一种选育高效抗镉微生物原生质体多亲本融合的方法

摘要

本发明公开了一种通过诱变提高芽孢杆菌对镉的耐受性的方法，包括以下步骤：(1)以枯草芽孢杆菌作为出发菌，将芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基上预培养10h(2)预培养后的活菌落进行紫外线诱变：用15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射5min进行诱变，诱变后在浓度梯度培养基平板和摇瓶发酵方法筛选，所得活菌落即为对镉具高耐受性的突变杆菌。通过本方法，得到对高浓度镉充分耐受的突变杆菌B38，其对镉的耐受浓度达到3mmol/L。

权利要求

1.一种选育高效抗镉菌株原生质体多亲本融合的方法，包含有培养斜面孢子、菌株诱变、筛选的方法，其特征首先对微生物进行人工诱变，经筛选获得对镉具有高效抗镉性能的突变微生物；接下来以具有高效抗镉性能的突变微生物为出发菌株，经过原生体制备和原生体融合为主的基因组改组、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的高效抗镉融合菌株。

2.根据权利要求1所述的选育抗镉菌株原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的基因组改组中原生质体的制备时：(1)将野生型菌株枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌，分别在30℃的温度下培养24h后，然后按1-2％的接种量转接到新鲜液体培养基中，分别培养10h和14h。

(2)将(1)中的菌悬液置于盛有4mL/皿二硫苏糖醇(DTT)溶液的培养皿中，室温预处理0.5h，离心。

(3)将(2)中获得的菌株，3500r/min离心15min收获菌体。用高渗缓冲液洗涤2次。

(4)将10mL(3)中获得的菌株置于含酶的培养皿中，对于枯草芽孢杆菌的细胞壁用2％溶菌酶来酶解2h，热带假丝酵母菌的细胞壁用2％蜗牛酶来酶解2h。

(5)对枯草芽孢杆菌以及热带假丝酵母菌的原生质体进行诱变，获得的优良抗镉突变6

菌株，在30℃的温度下培养24h后，加磷酸缓冲液制备悬浮孢子，孢子量在1×10/mL。

3.根据权利要求1所述选育抗镉菌株原生质体多亲本融合的方法，其特征是原生质体融合时：

1)将高渗溶液加入到制备好的原生质体沉淀中，吹匀；

2)取6株原生质体集中到一个培养皿内，进行融合，融合30min，以高渗溶液稀释；

3)取一定的稀释液分离到事先制备好的双层高渗再生培养基上，于30℃培养48h，菌落上长出一定量孢子，供初筛。

4.根据权利要求1所述的选育抗镉菌株原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的DTT溶液是用高渗溶液进行配制，终浓度为0.01mol/L。

5.根据权利要求1所述的选育抗镉菌株原生质体多亲本融合的方法，其特征是所述的递推式多次融合是指在第一次基因组改组、筛选的基础上的再次改组与筛选，经过3次基因组改组获得高效抗镉融合菌。

说明书

一种选育高效抗镉微生物原生质体多亲本融合的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物育种方法，具体说涉及建立一种基于基因组改组技术进行原生质体多亲本融合的方法。技术背景

[0002] 镉(Cd)是生物毒性极强的重金属元素，与Pb、Cr、As和Hg合称为“五毒”，位列第二。近年来，现代工业的发展以及镉在冶炼、化工、造纸和电子工业等方面的广泛应用，使得Cd污染日趋严重。因此，如何修复环境中的镉污染，成为国内外研究的热点。目前，关于微生物修复镉污染的研究主要集中于对耐镉微生物的选择策略上。

[0003] 2002年，美国加州Maxgen公司的Cardayré等人提出了Genome Shuffling技术(国内翻译成“基因组改组”)的概念，它把传统微生物诱变育种技术与细胞融合技术结合，在微生物菌株诱变的基础上，通过细胞融合，使多个亲本杂交，产生新的复合子代。其具体操作过程是通过对出发菌株进行诱变，然后在模拟DNA重组的条件下对原生质体进行多亲本递推式多次融合(recursive protoplast)，最后筛选出具有多重正向进化标记的目标菌株。此技术的育种效果十分显著，在提高微生物对有毒物质的耐受性和降解能力方面也有成功的例子。Dai等通过三轮基因组改组将Sphingobilum chlorophenolicum对剧毒杀虫剂五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上，并可将培养基中所含的3mmol/L五氯苯酚完全降解。但是，在微生物处理重金属污染物方面，还没有采用该技术获取优良微生物报道。

