一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用

摘要

本发明从福建省永泰县的西瓜根际土壤中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌株，该菌株为短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX(Brevibacillus brevisFJAT-0809-GLX)，并采用该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵液获得一种能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂。本发明的优点在于：提供了一种新的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX，并且采用该短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX发酵液制备能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂，该菌剂能够降低龙眼的腐烂率，且可保持果实的色泽和口味。

权利要求

一种新的短短芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为短短芽孢杆菌菌株FJAT‑0809‑GLX(Brevibacillus brevis FJAT‑0809‑GLX)，于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4115。

2. 一种龙眼微生物保鲜菌剂，其特征在于：其制备方法的具体步骤为：(1)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的活化：用接种环将短短芽孢杆菌 FJAT-0809-GLX划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，并且培养温度为30°C ；(2)制备种子液：将步骤（1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌落接 种于IOOml的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30°C，转速ISOrpm/ min ；(3)制备液体发酵液：按10%移种量将步骤（2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发 酵培养基中培养，温度30°C，转速ISOrpm/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发 酵液检测其PH值及孢子数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵液；(4)保鲜菌剂的制备：把NaCl和琼脂粉按照10 ： 1的质量配比混合后高压灭菌，待温 度冷却到40-50°C时，将步骤（3)所获得的液体发酵液与该混合液以4 ： 1的比例混勻即可 获得所述龙眼微生物保鲜菌剂。

3.如权利要求2所述一种龙眼微生物保鲜菌剂，其特征在于：所述菌株培养基的组分： 牛肉浸膏0. 3 %，蛋白胨0. 5 %，葡萄糖1 %，琼脂粉1.7%，蒸馏水配制，pH7. 0 ；所述种子培养基的组分：淀粉1 %，牛肉浸膏0. 5 %，蛋白胨0. 3 %，蔗糖1 %，酵母粉 0. 5%, CaCl2O. 5%,蒸馏水配制，pH7. 0 ；所述发酵培养基的组分：淀粉0. 8%，豆饼粉3%，蛋白胨0. 2%，蔗糖2%，CaCl2O. 5%， 消泡剂0. 17%，蒸馏水配制，pH7. 0。

说明书

一种新的短短芽孢杆菌菌株及其应用

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种新的短短芽孢杆菌菌株及应用其 制备龙眼微生物保鲜菌剂。【背景技术】

[0002] 目前我国经过保鲜贮藏的果蔬比例较小，由于保鲜处理不好，致使果品每年损耗 率在20%至25%，蔬菜每年的损耗率达30%，果蔬每年的损耗量上亿吨。如果利用好保鲜 技术、保鲜材料以及相应的设施，增加的收入是相当惊人的，有关统计资料显示，如果使我 国果蔬损耗率降低3%至5%，全国每年可减少果品损耗200万吨，减少蔬菜损耗1000多万 吨；如果贮藏保鲜量占到总产量的15%至20%，年贮藏保鲜量为6000万吨到8000万吨，按 每公斤贮藏以0. 2元计算，全国的果蔬产值可增加120亿元至160亿元。

[0003] 当前的水果保鲜主要借助于使用化学和物理方法进行控制，然而，许多化学保鲜 剂如亚硝酸钠、苯甲酸钠及SO2等会残留在贮藏的水果中，危害人体健康，而许多物理方法 由于受到设备条件、操作技术等限制而无法得到应用。微生物是广泛分布于自然界的生物 类群，由于种类丰富、代谢途径多样，能产生多种生物活性物质，对各种动植物的生理、生化 代谢具有重要的影响，有些微生物对各种病原微生物有着较强的拮抗作用。因此，将微生物 应用于龙眼水果的保鲜，有着巨大的潜力，Gutter于1953年首次报道了枯草芽孢杆菌对柑 桔果实采后病原菌有拮抗作用，目前美国等已将2种防治水果采后病害的拮抗生物登记注 册（Huang，1995)，但未见将短短芽孢杆菌作为生产龙眼微生物保鲜菌剂的应用。【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种新的短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX(Brevibaci1Ius brevis FJAT-0809-GLX)，该短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX于2010年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 4115，且采用该新菌株 的发酵液获得一种能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂。

