本发明属遗传工程技术领域，具体为猪干扰素家族基因及其作为抗猪蓝耳病药物及疫苗佐剂的应用。所述猪干扰素基因是从家猪基因组中调取获得，具有抗病毒作用，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，或SEQ ID NO.9；涉及的药物和疫苗佐剂是将家猪干扰素基因利用分子生物学技术克隆入真核表达载体获得的重组质粒及将该质粒转入猪霍乱沙门氏菌弱毒株而获得活菌苗。动物实验证明，该药物和佐剂安全性好，效果显著。直接注射家猪后当天攻毒，保护率可达80％。佐剂与蓝耳病灭活疫苗联用，一次免疫注射家猪后28天攻毒，保护率可达80％。
1.从家猪基因组中分离到的干扰素基因家族，其特征在于所述家猪干扰素基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，或SEQ IDNO.9；其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8，SEQ IDNO.10。
2.一种如权利要求1所述的从家猪基因组中分离到的干扰素基因家族作为抗猪病毒药物和佐剂抗病毒药物和佐剂的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述猪病毒为猪蓝耳病病毒，猪口蹄疫病毒，猪流感病毒，或猪圆环病毒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于将所述干扰素基因家族中的一种或任意几种，利用分子生物学技术克隆入真核表达载体，获得重组质粒；所述真核表达载体是具有真核启动子，原核复制子或原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于由所述的重组质粒单独使用，或由任一具辅助质粒进入真核细胞作用的试剂配合使用，促使质粒进入动物体。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于由所述的重组质转入猪霍乱沙门氏菌弱毒株或其他沙门氏菌弱毒株，或将所述家猪干扰素基因与任一病毒载体相连，获得的活菌苗或活疫苗。
7.一种抗猪病毒药物或佐剂，其特征在于是将家猪干扰素基因利用分子生物学技术克隆入真核表达载体获得的重组质粒，其中家猪干扰素基因是指编码的氨基酸序列为SEQID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，或SEQ ID NO.9；其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10，所述真核表达载体是具有真核启动子，原核复制子或原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。
8.根据权利要求7所述的抗猪病毒药物或佐剂，其特征在于所述猪病毒为猪蓝耳病病毒，猪口蹄疫病毒，猪流感病毒，或猪圆环病毒。
9.一种如权利要求7所述的抗猪病毒药物或佐剂的制备方法，包括基因制备、重组、蛋白活性测定及表达载体质粒的大规模抽提，其特征在于具体步骤如下：(1)通过PCR的方法从家猪家猪肝脏基因组DNA中得到家猪新型干扰素完整基因；
(2)将上述基因插入原核克隆载体，并转化大肠杆菌，测序后确定获得了正确的基因；
(3)将上述基因插入真核表达载体获得重组质粒，并转化大肠杆菌，抽提质粒转染MARK-145细胞，用猪蓝耳病病攻击已转染的细胞，观察保护情况，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪新型干扰素蛋白；
(4)阳性菌株在37℃发酵培养10-15小时，收集菌体；破碎菌体并大规模制备重组质粒，与质粒携带剂混合溶于生理盐水，稀释至合适浓度，即配制得基因工程药物和疫苗佐剂；
或者将步骤(3)中所得的真核表达载体转化入猪霍乱沙门氏菌弱毒株，阳性菌株在
37℃发酵培养10-15小时，收集菌体，利用生理盐水稀释质粒到合适的浓度，即配制得基因工程药物和灭活疫苗佐剂。