[0004] 2009年，王婷、姜春晓、孙红文等首次将基因组改组技术用于研究抗镉微生物育种，改组得到的融合菌与原出发菌株相比抗镉性能有大幅度的提高。

发明内容

[0005] 本发明的目的是以真核微生物和原核微生物为出发菌株，通过建立一种原生质体多亲本融合方法，对菌株的抗镉性能进行改造，提高其对镉的耐受性。

[0006] 为实现本发明的目的采用的技术方案是：以人工诱变的突变菌株为出发菌株，采用细胞原生质体多亲本融合方法，经培养斜面孢子、菌株诱变、基因组改组、筛选、递推式多次融合，获得具有较好性状优势的抗镉融合菌株。具体通过以下步骤实现：

[0007] 第一步：培养诱变用斜面孢子

[0008] 将菌株接种于斜面培养基中，一段时间后，加磷酸缓冲液制备悬浮孢子，孢子量在6
1×10 个/mL。

[0009] 第二步：菌株诱变取5mL孢子悬液转移至培养皿中，于15W紫外线灯下照射1-5min或者于终浓度为0.1mol/L的亚硝酸溶液处理10-20min。将孢子悬液涂布于琼脂发酵培养基平板上，30℃培养约24h，肉眼可见微小的菌落。用含镉浓度梯度琼脂平板初筛抗镉突变菌株，接种至斜面培养，进一步摇瓶培养复筛，最终获得6株遗传稳定的高效抗镉突变菌株，并测定其抗镉性能。

[0010] 第三步：基因组改组

[0011] 原生质体的制备

[0012] 将诱变后获得的6株优良抗镉菌株，接种于斜面培养基，在30℃的温度下培养24h6
后，加磷酸缓冲液制备悬浮孢子，孢子量在1×10 个/mL。

[0013] 在9cm培养皿中倒入菌丝生长培养基，冷却后，将以上孢子悬液涂布其上.诱变后获得的优良抗镉菌株子30℃培养24h。

[0014] 将预培养的菌株置于盛有二硫苏糖醇(DTT)溶液的培养皿中(4mL/皿)室温预处理半小时(DTT溶液以高渗溶液配制，终浓度为0.01mol/L)，离心。

[0015] 将菌丝转移到盛有溶菌酶(芽孢杆菌突变菌酶解)或者蜗牛酶液(热带假丝酵母菌酶解)的培养皿(4mL酶液/皿)中，30℃处理2个小时。从0.5个小时起每隔0.5个小时用显微镜观察原生质体的形成。当大部分细胞转化成球形的原生质体时，3500r/min离心约10min，弃去上清液，终止酶解，用高渗磷酸缓冲液洗涤2次，重新将原生质体悬浮于高渗磷酸缓冲液中，原生质体供以下融合试验。

[0016] 原生质体融合

[0017] 用高渗溶液配制的40％聚乙二醇(PEG)溶液加入到原生质体沉淀中，吹匀，将6株原生质体集中到一个皿内，进行融合，融合30min，以高渗溶液稀释PEG处理后的原生质体融合液，取一定的稀释液分离到事先制备好的双层高渗再生培养基上.于30℃培养约48h，菌落上长出一定量孢子，供以下初筛。

[0018] 第四步：筛选

[0019] 初筛

[0020] 浓度梯度筛选法：制备固体营养培养基平板，培养皿一半不含镉，一半含有一定浓度梯度的镉。将以上分离在双层平板上单菌落的孢子用涂抹棒在平板上均匀涂抹，于30℃培养箱中培养，让其充分生长，然后挑选含镉平板部分生长旺盛的菌株，将这些菌落移接到斜面培养基中。

[0021] 复筛

[0022] 摇瓶发酵复筛：对第一次诱变成功的能耐受镉的初筛菌和出发菌进行预培养。将6
菌落数为1×10 个/ml的初筛菌1mL接种于100mL的液体培养基中，接种两份，一份含镉，另一份不含镉。分别放入250mL三角瓶中，200r/min振荡培养。在分光光度计上测定两份摇瓶中微生物的OD600值，计算镉对初筛菌的致死率，其中致死率＝(ODck-ODcd)/ODck，ODck代表菌株在不含镉培养基中的OD600值，ODcd代表菌株在含镉培养基中的OD600值。按照上述步骤将出发菌接种后，也进行摇瓶培养10小时后，计算镉对出发菌的致死率。比较初筛菌和出发菌的致死率大小，挑选致死率小于出发菌的初筛菌，即为高效耐镉菌。