[0005] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

[0006] 本实验室从福建省永泰县的西瓜根际土壤中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌 株，并将该菌株送至中国科学院微生物研究所对其理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为短 芽孢杆菌菌属的一个菌株。

[0007] 进一步地，采用该新菌株的发酵液制备一种能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌 剂，其制备方法的具体步骤为：

[0008] (1)菌株的活化：用接种环将短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX划线于菌株培养 基上，并于恒温培养箱中培养24h，并且培养温度为30°C ；

[0009] (2)制备种子液：将步骤（1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌 落接种于IOOml的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30°C，转速180rpm/min ；

[0010] (3)制备液体发酵液：按10%移种量将步骤（2)所获得的种子液转入已灭菌的发 酵培养基中培养，温度30°C，转速ISOrpm/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发 酵液检测其PH值及孢子数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵液；

[0011] (4)保鲜菌剂的制备：把NaCl和琼脂粉按照10 ： 1的质量配比混合后高压灭菌， 待温度冷却到40-50°C时，将步骤（3)所获得的液体发酵液与该混合液以4 ： 1的比例混勻 即可获得所述龙眼微生物保鲜菌剂。

[0012] 进一步地，所述菌株培养基的组分：牛肉浸膏0. 3%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖1 %，琼 脂粉1.7%，蒸馏水配制，pH7.0;

[0013] 所述种子培养基的组分：淀粉1 %，牛肉浸膏0. 5%，蛋白胨0. 3%，蔗糖1 %，酵母 粉 0.5%，CaCl2O. 5%，蒸馏水配制，pH7. O ；

[0014] 所述发酵培养基的组分：淀粉0.8%，豆饼粉3 %，蛋白胨0.2%，蔗糖2 %， CaCl2O. 5%，消泡剂0. 17%，蒸馏水配制，pH7. O。

[0015] 本发明的有益效果在于：提供了一种新的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX，并 且采用该短短芽孢杆菌菌株发酵液制备能够对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂，该菌剂能 够降低龙眼的腐烂率，且可保持果实的色泽和口味。【具体实施方式】

[0016] 本发明一种新的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX是从福建省永泰县的西瓜根 际土壤中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌株，且通过该菌株的发酵液制备获得一种能够 对龙眼进行保鲜的微生物保鲜菌剂。

[0017] 1.该菌株 FJAT-0809-GLX 的分离：

[0018] (1)取西瓜根际土壤IOg于90mL无菌水中，充分振荡后吸取ImL进行梯度稀释，选 用稀释度为IO-4, IO-5或10_6 ；

[0019] (2)将步骤（1)获得的土壤稀释液涂布于NA培养基平板上，然后将NA培养基平板 置于30°C下培养2d;

[0020] (3)将步骤（2)培养获得的各菌株接种于营养琼脂培养基中，并在温度30°C、转速 180r · HiirT1条件下培养48h，收集培养液；

[0021] (4)通过供试病原菌（从福建省泉州市农科所采收的一种名为“福眼”的龙眼中分 离得到的4株龙眼腐生细菌）且采用管碟法对收集到的培养液中的菌株进行拮抗筛选，具 体为：取所述培养液150 μ 1于牛津杯中，在30°C下培养48h后观察，并采用无菌水作阴性 对照，农用硫酸链霉素作阳性对照CK，通过观察抑菌圈大小筛选得到拮抗菌株。

[0022] 2.该菌株 FJAT-0809-GLX 的鉴定：

[0023] 将所获得的拮抗菌株送至中国科学院微生物研究所对其理化特性等进行鉴定，得 到该菌株的主要形态及生物学特征如下：菌落无光泽，不透明，浅黄色，表面湿润，革兰氏染 色呈阳性，营养体细胞杆状，大小约0. 7X 2. 6 μ m，周生鞭毛；芽孢近椭圆形，中生，不膨大， 无其它特殊结构。以下是其具体生理生化鉴定指标：

[0024]