10.如权利要求7所述的抗猪病毒药物或佐剂的应用，其特征在于是该药物单独作用，以任一携带方式进入动物体内作用，或与任意蓝耳病疫苗或任意其他药物联合作用，用于预防和治疗猪蓝耳病。
猪干扰素基因家族及其作为抗猪蓝耳病药物及疫苗佐剂的
应用
技术领域
[0001] 本发明属遗传工程技术领域，具体涉及一种新的猪干扰素基因家族及其作为抗猪蓝耳病药物及疫苗佐剂的应用。
背景技术
[0002] 猪I型干扰素有数种型，每一型内又各有一组多基因家族，它们是具有抗病毒作用的细胞因子家族。在正常生理条件下，它们在动物体内不表达或有少量组成型表达。在机体被病毒感染时，它们不但有抗病毒作用，还可以上调机体的免疫反应，达到清除病毒的作用。研究表明，I型干扰素还可以激活B细胞并辅助B细胞快速产生针对病原的抗体；促进大多数细胞MHC-I类抗原的表达，诱导NK细胞及T细胞的增殖并增加其细胞毒活性；辅助+CD8 记忆T细胞的生长，延长记忆T细胞的生存时间；并且对IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-6，TNF-α等免疫刺激细胞因子具有表达上调作用。因此和疫苗联合使用，具有佐剂功能。由于此基因来源于猪本身，其安全性较为可靠。故我们利用其抗病毒和免疫增强的双重作用，尝试用其做为抗猪蓝耳病药物和疫苗佐剂。
[0003] 蓝耳病又称繁殖与呼吸综合症(reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，其危害已几乎遍极世界所有养猪国家。特别是近几年PRRS高致病性变异毒株在我国的暴发流行，具有高发病率、高死亡率和低治愈率的流行特点使我国养猪业面临着巨大的疫病风险。
[0004] 目前使用的蓝耳病疫苗有弱毒苗和灭活苗两种。其中弱毒苗的免疫原性较强，对猪具有一定的保护能力，但是弱毒苗可能出现回复突变，使弱毒转换为强毒，因此安全性存在问题。研究表明：弱毒疫苗的毒株可以在猪群中传播，导致未免疫的猪出现繁殖障碍等蓝耳病症状。至今国内外已研究制备多种灭活疫苗，但是现有报告说明，灭活苗的免疫原性都较差，对免疫猪只的保护效果很低。由于灭活苗安全性好，因此通过各种途径，增强灭活疫苗的保护能力是当前抗猪蓝耳病研究的重大任务。为此将灭活苗和各类细胞因子共同使用，试图提高灭活苗的免疫原性是一条切实可行的研究途径。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种安全性好的新的猪干扰素基因家族及其应用。
[0006] 本发明提供的猪干扰素基因家族是在猪基因组中新分离得到的，前人尚未分离获得过，共5条基因，其氨基酸序列依次为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.9；其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10。研究表明他们属于I型干扰素，具有抗病毒作用。
[0007] 本发明所述的从家猪基因组中分离到的干扰素基因家族可以用于制备抗猪病毒药物和佐剂。
[0008] 所述猪病毒为猪蓝耳病病毒，猪口蹄疫病毒，猪流感病毒，或猪圆环病毒等。
[0009] 具体可以将所述干扰素基因利用分子生物学技术克隆入真核表达载体，获得重组质粒；所述真核表达载体是具有真核启动子，原核复制子或原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。
[0010] 所述的重组质粒可以单独使用，也可以由任一具辅助质粒进入真核细胞作用的试剂配合使用，促使质粒进入动物体。
[0011] 或者由所述的重组质转入猪霍乱沙门氏菌弱毒株或其他沙门氏菌弱毒株，或将所述家猪干扰素基因与与重组腺病毒，慢病毒等任一病毒载体相连，获得的活菌苗或活疫苗。
[0012] 本发明还提供一种用所述家猪基因组中分离到的干扰素基因家族制备的抗猪病毒药物和佐剂。所述猪病毒包括猪蓝耳病病毒，猪口蹄疫病毒，猪流感病毒，或猪圆环病毒等。
