一种猪诱导性多能干细胞诱导方法

摘要

本发明公开了一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因构建融合蛋白慢病毒表达载体用于猪诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，分离培养的细胞克隆得到猪诱导性多能干细胞。

权利要求

1.一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、限定因子慢病毒表达载体的构建：

根据猪Sox2、c-Myc、K1f4基因的mRNA序列和人Oct4的DNA序列，设计合成出pSox2、pK1f4、pc-Myc、hOct4基因的上、下游引物；

从猪囊胚中提取总RNA，利用设计合成出的pSox2、pK1f4和pc-Myc基因的上、下游引物经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人Oct4的DNA序列经hOct4基因的上、下游引物直接从人Oct4基因中扩增获取，将猪限定基因DNA和人Oct4的DNA序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体pLEGFP-N1连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3.7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；

所述的pSox2、pK1f4、pc-Myc、hOct4基因的上、下游引物DNA序列为：

pSox2上游：5’-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3’；

下游：5’-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3’；

pK1f4上游：5’-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3’；

下游：5’-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3’；

pc-Myc上游：5’-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3’；

下游：5’-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3’；

hOct4上游：5’-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’；

下游：5’-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3’。

(2)、猪胎儿成纤维细胞的诱导：

采用组织块培养法建立猪胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到293T细胞，12-16h后换无病毒的293T细胞培养液，病毒包装48h后收集病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有猪胎儿成纤维细胞培养板内，病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞，感染6-7天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经DispaseII消化，接种至丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染15-16天后，猪胚胎干细胞样克隆明显可见。

2.根据权利要求1所述的猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，所述的慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体构建的具体操作步骤包括：首先将pLL3.7用Apa I进行酶切，T4DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列；设计载体改造引物，从构建好的逆转录病毒融合蛋白表达载体中经载体改造引物扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列，然后用Mun I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出的CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3.7连接进行重组，构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；

所述的设计载体改造引物的DNA序列为：

上游：5’-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’；

下游：5’-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’。

3.根据权利要求1所述的猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的病毒包装前一天汇合293T细胞，293T细胞培养液为：含8-12％的胎牛血清、

95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM，细胞汇合50-60％时进行病毒包装；所述的病毒包装采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到293T细胞，12-16h后换293T细胞新鲜培养液，48h后收集含病毒培养液经0.45μm的滤膜过滤后转移到Millipore的100KD超滤管中，在3-5℃下4000rpm离心

20-40min得浓缩病毒液。

4.根据权利要求1所述的猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述的病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞的前一天将猪胎儿成纤维细胞注入到猪胎儿成纤

5

维细胞培养板内，细胞密度为1×10/孔，猪胎儿成纤维细胞培养液为：含8-12％的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM，24小时后换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μg/mL Polybrene的猪胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染，12小时后换无病毒液的猪胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染的第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μg/mL Polybrene的猪胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换无病毒液的猪胎儿成纤维细胞培养液，经过2次慢病毒感染后即病毒开始感染的第三天将猪胎儿成纤维细胞培养板内的培养液更换为猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液，成纤维细胞的形态开始发生改变，即少量猪胎儿成纤维细胞由长梭形变成圆球形，并且呈集落样生长时，用Dispase II消化接种到丝裂霉素C处理的12.5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加新的猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液在37.5℃、5％CO2饱和湿度下继续进行培养。

5.根据权利要求1所述的猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于：所述的小鼠胎儿成纤维细胞系培养的具体步骤为：取妊娠55-65天的杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿，采用组织块培养法建立成纤维细胞系，培养液为：8-12％的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM；所述的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备方法为选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经9-11ug/ml的丝裂霉素C处理2-3h，常规胰酶消化接种到铺过浓度为0.008-0.012g/L明胶的培养皿内进行培养，接种细胞密度5

为2×10 个/ml。

6.根据权利要求4所述的猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于：所述的猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液为：含1.5-2.5mM谷氨酰胺、1.5-2.5mM丙酮酸钠、

0.8-1.2％的非必须氨基酸、0.08-0.12mM β-巯基乙醇、990-1100U/ml LIF、3.5-4.5ng/ml bFGF、13-17％的FBS和0.8-1.2％青链霉素的高糖DMEM。