[0025]细胞直径>1μιη - L-阿拉伯糖 -形成芽孢 + 甘露醇 +芽孢膨大 + 利用葡萄糖产气 -芽孢圆形 - 利用柠檬酸盐 +接触酶 + 硝酸盐还原 +氧化酶 + 50 °C生长 -厌氧生长 - PH5.7生长 +VP试验 - 7% NaCl生长 -VPPH 7 - 明胶液化 +甲基红试验 - 分解酪素 -

[0026] 注：+表示有作用或有反应；-表示无作用或无反应

[0027] 将上述各指标结合16S rDNA序列进行比对后鉴定该菌株为短短芽孢杆菌 (Brevibacillus brevis)0

[0028] 3.龙眼微生物保鲜菌剂的具体制备步骤为：

[0029] (1)短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的活化：用接种环将短短芽孢杆菌菌株 FJAT-0809-GLX划线于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，并且培养温度为30°C ；

[0030] (2)制备种子液：将步骤（1)所获得的短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的单菌 落接种于IOOml的种子培养基中，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30°C，转速 180rpm/min ；

[0031] (3)制备液体发酵液：按10%移种量将步骤⑵所获得的种子液转入已消毒灭菌 的发酵培养基中培养，温度30°C，转速ISOrpm/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量 的发酵液检测其PH值及血球数量，当其孢子数达到IOX IO8AiL时则获得所需的液体发酵 液；

[0032] (4)保鲜菌剂的制备：把NaCl和琼脂粉按照10 ： 1的质量配比混合后高压灭菌， 待温度冷却到40-50°C时，将步骤（3)所获得的液体发酵液与该混合液以4 ： 1的比例混勻 即可获得所述龙眼微生物保鲜菌剂。

[0033] 其中，菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，琼脂粉 1.7%，无菌水配制，pH7. O ；

[0034] 种子培养基的组分：淀粉1%，牛肉浸膏0.5%，蛋白胨0.3%，蔗糖1%，酵母粉 0. 5%, CaCl2O. 5%，无菌水配制，pH7. O ；

[0035] 发酵培养基的组分：淀粉0. 8 %，豆饼粉3%，蛋白胨0. 2%，蔗糖2%，CaCl2O. 5%， 消泡剂0. 17%，无菌水配制，pH7. O。

[0036] 另外，上述各培养基组分中的百分比均为质量比。

[0037] 4.对龙眼微生物保鲜菌剂进行保鲜试验：5[0038] (1)试验材料

[0039] 供试品种：福建省泉州市龙眼主栽品种——福眼

[0040] (2)试验方法

[0041] 保鲜药剂喷施方法（喷施时间为龙眼采收前一天的下午或傍晚，天气为晴天）：设 置实验组和对照组，两组分别选取5株长势均勻且着生于同一高度的龙眼果实进行喷施， 龙眼微生物保鲜菌剂稀释50倍后对实验组进行喷施，而对照组采用清水为对照进行喷施， 然后将两组采收后的龙眼分装在农用萝筐里，轻放，置于室内保存，且在室温28-32°C和相 对湿度60-74%下贮藏，5天后进行好果率和可溶性固形物含量以及果实色泽调查。

[0042] (3)试验结果

[0043] 如表1所示，在室温贮藏5天后，从好果率来看，对照组的好果率只有47. 46%，而 经龙眼微生物保鲜菌剂处理的实验组的好果率达到83. 33% ；从脱粒率看，实验组的脱粒率 最低只有12. 96%，而对照组的脱果率达69. 70%之高；龙眼微生物保鲜菌剂处理后龙眼果 实的可溶性固形物含量与对照组相差不大，对照组为16. 50%，龙眼微生物保鲜菌剂处理后 (即实验组）的可溶性固形物含量为16. 40%，说明经过龙眼微生物保鲜菌剂处理后，果实 的品质未发生很大变化。

[0044] 表1龙眼微生物保鲜菌剂对龙眼的保鲜效果

[0045]

[0046] 综上，本发明利用短短芽孢杆菌菌株FJAT-0809-GLX的发酵液制备所得的龙眼微 生物保鲜菌剂不仅能够降低龙眼的腐烂率，而且可保持果实的色泽和口味。