[0013] 本发明尤其提供一种以家猪干扰素基因为基础制备的蓝耳病药物和蓝耳病疫苗佐剂，及其制备方法。并将该药物和佐剂应用于动物体评估其效果。
[0014] 本发明提出的家猪新型干扰素具有抗蓝耳病病毒作用。实施例中，SEQ ID NO.1，SEQID NO.2所表达干扰素在MARK-145细胞上抗PRRSV病毒的作用比猪IFN-α高5-10倍。在猪体内可以抵抗PRRSV病毒的攻击，保护率达80％。本发明提出此类新干扰素可以作为抗猪蓝耳病药物和灭活疫苗佐剂，可以增强灭活苗的免疫保护效果，免疫猪保护率达到
80％。
[0015] 本发明提出的蓝耳病药物和疫苗佐剂，是由家猪新型干扰素基因家族中一种或任意几种，通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。及由猪霍乱沙门氏菌弱毒株携带上述重组质粒获得的活菌苗。其中，家猪新型干扰素基因是指其氨基酸序列为SEQID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7，或SEQ ID NO.9；其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.10。真核表达载体是指具有真核启动子，原核复制子以及原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。
[0016] 该蓝耳病药物和蓝耳病疫苗佐剂，是在真核表达载体的基础上构建而成。DNA真核表达载体可以是具有以下特征的任一种真核表达载体：
[0017] (1)构建该真核表达质粒所用的真核表达载体同时带有原核复制子；
[0018] (2)该质粒带有真核启动子；
[0019] (3)该质粒具有原核选择抗性基因及合适的多克隆位点，便于基因插入及筛选。
[0020] 本发明所应用的真核表达载体具体是具有真核启动子，原核复制子以及原核抗性基因为特征的任一种DNA表达载体。实施例中使用的pcDNA真核表达质粒(Invitrogen公司产品)，在带有SV40复制子和CMV启动子的同时带有pUC ori复制子和amp抗性基因。除pcDNA以外，其他系列具有该特征的真核表达载体均可以用作佐剂的构建。
[0021] 实施例中我们用抗病毒效果最好的SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所编码基因。通过PCR的方法从家猪肝脏基因组DNA中得到包括22个氨基酸的信号肽并且全长为171个氨基酸的家猪新型干扰素完整基因，以Kpn I和Age I为酶切位点插入表达载体pcDNA4，并转化入大肠杆菌或猪沙门氏菌弱毒株中。
[0022] 本发明的抗病毒药物及佐剂制作方法包括基因制备、重组、转染、蛋白活性测定、质粒大规模抽提、菌体大规模制备等步骤，具体如下：
[0023] (1)通过PCR的方法从家猪家猪肝脏基因组DNA中得到家猪新型干扰素完整基因，在实施例中，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
[0024] (2)将上述基因插入原核克隆载体，并转化大肠杆菌，测序后确定获得了正确的基因；
[0025] (3)上述基因插入真核表达载体获得重组质粒，并转化大肠杆菌，测序验证所得重组质粒插入基因及读码框正确。抽提质粒转染MARK-145细胞，转染24小时后用猪蓝耳病病毒(猪繁殖与呼吸综合症病毒)攻击已转染的细胞，观察保护情况，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪新型干扰素蛋白。
[0026] (4)阳性菌株在37℃发酵培养10-15小时，收集菌体；破碎菌体并大规模制备重组质粒，与质粒携带剂混合溶于生理盐水，稀释至合适浓度，配制得本发明所述的基因工程药物和疫苗佐剂。在实施例中，所用质粒携带剂为PEI(polyethylenimine，Polysciences公司)。