说明书

一种猪诱导性多能干细胞诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞诱导领域，具体是一种猪诱导性多能干细胞诱导方法。

背景技术

[0002] 多年来，人们一直在研究细胞的重编程及细胞核的潜在全能性，1998年多利羊的诞生标志着已将这一研究工作推进到哺乳动物领域。2006年，日本京都大学的Yamanaka教授在《Cell》上发表了具有里程碑意义的文章(Takahashi K和Yamanaka S，2006)，详细介绍了其利用四种限定因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将小鼠成纤维细胞重编程逆转为类似于多能性干细胞的研究工作及结果，从此开创了诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)时代。由于多能性干细胞(pluripotent stem cells)具有形成人和动物个体内所有类型细胞的多向分化潜能和不断自我更新的特性，使其在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学研究、药理及毒理学等领域的研究中有着其独特的作用和优越性，也正是由于诱导性多能干技术研究同时具备如此深远的科学价值和广泛的应用价值，其已成为当今生物学研究的热点之一，并在2007年分别被Nature、Science评为第一及第二大科学进展，又在2008年荣登Science十大科技进展榜首。在国内，中国科学院动物研究所周琪研究组和上海交通大学医学院曾凡一研究组合作诱导产生的小鼠诱导性多能干细胞通过四倍体胚胎互补技术获得了完全由诱导性多能干细胞制备的活体小鼠，有力地证明了诱导性多能干细胞具有真正的全能性(Zhao XY et al.，2009)。周琪等将诱导性多能干细胞研究推进到了一个新的高度，成为中国科学家在这一国际热点研究领域所作出的一项重要贡献。这一合作研究成果“诱导性多能干细胞的全能性被首次证明”成功入选2009年中国十大科技进展新闻和世界十大科技进展新闻。

[0003] 与小鼠、大鼠、猴子等动物来源的胚胎不同，从猪胚胎分离出的细胞系在培养过程中很不稳定，很快就会失去其特性。尽管各国科学家已有多年的尝试，但目前尚未有成功分离猪的多能性胚胎干细胞系的报道。因此如果通过限定因子成功诱导产生具有全能性的猪诱导性多能干细胞，那么就能够有效地利用其干细胞特征进行相关的科学研究。例如，借助猪和人有许多生理同源性，利用猪源的多能性干细胞系可再现人类重大疾病(如心血管系统疾病)的发生发展过程、开发相应的大动物模型，用于针对该重大疾病的药物研发以及病因发病机制的研究。同时，中国是猪肉产品最大的生产和消费国，猪源的诱导性多能干细胞同样有可能用于提高猪肉质量以及与干细胞相关的饲养方式。

[0004] 目前，世界上关于猪诱导性多能干细胞技术的研究仅有3篇文献报道，最早是在中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿博士领导的研究小组获得了成功。他们利用逆转录病毒载体介导人或小鼠4种限定因子基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)成功将西藏小型猪的成纤维细胞诱导成西藏猪的诱导性多能干细胞，其形态类似于人类或猴类的胚胎干细胞。该研究结果在线发表于2009年4月21日的《The Journal of Biological Chemistry》杂志上(Esteban MA et al.，2009)。随后，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊博士领导的研究小组和美国哥伦比亚州密苏里大学R.Michael Roberts领导的研究小组也相继利用慢病毒载体介导人或小鼠4种限定因子成功诱导产生了猪诱导性多能干细胞。但上述三个研究小组均未用组建限定因子融合蛋白来进行猪诱导性多能干细胞的诱导。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)构建融合蛋白慢病毒表达载体用于猪诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，成功分离培养得到猪诱导性多能干细胞。

[0006] 本发明的技术方案为：

[0007] 2、一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：

[0008] (1)、限定因子慢病毒表达载体的构建：

[0009] 根据猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人Oct4的DNA序列，设计合成出pSox2、pKlf4、pc-Myc、hOct4基因的上、下游引物；

[0010] 从猪囊胚中提取总RNA，利用设计合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游引物经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人Oct4的DNA序列经hOct4基因的上、下游引物直接从人Oct4基因中扩增获取，将猪限定基因DNA和人Oct4的DNA序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体pLEGFP-N1连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3.7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；

