1-4％范围内时，随着柴油含量的增加，菌体的生长速度有增快趋势，更高浓度的柴油只是略微抑制假单胞菌B6-3的生长。

[0057] 实施例5：

[0058] 假单胞菌B6-3降解多环芳烃混合物

[0059] 利用无机盐培养基，以2.4g/L的联苯为唯一碳源培养假单胞菌B6-3，20小时后，收集菌体细胞，用无机盐培养基洗3次。将菌体重悬至无机盐培养基中，获得OD620为5.0的菌液。将菌液分装于250ml无菌的磨口三角瓶中，每瓶5ml，加入13种PAHs的混合物(芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽、苯并(k)荧蒽、苯并(a)芘、二苯并(a，h)蒽、苯并(g，h，i)苝、茚并(1，2，3-cd)芘)，培养5天后取样，用高效液相色谱(HPLC)分析各多环芳烃的降解情况。

[0060] 其中，联苯的测定利用高效液相色谱(HPLC)法：将样品利用等量的乙酸乙酯全萃取三次，将有机相用无水硫酸钠除水，利用氮吹仪浓缩后检测。高效液相色谱仪为美国安捷伦公司生产，HPLC条件为：柱型C18×15cm；柱温，30℃；检测波长254nm。流动相条件如表2所示：

[0061] 表2利用液相色谱检测多环芳烃混合物的流动相条件

[0062]步骤 时间(min) 水(％) 甲醇(％) 流速(ml/min)
1 0 35 65 0.7
2 80 20 80 0.7
3 100 10 90 0.7
4 120 5 95 0.7
5 130 5 95 0.7
6 140 35 65 0.7

[0063] 结果：

[0064] 所有上述具有2-6个苯环的多环芳烃都能够被假单胞菌B6-3降解。5天内，B6-3对芴和蒽的降解率为100％，对其它化合物的降解率介于48.8％到76.8％之间。结果总结见表3。

[0065] 表3假单胞菌B6-3对13种EPA规定优先控制PAHs混合物的降解情况

[0066]化合物 原样品中含量(ppb) 降解后含量(ppb) 降解率
芴 29.1±1.3 0 100
菲 203.9±14.1 73.0±12.6 64.19±6.18
蒽 19.3±1.5 0 100
荧蒽 531.8±3.7 188.9±12.6 64.48±2.37
芘 358.1±12.3 135.1±6.3 62.27±1.76
苯并(a)蒽 84.5±0.8 35.6±1.4 57.86±1.67
屈 343.7±0.1 124.7±13.3 63.74±3.88
苯并(b)荧蒽 257.6±0.4 81.4±5.5 68.4±2.15
苯并(k)荧蒽 157.7±2.4 57.4±3.7 63.6±2.32
苯并(a)芘 161.7±14.7 82.7±7.5 48.8±4.65
二苯并(a，h)蒽 65.5±1.8 30.6±0.9 53.3±1.40
苯并(g，h，i)苝 441.1±10.5 102.5±4.6 76.76±1.05
茚并(1，2，3-cd)芘 129.7±2.3 60.3±3.7 53.53±2.87

[0067] 多环芳烃属于难降解化合物，特别是随着苯环数目的增加其生物可降解性越小，本发明的假单胞菌B6-3对这些芳香化合物的高效降解说明在底物选择性上其对2-6苯环范围内的稠环PAHs没有很高的特异性，适合用于被混合芳香化合物污染环境的生物修复。