[0023] 第五步：递推式多次融合

[0024] 将第四步得到的稳定性良好的耐镉菌株重复第三步和第四步的方法处理，进行第二次融合以及第三次融合，获得了抗镉性能大幅度提高的F185和F178融合菌。

[0025] 本发明所用的作为出发菌株的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌，购买自国家普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)，现均为南开大学环境科学与工程学院菌种室保藏菌种。

[0026] 本发明所用的融菌酶和蜗牛酶均购买自北京经科宏达生物技术公司。

[0027] 本发明所用的高渗溶液配制的40％PEG溶液中PEG 6000购自中国医药集团上海化学试剂公司。

具体实施方式

[0028] 为了对本发明有充分明确的理解。现结合实施例对本发明作进一步说明。

[0029] 第一步：培养菌种初级诱变

[0030] 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis或者热带假丝酵母菌Candida tropicalis接种于菌种斜面培养基中，在30℃下培养一段时间后，加入适量的磷酸缓冲液，制备悬浮孢6
子，使孢子量在1×10 个/mL。

[0031] 第二步：菌株诱变

[0032] 诱变处理如下：取5mL热带假丝酵母菌孢子悬液转移至灭菌培养皿中，于15W紫外线灯下照射5min；取5mL枯草芽孢杆菌孢子悬液照射1min和5min；取5mL热带假丝酵母菌孢子悬液于终浓度为0.1mol/L的亚硝酸溶液处理10min；取5mL枯草芽孢杆菌孢子悬液于终浓度为0.1mol/L的亚硝酸溶液处理10min和20min。

[0033] 将上述处理后孢子悬液稀释，取一定稀释度，涂布于含镉浓度梯度培养基平板上，30℃培养约24h，肉眼可见微小菌落，进行初筛。将初筛突变菌接种至斜面中，进行摇瓶发酵复筛，获得抗镉性能较高的突变菌C14，C44，B42，B41，B310和B65。

[0034] 第三步：基因组改组

[0035] 制作由菌种诱变得到的抗镉突变株C14，C44，B42，B41，B310和B65的斜面，30℃6
下培养一段时间。加入适量的磷酸缓冲液，制备悬浮抱子，使饱子量在1×10 个/mL。

[0036] 第四步：筛选

[0037] 倒新鲜菌丝生长培养基于数个9cm培养皿中，将孢子悬液(一定的稀释度)分别涂布其上，突变菌在30℃培养24h。

[0038] 置于盛有DTT溶液的培养皿中(4mL/皿)室温预处理0.5h。

[0039] 将6株菌种的菌丝混合后转移到盛有酶液的培养皿(4mL酶液/皿)中，室温处理2h。从0.5h起每隔0.5h用显微镜观察原生质体的形成。

[0040] 当大部分细胞转化成球形的原生质体时，3500r/min离心约10min，弃去上清液，终止酶解，用高渗磷酸缓冲液洗涤2次，重新将原生质体悬浮于高渗磷酸缓冲液中。

[0041] 倒入含2％琼脂的高渗再生培养基10mL于培养基下层，将含0.8％琼脂的高渗再生培养基置于50℃的水浴中保温，保证其温度为50℃。

[0042] 用PEG和微量移液器将离心管中的每株原生质体沉淀洗至灭菌培养皿。洗涤时就-1 -7开始计时，共30min后以9mL高渗液稀释PEG处理的原生质体液，稀释10 -10 共7个梯度。

[0043] 先向已凝固的含2％琼脂的下层培养基上加入0.1mL稀释液(滴加10-3-10-7共5个稀释度的稀释液，每个稀释度至少倒10皿，再向每皿倒入6mL含0.8％琼脂的上层培养基，迅速在台面上摇开，使上层培养基和稀释液混匀。将培养皿正置30℃培养。

[0044] 筛选

[0045] 制备固体营养培养基平板，培养皿一半不含镉，一半含有一定浓度梯度的镉。将以上分离在双层平板上单菌落的孢子用涂抹棒在平板上均匀涂抹，于30℃培养箱中培养，让其充分生长，然后挑选含镉平板部分生长旺盛的菌株，将这些菌落移接到斜面培养基中。

[0046] 对第一次诱变成功的能耐受镉的初筛菌和出发菌进行预培养。将菌落数为1×106