[0011] 所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、hOct4基因的上、下游引物DNA序列为：

[0012] pSox2上游：5’-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3’；

[0013] 下游：5’-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3’；

[0014] pKlf4上游：5’-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3’；

[0015] 下游：5’-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3’；

[0016] pc-Myc上游：5’-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3’；

[0017] 下游：5’-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3’；

[0018] hOct4上游：5’-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’；

[0019] 下游：5’-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3’。

[0020] (2)、猪胎儿成纤维细胞的诱导：

[0021] 采用组织块培养法建立猪胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到293T细胞，12-16h后换无病毒的293T细胞培养液，病毒包装48h后收集病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有猪胎儿成纤维细胞培养板内，病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞，感染6-7天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经DispaseII消化，接种至丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染15-16天后，猪胚胎干细胞样克隆明显可见。

[0022] 所述的慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体构建的具体操作步骤包括：首先将pLL3.7用Apa I进行酶切，T4 DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列；设计载体改造引物，从构建好的逆转录病毒融合蛋白表达载体中经载体改造引物扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列，然后用Mun I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出的CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3.7连接进行重组，构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；

[0023] 所述的设计载体改造引物的DNA序列为：

[0024] 上游：5’-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’；

[0025] 下游：5’-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’。

[0026] 所述的病毒包装前一天汇合293T细胞，293T细胞培养液为：含8-12％的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM，细胞汇合50-60％时进行病毒包装；所述的病毒包装采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到293T细胞，12-16h后换293T细胞新鲜培养液，48h后收集含病毒培养液经0.45μm的滤膜过滤后转移到Millipore的100KD超滤管中，在3-5℃下4000rpm离心20-40min得浓缩病毒液。

[0027] 所述的病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞的前一天将猪胎儿成纤维细胞注入到猪5
胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为1×10/孔，猪胎儿成纤维细胞培养液为：含8-12％的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM，24小时后换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μg/mL Polybrene的猪胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染，
12小时后换无病毒液的猪胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染的第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μg/mLPolybrene的猪胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换无病毒液的猪胎儿成纤维细胞培养液，经过2次慢病毒感染后即病毒开始感染的第三天将猪胎儿成纤维细胞培养板内的培养液更换为猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液，成纤维细胞的形态开始发生改变，即少量猪胎儿成纤维细胞由长梭形变成圆球形，并且呈集落样生长时，用Dispase II消化接种到丝裂霉素C处理的12.5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加新的猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液在37.5℃、5％CO2饱和湿度下继续进行培养。

[0028] 所述的小鼠胎儿成纤维细胞系培养的具体步骤为：取妊娠55-65天的杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿，采用组织块培养法建立成纤维细胞系，培养液为：8-12％的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0.08-0.12mg/ml链霉素的高糖DMEM；所述的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备方法为选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经9-11ug/ml的丝裂霉素C处理2-3h，常规胰酶消化接种到铺过浓度为0.008-0.012g/L明胶的培养皿内进5
行培养，接种细胞密度为2×10 个/ml。

[0029] 所述的猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液为：含1.5-2.5mM谷氨酰胺、1.5-2.5mM丙酮酸钠、0.8-1.2％的非必须氨基酸、0.08-0.12 mM β-巯基乙醇、990-1100U/ml LIF、3.5-4.5ng/ml bFGF、13-17％的FBS和0.8-1.2％青链霉素的高糖DMEM。

[0030] 本发明所述的％均值占总体积的体积百分比。

[0031] 所述的猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列信息来自美国国立生物技术信息中心数据库。

[0032] 所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc基因的上、下游引物是指能从物种猪的DNA片段中扩增出相应基因的特定DNA序列。hOct4基因的上、下游引物是指从直接人Oct4基因中扩增出hOct4基因的特定DNA序列。

[0033] 所述的载体改造引物是指从构建好的逆转录病毒载体质粒pLEGFP--hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4中扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列的特定DNA序列，引物一般是自己设计，专门的生物公司合成。