[0027] 或者将步骤(3)中所得的真核表达质粒转化入猪霍乱沙门氏菌弱毒株，阳性菌株在37℃发酵培养10-15小时，收集菌体，利用生理盐水稀释质粒到合适的浓度，配制得本发明所述的基因工程药物和疫苗佐剂。
[0028] 本发明还涉及所述药物和佐剂的应用和应用方法，具体是将其单独或与蓝耳病灭活疫苗联合注射动物。本发明涉及的药物其优点在于对被蓝耳病病毒攻击的动物具有保护作用。本发明涉及的佐剂其优点在于能有效辅助疫苗刺激动物体免疫应答，提高蓝耳病疫苗的保护效果。
[0029] 本发明涉及的家猪新型干扰素为具有抗病毒和免疫刺激作用的细胞因子，不仅可以直接利用重组质粒，转入猪减毒沙门氏菌中，还可以与重组腺病毒，慢病毒等载体相连做为药物和疫苗佐剂。由于家猪已知干扰素和本项新型干扰素抗病毒和刺激免疫具有广谱性，因此本发明提出的药物和佐剂不仅可以用于猪蓝耳病的治疗和预防，还可以用于做为口蹄疫，猪流感，猪圆环病毒等任一动物病毒性疾病的药物及疫苗佐剂。
[0030] 本发明中使用猪减毒沙门氏菌做为携带剂携带动物细胞因子做为动物药物或疫苗佐剂，其优点在于：制备方便，成本较低，可以直接用发酵冻干处理后的菌体作为注射制剂。由于该菌株已作为标准疫苗株广泛使用，安全性也有保障；作为活菌苗的持续表达和缓释作用，可以延长细胞因子在动物体内存留和作用时间。
[0031] 对本发明提出的猪蓝耳病药物和疫苗佐剂进行效力检验。以一定量的猪新型干扰素质粒注射动物的同时攻毒；或以沙门氏菌携带猪新型干扰素质粒作为佐剂配合蓝耳病灭活疫苗使用，28天后攻毒，均可达到80％的保护率(见表1)。且这两组的存活动物没有病毒血症，说明没有病毒残余。
具体实施方式
[0032] 下面以本发明涉及的猪蓝耳病药物和疫苗佐剂单独使用，及与猪蓝耳病灭活疫苗联用抗猪高致病性蓝耳病江西A1株为例进一步具体描述本发明。
[0033] 药物与佐剂中猪新型干扰素质粒的构建过程。取得家猪肝脏样品并抽提其基因组，通过PCR方法获得包括22个氨基酸的信号肽并且全长为171个氨基酸的家猪新型干扰素完整基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。将上述基因插入原核克隆载体pMD-19T(TaKaRa公司产品)，并转化大肠杆菌DH5-α，挑选阳性克隆，测序后确定获得了正确的基因。将上述基因以Kpn I和Age I为酶切位点插入表达载体pcDNA4(Invitrogen公司产品)，并转化大肠杆菌，获得的阳性克隆命名为p-IFN。抽提p-IFN质粒转染MARK-145细胞，转染24小时后用猪蓝耳病病毒(猪繁殖与呼吸综合症病毒)攻击已转染的细胞，观察保护情况，确定构建的重组质粒可以表达活性的家猪新型干扰素蛋白。
[0034] 将p-IFN以LB培养液为发酵液，37℃培养过夜并收集菌体，以碱裂解法大规模抽提质粒DNA。将得到的质粒与PEI(polyethylenimine，Polysciences公司)以1mg∶3mg混合溶于生理盐水，并用生理盐水稀释配置成1mg质粒/ml通过0.22μm滤膜去除不溶物。即可获得所述药物。
[0035] 将p-IFN质粒转化猪沙门氏菌弱毒株，经鉴定后所得阳性克隆命名为scho-p-IFN。将scho-p-IFN以LB培养液为发酵液，37℃培养过夜并收集菌体。经梯度稀9
释，菌落计数后，将菌体用生理盐水配置成10(个)/ml，即可获得所述佐剂。
[0036] 最后将上述药物以2mg/头份注射动物，同时用3×105TCID50的病毒量的猪高致病9
性蓝耳病江西A1株攻击动物。将上述佐剂10(个)菌体/头份与猪蓝耳病灭活苗同时注
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射动物，28天后用3×10TCID50的病毒量的猪高致病性蓝耳病江西A1株攻击动物。有关动物保护情况的检测结果见表1。
[0037] 表1猪蓝耳病药物，佐剂和疫苗联用保护效果
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