一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法转让专利
申请号 : CN201010502030.4
文献号 : CN101955933B
文献日 : 2012-08-08
发明人 : 孙叶芳 , 郑琪 , 赵虎 , 黄岳夫 , 林国梅 , 邢海
申请人 : 孙叶芳 , 郑琪 , 赵虎 , 黄岳夫 , 林国梅 , 邢海
摘要 :
本发明涉及一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法，属于生物技术领域。春兰梅瓣的分子标记DNA片段大小为550kp，特异性PCR扩增引物序列为ACACACACACACACACCTT。方法包括步骤：梅瓣春兰资源的收集，基因组DNA的提取；特异PCR扩增引物的获得；ISSR-PCR扩增产物的获得；电泳检测。本发明的分子特异标记可应用于梅瓣春兰的快速鉴定。
权利要求 :
1.一种春兰梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；
(2)春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSR-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT；
2+
(3)ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得：扩增总体积为20μl，含Mg 的10×PCR buffer 2.0μl，10mmol/L dNTP 0.4μl，2.5U/μl TaqDNA聚合酶0.3μl，10u mol/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT 2μl，基因组DNA 1μl，ddH2O 14.3μl；PCR反应条件：94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38个循环；72℃7min；
(4)电泳检测：取上述PCR扩增产物2μl，与1μl上样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于1×TBE缓冲液中，8V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550bp大小的特异片段，而其他普通春兰均未见该特异性片段。
2.如权利要求1所述的一种春兰梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/μl，-20℃冰箱贮藏备用。
说明书 :
一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 二千三百年前就有越王勾践种兰渚山可谓全国最早，三百多年来共选育出春兰品种400多个可谓全国最多，百余年来誉满神州的春兰“四大天王”-宋梅、集圆、龙字、万字均出自浙江。浙江自1645年以来，共选育出春兰品种600多个，仅绍兴地区选育和栽培的春兰品种就有430多个；品种之多为全国之最。改革开放后，兰花在绍兴市，特别在绍兴县成了农民发家致富的一条捷径，兰花产业不断发展壮大。目前，仅绍兴县兰花产业从业者达2500多人，兰花种植面积2000多亩，兰花产业年产值达1亿元以上。文人雅士玩赏的小小兰花，如今在浙江绍兴县却成了百万乃至千万富翁的“生产线”。在这个县有1500多农户长年从事兰花的收集、驯化和培育。目前，至少有20多户农民因种植兰花而资产逾千万元。
[0003] 近几年来，随着我省经济的长足发展，人民生活水平的不断提高，兰花交流营运也得到不断升温。如绍兴地区养兰户每年以15％以上的速度递增。目前我省已基本形成一个普遍养兰的氛围。从2000年至2006年我省兰花交易形势上看，兰花产业正成为我省人民致富的一条捷径，正成为我省可持续发展的特色优势产业。同时我省兰花产业也面临着诸多被动因素，严重影响着该产业的健康发展。
[0004] 兰花是大自然赋予我们的宝贵自然资源，也是我省宝贵的自然资源和经济资源，近年来，由于兰花价格的持续上升，一些地区对野生兰花的采挖比较混乱。目前江浙两省每年的下山兰草很少，野生兰花资源已遭很大程度的破坏，许多山区已经到了乱挖、滥采的地步，目前已无下山草可挖，所以兰展上已很难找到一些带有香味的浙江下山春兰。我国为避免此类现象的发生，除利用法律、法规措施禁止人为破坏和掠夺兰花野生资源，更重要的是利用现有的兰花资源，加强新品种的培育和栽培管理技术的研究，利用现有的种质资源以兰养兰、以兰扩兰，既有效地保护兰花自然资源，又满足养兰爱好者的需要。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了能对春兰梅瓣品种进行简便、快速、准确的鉴定和检测，提供了一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
[0007] 一种春兰梅瓣品种的分子特异标记，采用特异性ISSR-PCR扩增引物对春兰普通品种与梅瓣基因进行扩增，得到大小为550bp的DNA片段即为所述的分子特异标记。
[0008] 一种春兰梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，包括如下步骤：
[0009] (1)春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；
[0010] (2)春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSR-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT；
[0011] (3)ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得：扩增总体积为20uL，10×PCR2+
buffer(含mg )2.0uL，10mmol/L dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)0.4uL，2.5U/uL TaqDNA聚合酶0.3uL，10u mol/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT 2uL，基因组DNA 1uL，ddH2O(重蒸水)14.3uL；PCR反应条件：94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38个循环；72℃7min；
buffer(含mg )2.0uL，10mmol/L dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)0.4uL，2.5U/uL TaqDNA聚合酶0.3uL，10u mol/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT 2uL，基因组DNA 1uL，ddH2O(重蒸水)14.3uL；PCR反应条件：94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38个循环；72℃7min；
[0012] (4)电泳检测：取上述PCR扩增产物2uL，与1uL上样缓冲液(6×loading buffer)混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于1×TBE缓冲液中，8V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB(溴化乙锭)染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550bp大小的特异片段，而其他普通春兰均未见特异性片段。
[0013] 所述步骤(1)中，用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/uL，-20℃冰箱贮藏备用。
[0014] 根据采用这一个特殊引物进行PCR扩增，以能否产生550bpDNA片段作为对梅瓣春兰进行鉴定和检测的依据。
[0015] 该检测方法与传统的辨别梅瓣春兰的方法相比，具有更强的操作性，传统的方法须等开花之后通过花瓣的花型特征来判定，而该检测方法在春兰幼苗时通过嫩叶即可进行检测，检测时间短，准确性高。
[0016] 以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
[0017] 图1为梅瓣春兰专用检测引物对春兰进行ISSR-PCR扩增结果。图中梅瓣春兰(天兴，万字，瑞梅，宋梅，冠姚和贺梅)均能扩增出分子量约为550bp的特殊DNA条带，而普通春兰(普1，普2和普3)则没有。
具体实施方式
[0018] 下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受以下实施例所限定。
[0019] 实施例1
[0020] (1)春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；其中，基因组DNA的提取具体为：用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/uL，-20℃冰箱贮藏备用。
[0021] (2)春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSR-PCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT。
[0022] (3)ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得：扩增总体积为20uL，10×PCR2+
buffer(含mg )2.0uL，10mmol/L dNTP 0.4uL，2.5U/uLTaqDNA聚合酶0.3uL，10u mol/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT 2uL，基因组DNA 1uL，ddH2O 14.3uL；PCR反应条件：
94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38个循环72℃7min。
buffer(含mg )2.0uL，10mmol/L dNTP 0.4uL，2.5U/uLTaqDNA聚合酶0.3uL，10u mol/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT 2uL，基因组DNA 1uL，ddH2O 14.3uL；PCR反应条件：
94℃3min；94℃45sec，51℃45sec，72℃90sec，38个循环72℃7min。
[0023] (4)电泳检测：取上述PCR扩增产物2uL，与1uL上样缓冲液混匀，点样于1％的琼脂糖凝胶上，于1×TBE缓冲液中，8V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550bp大小的特异片段，而其他普通春兰均未见特异性片段。
[0024] (5)对9个春兰品种进行ISSR扩增，其中3个普通品种，6个梅瓣品种。6个梅瓣品种均能扩增出专一的ISSR标记。
[0025] 上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。