[0034] 本发明的优点在于：

[0035] (1)、从发明利用外源限定因子与EGFP构建融合蛋白慢病毒表达载体用于猪诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代，能够逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导性多能干细胞；因此，此发明技术能够成功诱导猪体细胞重编程为多能性干细胞；

[0036] (2)、本发明采用外源限定因子和EGFP组建的融合蛋白进行诱导性多能干细胞的诱导，融合蛋白(fusion protein)是采用DNA重组技术在基因水平上将两种蛋白质或蛋白质结构域的编码区依读码框架首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物；融合蛋白技术因其在目的蛋白的表达、构建具有双功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代的作用，在医药，农业，环境等的生产、研究中有着重要的用途，在基因工程的研究中显示了广阔的应用前景；EGFP是荧光蛋白家族中常用的一种，荧光具有高度稳定性，对于外源限定因子在细胞重编程过程中发挥作用的机制和特点，外源限定因子和EGFP组建的融合蛋白能够有效地检测、追踪和掌握外源限定因子的特点，有助于将来进行诱导性多能干细胞的机理研究，而在已报道的猪诱导性多能干细胞技术中均未采用限定因子融合蛋白这一技术用于诱导性多能干细胞的诱导；

[0037] (3)、本发明应用的限定因子，除Oct3/4基因是来自于人的DNA序列外，余3种因子(Sox2、Klf4和c-Myc)均是来自于猪的DNA序列。

附图说明

[0038] 图1是pLL3.7质粒图谱示意图。

[0039] 图2是限定因子融合蛋白逆转录病毒载体质粒构建图谱示意图。

[0040] 图3是限定因子融合蛋白慢病毒载体质粒pLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4-GFP构建图谱示意图。

[0041] 图4是猪诱导性多能干细胞诱导过程示意图。

[0042] 图5是病毒感染前猪胎儿成纤维细胞的形态图。

[0043] 图6是病毒感染2次后第6天的猪胎儿成纤维细胞的形态图。

[0044] 图7是猪诱导性多能干细胞克隆形态图。

[0045] 图8是第13代猪诱导性多能干细胞核型图。

[0046] 图9是RT-PCR检测多能性基因图，图中1代表猪胎儿成纤维细胞，2-3代表猪诱导性多能干细胞，4代表小鼠ES细胞。

[0047] 图10是是猪诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞AP染色的显微镜图。

[0048] 图11是猪诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞Oct4蛋白的表达的显微镜图。

[0049] 图12是猪诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞Nanog蛋白的表达的显微镜图。

[0050] 图13是猪诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞SSEA-1蛋白的表达的显微镜图。

[0051] 图14是猪诱导性多能干细胞在裸鼠体内的神经管样组织的显微镜图。

[0052] 图15是猪诱导性多能干细胞在裸鼠体内的腺管样组织的显微镜图。

[0053] 图16是猪诱导性多能干细胞在裸鼠体内的软骨样组织的显微镜图。

具体实施方式

[0054] 猪诱导性多能干细胞诱导方法：

[0055] (1)、限定因子慢病毒表达载体的构建

[0056] 试剂：限制性内切酶、cDNA第一链合成试剂盒、T4 DNA聚合酶和连接酶均购自TaKaRa生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、NTP均购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成和测序均由上海生物工程有限公司完成。

[0057] 方 法： 根 据 NCBI 上 猪 Sox2(NM 001123197)、c-Myc(NM 001005154)、Klf4(NM001031782)基因的mRNA序列，设计合成上、下游引物，引物序列如下：

[0058] pSox2上游：5’-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3’

[0059] 下游：5’-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3’

[0060] pKlf4上游：5’-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3’

[0061] 下游：5’-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3’

[0062] pc-Myc上游：5’-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3’

[0063] 下游：5’-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3’

[0064] hOct4上游：5’-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’

[0065] 下游：5’-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3’

[0066] 载体改造引物：上游：5’-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’[0067] 下游：5’-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’

[0068] 从猪囊胚中提取总RNA，经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人Oct4的DNA序列直接从人Oct4基因中扩增获取，经限制性内切酶酶切，与逆转录病毒载体pLEGFP-N1连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体。从重构的逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把重组逆转录病毒载体中扩增的启动子和限定基因融合蛋白序列与酶切后的pLL3.7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体(图3)。具体操作步骤如下：首先将pLL3.7用Apa I进行酶切，T4 DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列。设计载体改造引物从构建好的逆转录病毒载体质粒pLEGFP--hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4中扩增出CMV启动子、目的片段和EGFP序列，然后用Mun I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将两者连接即构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体。(此为本发明的技术关键点和欲保护点之一)

[0069] (2)、猪胎儿成纤维细胞的诱导

[0070] 材料和试剂：

[0071] 胎猪成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts，PEFs)的分离和培养：取妊娠55-65天的杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿，采用组织块培养法建立胎猪成纤维细胞系，培养液为含有占体积百分比10％胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素的高糖DMEM(Hyclone)。

[0072] 胎鼠成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts，MEFs)系的建立：妊娠12.5dICR品系胎鼠，去除头、四肢和内脏后采用胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞。培养液为含有占体积百分比10％新生牛血清(四季青)的高糖DMEM(Hyclone)。

[0073] 饲养层的制备：选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经10ug/ml的丝裂霉素C(Sigma)处理2.5h，常规胰酶消化接种到铺过0.01g/L明胶的培养皿内，接种细胞密5
度为2×10 个/ml。培养液同小鼠胚胎成纤维细胞培养液。

[0074] 猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液：含有2mM谷氨酰胺(Gibco)、2mM丙酮酸钠(Gibco)、占体积百分比1％非必须氨基酸(Gibco)、0.1mM β-巯基乙醇(Sigma)、1000U/ml LIF(ESGRO，Chemicon International)、4ng/ml bFGF(Sigma)、占体积百分比15％FBS(Hyclone)、占体积百分比1％青链霉素(Gibco)的高糖DMEM(Hyclone)。

[0075] 293T细胞培养液同PEFs培养液，所有细胞均在37.5℃，5％CO2，饱和湿度下CO2培养箱中培养。

[0076] 方法：取妊娠55-65天的杜洛克-长白-大约克三元杂交猪胎儿，采用组织块培养法建立猪胎儿成纤维细胞系，胎猪成纤维细胞从第2代开始感染，具体的重编程方案见图4，采用磷酸钙法转染四因子质粒PLL-hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4和包装组分pMDLg、pRSV REV和pVSVg到293T细胞，12-16h后换新鲜培养液，病毒包装48h后收集含病毒培养液，含病毒培养液经0.45μm的滤膜过滤后转移到Millipore的100KD超滤管中，在4℃下4000rpm离心20-40min得浓缩病毒液。病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞的前一天将猪胎儿
5
成纤维细胞注入到6孔板内，细胞密度为1×10/孔，培养液为含占体积百分比10％胎牛血清，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素的高糖DMEM，第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为
10μg/mL Polybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液，12小时后换新鲜牛胎儿成纤维细胞培养液，第三天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μg/mL Polybrene的猪胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换新鲜猪胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞的当天记为0天，经过2次慢病毒感染第3d更换猪诱导性多能干细胞诱导和维持培养液，第6d细胞形态出现集落变化后，Dispase II(Roche)消化后接种到12.5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加干细胞培养液在37.5℃、5％CO2饱和湿度下进行培养，到感染后第
15-16d天，圆形的边界清楚的胚胎干细胞样克隆明显可见。用Dispase II消化克隆接种到新的饲养层上继续扩增培养，刚开始按1∶1的比例传代，然后按1∶4的比例传代，每隔
3-4d左右传代一次。

[0077] (3)、猪诱导细胞的鉴定

[0078] RT-PCR检测：应用Trizol试剂(Invitrogen)处理猪诱导性多能干细胞，然后提取细胞总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书(Takara公司)合成cDNA。鉴定引物扩增相应基因，Klf4、c-Myc引物序列同1.1中相应载体构建引物，其余引物序列如下：

[0079] pOct4上游：5’-TATAAGCTTGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTT-3’

[0080] 下游：5’-AAAGGATCCGCGTTTGAATGCATGGGGGAGCCC-3’

[0081] pNanog上游：5’-CTTCTCGAGGCCACCATGAGTGTGGATCCAGCTT-3’

[0082] 下游：5’-GCGAAGCTTCATATCTTCAGGCTGTATGTTC-3’

[0083] GAPDH上游：5’-TTGGTATCGTGGAAGGACTCTA-3’

[0084] 下游：5’-TGTCATATTTGGCAGGTT-3’

[0085] 核型分析：0.1μg/ml秋水仙素(Sigma)处理猪诱导性多能干细胞2.5h，胰酶消化并重悬于0.075 mol/L KCL，37℃孵育25min，固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定10min，离心固定重复3次。收获细胞，滴片，Gimsa染色，空气干燥，封片。显微镜下观察及应用相关软件分析染色体配对。

[0086] 免疫荧光检测：细胞经4％多聚甲醛固定，1％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30min，添加一抗为兔抗Oct4(Abcam)、山羊抗Nanog(R&D)、鼠抗SSEA-1(Chemicon)、鼠抗SSEA-3(R&D)、鼠抗SSEA-4(R&D)、鼠抗TRA-1-60(Chemicon)、鼠抗TRA-1-81(Chemicon)，按
1∶200稀释后4℃孵育过夜。PBS洗3次，CY3红色荧光标记的二抗按1∶200稀释后室温避光孵育1h，PBS洗3次，用1μg/mL的DAPI(Roche)进行细胞核染色1min后荧光镜下观察结果。

[0087] AP染色：用4％多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)染液进行染色，以胞浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。

[0088] 体内分化检测：Dispase II消化猪诱导性多能干细胞，无血清DMEM重悬细胞后注射到免疫缺陷鼠(BALB/C-nu)背侧皮下，注射8w后处死裸鼠，取肿瘤组织4％多聚甲醛固定后进行苏木精伊红染色。

[0089] (4)、结果：

[0090] 磷酸钙法包装的限定因子慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞，在干细胞培养液培养条件下6-7d后，猪胎儿成纤维细胞的形态开始发生改变，少量猪胎儿成纤维细胞逐渐由长梭形转变成圆球形，呈聚集性生长。Dispase II消化的圆球形细胞在饲养层细胞上，用含1000U/ml LIF和4ng/ml bFGF的干细胞培养液培养条件下，在感染后第16d，边界明显的集落状细胞克隆逐渐形成。高倍显微镜下集落中的单个细胞呈现细胞核较大，核质比例较高。
在1∶4传代的情况下细胞克隆大约每隔3-4d传代一次，细胞集落生长传代稳定(图6，7，
8)。对传至第13代的猪诱导性多能干细胞进行核型分析显示猪诱导性多能干细胞染色体数为38，XY正常核型(图9)。RT-PCR检测限定因子融合蛋白诱导的猪诱导性多能干细胞相关多能性基因的表达，猪诱导性多能干细胞表达Oct4、c-Myc、Klf4和Nanog基因，相同条件下猪胎儿成纤维细胞表达Nanog基因，不表达Oct4、c-Myc、Klf4等相关基因(图10，11，
12，13)。AP在早期胚胎的干细胞中有较高表达，而在已分化的细胞中活性明显降低，甚至不表达，AP的表达是一种ES细胞及相关干细胞的重要特征之一。AP染色结果显示限定因子融合蛋白诱导的猪诱导性多能干细胞AP表达为强阳性(图9)。细胞免疫荧光检测显示诱导培养的猪诱导性多能干细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白(图11，12，13)，对于Oct4蛋白的表达检测，携带外源限定因子的细胞在整个细胞克隆中呈现Oct4蛋白强表达，EGFP为强表达的细胞则Oct4蛋白检测为强阳性，EGFP表达较弱或沉寂的细胞则Oct4蛋白表达水平呈现一般阳性(图11)，在相同条件下，Nanog蛋白的表达水平在细胞集落中介于表达EGFP或不表达EGFP的细胞之间没有差异。SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等蛋白未见表达。取限定因子融合蛋白诱导的猪诱导性多能干细胞在BALB/C裸鼠皮下8w后形成的畸胎瘤，HE染色结果显示在畸胎瘤组织内存在神经、肌肉、腺体、软骨等三个胚层来源的细胞和组织(图14，15，16)。